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抗菌肽的临床应用及应用前景4.1 抗菌肽的作用范围抗菌肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。
某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用。
4.1.1 抗菌肽对细菌的杀伤作用抗菌肽对革兰氏阴性及阳性细菌均有高效广谱的杀伤作用。
国内外已报道至少有113种以上的不同细菌均能被抗菌肽所杀灭。
4.1.2 抗菌肽对真菌的杀伤作用最先发现具有抗真菌作用的抗菌肽是从两栖动物蛙的皮肤中分离到的蛙皮素（Magainins），它不仅作用于C+、C-，对真菌及原虫亦有杀伤作用。
Defensins 是一种动物细胞内源性杀菌多肽，是从吞噬细胞中分离出来的，具有很宽的抗菌谱，对G+的杀伤作用大于对G-的杀伤作用，它也作用于真菌和部分真核细胞。
Cecropin A及其类似物如天蚕素——蜂毒素杂合肽对感染昆虫的真菌具有一定的杀伤作用。
4.1.3 抗菌肽对原虫的杀伤作用抗菌肽Magainins对原虫有杀伤作用。
实验证明抗菌肽可以杀死草履虫、变形虫和四膜虫。
柞蚕抗菌肽D对阴道毛滴虫亦有杀伤作用。
4.1.4 抗菌肽对病毒的杀伤作用Melitiin和Cecropins在亚毒性浓度下通过阻遏基因表达来抑制HIV-1病毒的增殖。
Magainin-2及合成肽Modelin1 和Moderln－5对疱疹病毒HSV－1和HSV－2有一定的抑制效果。
这些肽对病毒被膜直接起作用，而不是抑制病毒DNA的复制或基因表达。
4.1.5 抗菌肽对癌细胞的杀伤作用抗菌肽对正常哺乳动物细胞及昆虫细胞无不良影响，但对癌细胞株则有明显杀伤作用。
这种选择性机理可能与细胞骨架有关。
已有有关抗菌肽对宫颈癌细胞、直肠癌细胞及肝癌细胞的杀伤作用与剂量相关的效应的报道。
4.2 抗菌肽的临床应用4.2.1 在医药领域…此处省略,详情请见六鉴网()《抗菌肽市场调研报告》4.2.2 在转基因领域天然抗菌肽由于分子量小，直接从动植物组织中提取时，分离提纯存在一定的困难，合成肽价格昂贵。
《生物工程进展》1999,V ol.19,No.5昆虫抗菌肽的功能、作用机理与分子生物学研究最新进展赵东红 戴祝英 周开亚(南京师范大学生物系 南京 210097)昆虫虽然没有完善的免疫防御体系,但却具有高效的无细胞免疫系统。
抗菌肽是昆虫免疫后血淋巴中的一类抗菌多肽,它具有分子量小,热稳定,水溶性好,无免疫原性,抗菌谱广等特点。
现在,它被认为是从细菌到高等哺乳动物普遍存在的一类防御性多肽,称之为“第二防御体系”。
抗菌肽不仅抗菌谱广,而且可以抑杀某些真菌、病毒及原虫,并对多种癌细胞及动物实体瘤有明显的杀伤作用,而不破坏正常细胞。
近年来,对昆虫抗菌物质的研究,特别是对昆虫抗菌肽的研究已成为一个迅速发展的新领域,越来越引起人们的关注和重视。
抗菌肽可望成为新一代的抗菌、抗病毒、抗癌药物。
但天然抗菌肽的来源少,成本高,无法满足临床试用和基础研究的需要。
因此通过DNA重组技术来获得大量抗菌肽,成为人们普遍关注的焦点。
同时,对抗菌肽抗菌、抗肿瘤机理的深入研究也越来越具有重大的理论意义和实际应用价值,前景十分广阔。
