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专题1 基因工程 1.2 基因工程的基本操作程序——目的基因的获取、基因表达载体的构建一、选择题1．2014·福州八县市高二期中]下列有关基因工程操作顺序的组合中，正确的一组是( )①目的基因的检测与鉴定②基因表达载体的构建③将目的基因导入受体细胞④目的基因的获取A．①②③④B．④③②①C．④②③①D．③④②①解析：基因工程操作的一般顺序为：目的基因的获取，基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
答案：C2．PCR技术扩增DNA，需要的条件是( )①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④耐高温的DNA聚合酶⑤mRNA ⑥核糖体⑦能量A．②③④⑤⑥B．①③④⑦C．①②③⑤⑥D．①②③④⑦解析：PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，条件是有一段已知的目的基因的核苷酸序列和根据核苷酸序列合成的引物，原料是四种脱氧核苷酸，也需要多种酶，如DNA聚合酶。
答案：D3．下图中甲、乙表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是( )A．甲方法可建立该细菌的基因组文库B．乙方法可建立该细菌的cDNA文库C．甲方法要以脱氧核苷酸为原料D．乙方法需要反转录酶参与解析：甲方法是从细菌的DNA中直接提取，故可以建立该细菌的基因组文库。
乙方法是由mRNA反转录形成目的基因，故可以建立该细菌的cDNA文库。
乙方法要以脱氧核苷酸为原料，且需要反转录酶参与。
答案：C4．下列不属于获取目的基因方法的是( )A．利用DNA连接酶复制目的基因B．利用DNA聚合酶复制目的基因C．从基因文库中获取目的基因D．利用PCR技术扩增目的基因解析：本题考查目的基因的获取方法及DNA聚合酶和DNA连接酶的区别。
对目的基因(DNA片段)进行复制利用的是DNA聚合酶而不是连接酶，DNA连接酶是将DNA片段连接所使用的酶，DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸连接成一条链所使用的酶。
答案：A5．2014·江苏高考改编]下列关于基因工程技术的叙述，正确的是( )A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列B．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达解析：本题考查基因工程中基本工具及其操作程序的相关知识，意在考查考生运用所学知识进行分析判断的能力。
2010寒假生物预习学案—————————————②1.2 基因工程的基本操作程序制作人：王军审阅人：任金龙魏巍 2010-2-2 班级：__________ 小组:____________ 姓名：_____________学习目标：①写出基因工程的四个操作步骤。
②解释基因文库、基因组文库、部分基因文库的区别与联系。
③分析基因工程四个步骤的原理、工具及具体的操作程序。
学习过程：基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：、、、。
(一) 目的基因的获取获取目的基因的方法：(1)从中获取目的基因：①基因文库：将含有某种生物的许多DNA片段，导入受体菌的中储存，各个受体菌分别含有这种生物的，称为基因文库。
基因文库可大可小，如果它包含了一种生物所有的基因，就叫；如果它只包含一种生物的一部分基因，就叫，如。
②具体方法：可根据基因的序列、基因的、基因在上的位置、基因的转录产物以及基因翻译产物等特性来获取目的基因。
(2)利用扩增目的基因：原理：前提：过程：(二)基因表达载体的构建（基因工程的核心）(1)目的：(2)组成：①启动子：是一段有特殊结构的，位于基因的，是识别和结合的部位，能驱动基因，最终获得所需的。
②终止子：也是一段有特殊结构的，位于基因的。
③标记基因的作用：；常用的标记基因是。
(三)将目的基因导入受体细胞(1)转化的概念：(2)常用的转化方法：①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是，其次还有和等。
②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是。
此方法的受体细胞是。
③将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是，最常用的原核细胞是，其转化方法是：先用处理细胞，使其成为，再将溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
(四)目的基因的检测与鉴定(1)首先要检测，方法是采用。
(2)其次还要检测，方法是采用。
(3)最后检测，方法是从转基因生物中提取，用相应的进行杂交。
1.2基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取（三种方法）1.从基因文库中获取：（1）分类：①基因组文库：含有某种生物的全部基因；② cDNA文库：含有某种生物的部分基因（2）基因文库的构建过程：略（课本P10；注意两种文库的区别）2.PCR技术扩增目的基因（1）概念：短时间内在体外大量复制DNA的技术。