1 抗菌肽的抗菌作用及其机理抗菌肽具有广谱杀菌作用,包括对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌[1],尤其对耐药菌株有明显抑杀作用,对一些农作物和经济作物病原菌亦有作用。
另外,对某些真菌如粗糙链孢霉、绿色木霉、大刀镰孢等有显著效果[2,3]。
关于抗菌肽的杀菌机制,因内外学者对此研究已经很多,但至今仍然存在不同看法。
Christensen[4]等以脂双层为模型详细描述了抗菌肽作用于膜的过程。
首先是抗菌肽通过静电作用被吸引到膜表面,然后疏水尾巴插入细胞膜中的疏水区域,通过改变膜的构象,多个抗菌肽聚合在膜上形成离子通道,造成物质泄漏和细菌死亡。
1996年,Lockey[5]利用电子显微镜和免疫胶体金技术观察到天蚕素(cecropin)A结合到大肠杆菌(E.coli)膜上,形成一个9.6nm直径的病灶,形成的孔洞直径4.2nm,孔洞导致细胞内容物外泄,细菌死亡。
中国抗菌肽行业研究报告一、研究背景抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的短肽分子，可以通过直接破坏细菌细胞膜、干扰细菌细胞代谢过程等方式来抑制细菌的生长。
由于其高效、低毒性等特点，抗菌肽在医药、农业、食品等领域具有广阔的应用前景。
二、行业规模根据市场研究数据，中国抗菌肽行业市场规模从2024年的10亿元增长至2024年的30亿元，年复合增长率达到20%以上。
随着人们对健康食品和环境友好型农药的需求增加，抗菌肽行业有望继续保持高速增长。
三、市场需求1.医药领域：随着抗生素耐药性的加剧，抗菌肽成为研究的热点。
目前，抗菌肽已经应用于慢性伤口治疗、抗菌药物辅助治疗等领域。
2.农业领域：传统农药对环境和人体健康造成一定压力，抗菌肽作为一种环境友好型农药备受青睐。
抗菌肽可以用于农作物保护和动物饲料添加剂等方面。
3.食品领域：食品中存在着各种致病菌，抗菌肽可以增加食品的安全性。
目前，抗菌肽已应用于奶制品、肉制品等食品中，对于食品保鲜和品质保证起着重要作用。
四、技术发展1.人工合成技术：通过生物技术手段，可以人工合成抗菌肽，提高产量和抗菌活性。
2.融合蛋白技术：利用一些载体蛋白将抗菌肽与其他功能蛋白进行融合，提高稳定性和抗菌效果。
五、发展障碍1.生产成本高：抗菌肽的生产成本较高，限制了产业的发展。
需要通过技术创新和规模效应来降低生产成本。
2.安全性评估不完善：抗菌肽在医药、农业、食品等领域的应用安全性评估工作仍不完善，亟待加强研究和监管。
六、发展机遇1.政策支持：随着人们对健康和环境保护需求的增加，政府对抗菌肽行业的支持力度将增加。
3.市场需求增加：抗菌肽作为一种环境友好型农药和食品添加剂，其市场需求将随着消费升级和生活质量要求的提高而增加。
七、发展建议1.加大科研力度：加强对抗菌肽的研究，提高抗菌肽的生产效率和抗菌活性。
2.完善安全性评估：加强安全性评估研究，建立科学、完善的监管机制，确保抗菌肽的安全应用。
3.加强行业协作：政府、科研机构和企业间要加强协作，共同推动抗菌肽行业的发展。
昆虫天然抗菌素研究以及应用研究随着世界人口的增加和社会的发展，人们对食品安全、环境卫生和个人卫生的要求越来越高。
抗生素的滥用和人类对抗生素的过度依赖也使得抗生素耐药性的问题日益突出。
为了解决这些问题，人们逐渐开始关注天然抗菌素的研究。
在众多的天然抗菌素中，昆虫天然抗菌素备受科学家的关注。
昆虫天然抗菌素是昆虫在生长和进化过程中自身产生的一种抗菌物质。
在昆虫的体内，天然抗菌素不仅可以起到抵御外界细菌的作用，还可以帮助昆虫排毒，维持身体健康。
昆虫天然抗菌素具有很高的热稳定性、广谱性、低毒性等特点，可以用来开发各种保健品和医药品。
对于昆虫天然抗菌素的研究，科学家们一直在不断探索和努力。
目前，已经发现了大量的昆虫天然抗菌素，如飞蛾抗菌肽、海螺抗菌肽、蜜蜂毒肽等。
这些抗菌素在广谱性、低毒性方面都具有很大的优势，在食品安全和个人卫生领域具有很大的潜力。
此外，昆虫天然抗菌素在医药领域也有很大的应用空间。
科学家们通过探索和研究，发现昆虫天然抗菌素可以用于防治药物耐药性感染的治疗，从而成为抗菌治疗的重要策略。
同时，在肿瘤治疗方面，昆虫天然抗菌素也具有很大的潜力，可以用于抑制肿瘤细胞的生长和扩散。
昆虫天然抗菌素的研究和应用还需要在很多方面做出努力和探索。
例如，对于抗菌素的提取、分离和纯化等方面，需要采用先进的技术方法，使得抗菌素的纯化度和活性可以得到有效的保证。
在抗菌素的体内和外用方面，科学家们也需要进一步探索如何合理使用抗菌素，从而更好地发挥其治疗作用。
此外，对于昆虫天然抗菌素的安全性方面也值得深入研究。
总之，昆虫天然抗菌素的研究和应用具有很大的潜力。
随着科学家们对昆虫天然抗菌素的研究逐渐深入，相信会有越来越多的昆虫天然抗菌素应用于食品安全、环境卫生和医药领域，为人类社会带来更多的福祉。
抗菌肽的研究进展摘要：由于细菌对抗生素耐药性不断出现, 研发新型抗菌物质已迫在眉睫。
而抗菌肽是广泛存在于自然界生物中的具有广谱抗菌、抗病毒、抑制杀伤肿瘤细胞等作用的多肽。
本文介绍了抗菌肽的结构，抗菌肽的生物学活性，抗菌肽的作用机理和作用机制，以及抗菌肽的应用和前景。
关键词：耐药性，抗菌肽；作用机理；前景抗菌肽，简称ABP,是由宿主产生的一类能够抵抗外界病原体感染的小分子多肽。
广泛存在于各种生物体内。
1980 年，瑞典科学家Boman 等从天蚕蛹的血淋巴中分离得到天蚕素( cecropin ) 抗菌肽，使人们对抗菌肽的作用机理和应用有了一个崭新的认识。
目前世界上已知的抗菌肽共有1 700余种。
由于热稳定性强，且对较高离子强度环境有较强的适应性，不仅有广谱抗细菌能力, 而且有的对真菌、病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用，最重要的是可以杀伤动物体内的肿瘤细胞，却又极少破坏动物体内的正常细胞，因此，抗菌肽的开发和应用研究已成为国内外昆虫学、生理学、药理学研究热点，在动植物转基因工程及药物开发领域及农业、食品等领域具有广阔的应用前景。
1 .抗菌肽的结构1 .1 一级结构据报道，已分离并测定其氨基酸序列一级结构的抗菌肽达几十种，且一级结构都比较相似，具有以下典型的特征：由20~70多个氨基酸残基组成的肽链，其N 端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸，C 端富含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸等非极性氨基酸，中间部分则富含脯氨酸，且在许多特定位置都有一些较保守的氨基酸残基，这些高度保守的氨基酸残基是一些抗菌肽分子具有抗菌活性所不可缺少的，1. 2 二级结构通过圆二色性分析、二维核磁共振谱法及脂质体模拟实验研究抗菌肽的二级结构特征，结果表明，抗菌肽在一定条件下形成a-螺旋和β-折叠结构。