（2）原理：DNA双链复制（3）条件：模板、Taq酶、引物（单链DNA片段，能与模板链互补配对）、4种脱氧核苷酸（4）过程：变性→退火→延伸3.通过DNA合成仪用化学方法人工合成：目的基因比较小，核苷酸序列已知第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在和表达，并且可以遗传给下一代2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因（+复制原点）（1）启动子（RNA聚合酶结合位点）：位于基因的首端，能驱动基因转录出mRNA（2）终止子：位于基因的尾端，终止转录①启动子和终止子位于DNA上；起始密码子和终止密码子位于mRNA上②真核生物的基因结构非编码区：不能转录出mRNA,但能调控基因的表达（含有启动子和终止子）基因外显子：转录出的mRNA能翻译出蛋白质编码区（原核生物的基因无外显子和内含子之分）（能转录形成mRNA）内含子：转录出的mRNA不能翻译出蛋白质（加工时被剪切）第三步：将目的基因导入受体细胞1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程2.常用的转化方法：①导入植物细胞：主要是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等农杆菌能感染双子叶植物和裸子植物（植物受损伤时，伤口处细胞分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞），农杆菌中Ti质粒的T-DNA能转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上②导入动物细胞：最常用的方法：显微注射技术。
受体细胞：受精卵③导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少最常用的原核细胞是大肠杆菌，方法：感受态法（Ca2+处理法，增强细胞壁的通透性）第四步：目的基因的检测与鉴定目的基因是否成功导入：DNA分子杂交技术（用到基因探针）分子水平目的基因是否成功转录出mRNA：分子杂交技术（从细胞中提取mRNA，用检测基因探针与其杂交，观察是否形成杂交带）目的基因是否成功翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术个体生物学水平鉴定：做抗虫、抗病接种实验；或将植物移栽至盐碱地；功能活性对比①基因探针：用放射性同位素标记含有目的基因的（单链）DNA片段②转基因实验成功的标志：成功表达出相关蛋白质和性状。
学习目标1.简述基因工程原理及基本操作程序。
2.尝试设计某一转基因生物的研制过程。
同步学案1.基因操作的基本步骤（1）提取目的基因：目的基因就是人们所需要的基因。
提取途径：a.鸟枪法：从供体细胞的DNA中直接分离基因，工具是，优点是，缺点是，具有一定的。
b.人工合成法:两个途径：一是反转录法，就是目的基因转录成的做模板,形成单链DNA，再合成；二是反推法,就是以已知的序列，推出序列，再推出序列，然后人工合成。
【答案】特定、限制性内切酶、简便、工作量大、盲目性、mRNA、反转录、双链DNA、氨基酸、mRNA、基因碱基2.例：生物学家通过基因工程培育出了能够通过乳房生物反应器生产人的血清蛋白（1）“分子手术刀”，（2）“分子缝合针”，（3）“分子运输车”。
（4）操作步骤：从人的获取目的基因；目的基因与结合构建基因表达载体；在基因表达载体中还应插入和终止子。
然后把基因表达载体导入牛的，通过发育形成的牛体细胞含人的，成熟的牛产的的奶中含有，证明基因操作成功。
【答案】（1）限制性内切酶（或限制酶）（2）DNA连接酶（3）基因进入受体细胞的载体（4）基因组文库、载体、启动子、受精卵、血清蛋白基因、人的血清蛋白。
3.根据基因工程中的操作步骤，回答以下问题：目的基因能与运载体结合，说明，目的基因能在受体细胞中得到表达，说明，受体细胞具备的条件是。
如何检验质粒是否导入受体细胞？。
如何检测目的基因是否得到表达？。
【答案】DNA组成成分相同，都遵循碱基互补配对原则、所有生物公用一套遗传密码、没有与运载体相同的质粒或没有与运载体质粒相同的标记基因、检测质粒的标记基因、检测是否出现目的基因所控制的性状4.基因工程的特点：（1）它是一种按照人们意愿，定向改造生物的技术。
（2）在DNA上进行操作。
（3）是在体外进行的人为的。
（4）一旦成功，便可。
（5）主要技术是技术和技术。
【答案】遗传特性、分子水平、基因重组、遗传、体外DNA重组、转基因知识与技能1.提取目的基因的方法（1）直接分离法：常用方法－鸟枪法（散弹射击法）（2）人工合成法：有两条途径，一个反转录酶法，二是据已知的氨基酸序列逆推合成。
比较不同方法的优缺点和适用范围。
①基因文库——将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
基因文库根据其大小可分为基因组文库和部分基因文库。
受体细胞是指接受目的基因的细胞，即表达载体导入的细胞。
基因工程常用的受体有细菌、真菌、动植物细胞②PCR技术扩增目的基因原理：DNA复制做法：已知一段目的基因的核苷酸序列→据已知序列合成引物→DNA扩增结果：扩增出许多结构相同的目的基因。
2.目的基因与运载体结合（1）含义：是不同来源的DNA重新组合的过程。
（2）过程：同种限制酶切割质粒和目的基因；结合形成重组DNA分子（重组质粒）。
①构建表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因③所选运载体应具备的条件：a.载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。
这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。
b.载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。
c.载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。
d.载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。
e.载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
3.将目的基因导入受体细胞（1）转化——目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。