a-螺旋是一个近乎完美的水脂两亲结构,即圆柱形分子的纵轴一边为带正电-的亲水区，而对称面为疏水区。
这种两亲性结构是抗菌肽杀菌的关键，改变a-螺旋的螺旋度会影响抗菌肽的活性。
昆虫抗菌蛋白的研究进展第8卷1999年第3期9月河南医学研究HENANMED眦AllRES]-ARCH昆虫抗菌蛋白的研究进展Theprogressof~lildiesoilinsectantilmeterialproteins齐静姣综述(洛阳医学高等专科学校寄生虫学教研室洛阳471(]O3)昆虫的种类繁多约儿百万种,为适应各种不同的生态环境,建立了自己独特的防御体系,抗菌蛋白就是其中的关键成分=抗菌蛋白是昆虫血淋巴中的一类生物活性肽.具有可诱导性,有抗细菌,病毒,真菌,原虫及肿瘤细胞等作用,应用前景广阔t.目前对昆虫抗菌蛋白的研究已成为一些实验室的目标, 本文扼要地从抗菌蛋白的诱导,性质,分子结构抗菌机制方面的研究进展作综述.1昆虫抗菌蛋白的诱导昆虫体内抗菌蛋白的产生或合成,是外界因素诱导作用下发生的生物鼓应厩可用细菌直接感染诱导,也可用一些物理或化学因素诱导,例如超声波,射线,生理盐水,聚肌胞核苷(polyl:C)等.我国科学家用超声波处理家蚕(Bombyxmoil),蓖麻蚕(Philosamaacynthiafieina)或柞蚕(AIithe’l’aeap哪),或直接用大肠杆菌(Esd~richiacoil)注射,均可诱导这些昆虫产生抗菌物质.实验结果表明,同一种昆虫经不同诱导源处理后形成相同的抗菌物质.龚琪等l用帅c0,射线,活的太肠杆菌盟热灭活的金黄色葡萄球菌(Staphylococe~umus),绿脓杆菌(Pseu—domonasaenl出0sa)和生理盐水作诱导源,诱导美洲太蠊(Peri—plm~etaamericana)的结果表明,不同诱导源诱导产生的抗菌物质的活性太小有所不同,抗菌特性上也有一些差异.刘玉滨等0 用小白鼠肝癌细胞,大肠杆菌或巨大芽胞杆菌诱导柞蚕,蓖麻蚕等昆虫,均获得抗菌蛋白.除以上昆虫外,在太头金蝇(chn帅amace】ala)引,家蝇(Muse~domestica).5J,麻蝇(s盯一0p}诅gaP盯嗜m),果蝇(DI∞叩hmelenogaster),蜜蜂(Ap mellifera)[及粉蚜(z!【I10lah劬岫)等昆虫中都诱导出抗菌蛋白由此可见,在外界诱导源的刺激下产生抗菌蛋白是昆虫个共同的普遍特性,但昆虫对诱导源不能区分,抗菌蛋白是非专一性的免疫应答产物,非常相似于高等生物体内的某些生物活性因子,例如干扰素,白细胞开索2等.因此,昆虫抗菌蛋白的研究正引起人们极大的兴趣:2昆虫抗菌蛋白的性质近年来的一些研究结果表明抗菌蛋白具有广谱的抗菌作用黄自然等发现柞蚕抗菌肽D对草绿色链球菌,乙型溶血链球菌,金黄色葡萄球菌等有抑制作用.龚琪等观察到美洲大赫产生的抗菌物质对致病性太肠杆菌,伤寒杆菌,绿脓杆菌,痢疾杆菌,金黄色葡萄球菌,枯草杆菌,变形杆菌,灵杆菌等都有抑菌效果绿蝇经诱导产生的抗菌物质也对革兰氏阳性菌和肼280Sel~eroberl999性菌有抑制作用.