（2）基因工程中常用的受体细胞有：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞。
（3）将目的基因导入受体细胞的方法：根据受体和运载体的类型不同，所采用的导入方法也不同。
目前常用的方法有：①将目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法，还有基因枪法和花粉管通道法。
②将目的基因导入动物细胞——显微注射技术。
③将目的基因导入微生物细胞——Ca2＋处理细胞法。
4.目的基因的检测和表达（进行比较）（1）检测对象：①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质（2）检测方法：分子检测法——①和②都是DNA 分子杂交技术，③抗原－抗体杂交法形态检测法——可根据目标性状的有无来判断目的基因是否表达5.人工合成目的基因的过程①目的基因转录成的mRNA 单链DNA 双链DNA （目的基因）②蛋白质中氨基酸的序列mRNA 中的碱基序列推测DNA 碱基序列目的基因目的基因逆转录合成碱基互补配对合成推测化学方法合成典例精析例1在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需要用（）A.同种限制酶B.两种限制酶C.同种连接酶D.两种连接酶【解析】基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段时，切口的黏性末端必须相同，因此，必须使用同种限制酶。
【答案】A变式练习1在胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，下列哪组是所需要的( )①同一种限制酶切割两者②不需同一种限制酶切割两者③加入适量的DNA连接酶④不需加DNA连接酶A.①③B.①④C.②④D.②③【答案】A例2基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。
在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的是（）A.人工合成目的基因B.目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达【解析】合成目的基因及其与运载体的结合都有碱基互补配对；目的基因的检测实质是标记基因的表达，也有碱基互补配对，目的基因的表达即转录和翻译过程，通过碱基互补配对来实现。
将目的基因导入受体细胞则不进行碱基互补配对。
【答案】C变式练习2下列黏性末端属于同一种限制酶切割而成的是（）A.①②B.①③C.①④D.②③【答案】B例3下图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”示意图，所用载体为质粒A。
已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒A导入细菌B后，其上的基因能得到表达。
请回答下列问题。
（1）人工合成目的基因的途径一般有哪两条？（2）如何将目的基因和质粒结合成重组质粒？（3）目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。
此外可以通过如下步骤鉴别得到的细菌是否导入了质粒A 或重组质粒：?将得到的细菌涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的就导入了质粒A或重组质粒，反之则没有。
使用这种方法鉴别的原因是。
（4）若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有四环素的培养基上培养，会发生的现象是，原因是。
（5）导入细菌B细胞中的目的基因成功表达的标志是什么？【解析】（1）①将从细胞中提取分离出的目的基因作为模板转录成mRNA 逆转录单链DNA按互补原则双链DNA；②据蛋白质中氨基酸序列推测出mRNA中碱基序列推测出DNA碱基序列通过化学方法合成目的基因。
（2）将目的基因和质粒结合形成重组质粒的过程是：①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有粘性末端的切口；②用同种限制酶切割目的基因，产生相同的粘性末端；③将切下的目的基因片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。
（3）检测质粒或重组质粒是否导入受体细胞，均需利用质粒上某些标记基因的特性。
即对已经做了导入处理的、本身无相应特性的受体细胞进行检测，根据受体细胞是否具有相应的特性来确定。
抗氨苄青霉素基因在质粒A80重组质粒上，因为目的基因插入了四环素抗性基因的a处，所以用含氨苄青霉素这种选择培养基培养经导入质粒处理的受体细胞。
凡能生长的则表明质粒导入成功；不能生长的则无质粒导入。
（4）抗四环素基因不仅在质粒A上，而且它的位置正是目的基因插入之处，因此当目的基因插入质粒A形成重组质粒时，此处的抗四环素基因的结构和功能就会被破坏，含重组质粒的受体细胞就不能在含四环素的培养基上生长，而质粒A上无目的基因插入的四环素基因结构是完整的，这种受体细胞就能在含四环素的培养基上生长。
（5）基因成功表达的标志是受体细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质，即人的生长激素。
答案（1）、（2）、（3）见解析。
（4）有的能生长，有的不能生长期导入普通质粒A的的细菌能生长，因为普通质粒A上有抗四环素基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目的基因插在四环素基因中，抗四环素基因中，抗四环素基因的结构被破坏。
（5）受体细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质，即人的生长激素。