戴祝英等用家蚕抗菌肽对菖蓿Y纹夜蛾核型多角体病毒进行作用,发现抗菌肽在不同程度上抑制病毒多角体的形成_I.昆虫的抗菌蛋白不仅有抗细菌,病毒的作用,而且还能抗原虫和癌细胞.日本东京大学的名取俊二教授从杯尾别麻蝇幼虫中分离到两种抗菌肽,能促进小鼠巨噬细胞及异型棱白细胞对癌细胞的攻击作用,叉能使细胞产生干扰索, 井使肿瘤坏死园子活化张双全等1]用透射和扫描电子显微镜及激光共聚焦显微断层图像分析观察到家登抗菌肽对K562 (人髓样白血病)细胞有明显的杀伤作用.黄自然等观察到柞蚕免疫血淋巴对鼻咽癌细胞株的细胞膜有破坏作用Ja)aaes 等…从天蚕中分离到一种全能肽(Ve~epepfide),对多种细菌,病毒,原虫及癌细胞均有很强的杀伤作用.可见,上述结果对昆虫抗菌蛋白的进步研究,将会起到积极推动的作用.3抗菌蛋白的分子结构抗菌蛋白是昆虫血淋巴中的类生物活性肤.从目前已确定一级结构的二十几种抗菌肽来看,它们有不少相似之处. 肽的端半分子富含亲水的氨基酸残基,特别是碱性氨基酸如赖氨酸,精氨酸,而C端则含较多的疏水残基,末端都是酰胺化.最早分离纯化的抗菌肽是美国天蚕索(ce唧-玛).所有的∞c兀,I坞均为3l～39个氨基酸残基组成,不含半胱氨酸,有强碱性的N端区域,C端为疏水段,有两个a螺旋,两螺旋阃有甘氨酸和哺氨酸形成的铰链区域.棕尾别麻蝇经诱导产生的抗菌蛋白一肉毒索I,是由三种结掏相同的蛋白分子(肉毒索T,JI:)组成的混合物.这些蛋白由39个氨基酸残基组成,只有2～3个残基的差异.这些分子氨基末端富含亲水的氨基酸残基,羧基末端含疏水的氨基酸残基.用二维棱磁共振光谱研究肉毒素I溶液掏型,表明它有两个亲水脂的n螺旋,对抗菌活性的表达十分重要,两螺旋同也有一个铰链区域.Bulet 等J也从鞘翅目昆虫中得到结构相似的三种高教抑菌的抗菌肽pedeA,B,C.其中pedeA由74个氨基酸组成,富含甘氨酸,具有抗革兰氏阴性菌的活性;peptideB和C有43个氨基酸残基,含6个半胱氨酸,这两种肽对革兰氏阳性菌有抑制作用. 从已测知的抗菌蛋白的一级结构中看出,抗菌蛋白具有疏水性和亲水性,而且亲水性的氨基酸残基在昆虫生理环境下往往带电荷这些多肽分子之间的氨基酸残基变化小,保守性较强.说明昆虫在生物进化过程中遗传的稳定性,其免疫防卫系统中抗菌物质的生物合成由一些古老的基因所控制.Sceiner等15用ch0u—Famlmn方法对cecropinA,B的一级结构进行了第3期昆虫抗苗蛋白的研究进展理论计算.发现cecmpinA的1—11残基有很强的形成螺旋倾向:并摸索出在15%六氟异丙醇环境F,利用二维核磁技术获得它的’HN’~/IR谱,用Nilges等的动力学摸拟遇火方法进行计算,得到了ce~ropinA的三维结构蛋白质的功能主要决定它的高级结构因此,对抗菌蛋白的高级结构还有待进步深研究4抗菌蛋白的抗菌机制BonLan等3从天蚕脂肪体内分离到mRNA,反转录后得到eDNA.再经表达后得到抗菌肽前体.Se-RokLee等为SapeeinB几乎全部在脂肪水脂n螺旋结构,在细胞膜上形成孔道,破坏晦膜,然后再改变整个细胞膜.总之.抗菌蛋白丹lf首先在细菌质膜上形成离子通道,使细胞内K大量外渗,破坏膜势,ATP台成急剧下降,细胞内物质流失,以致细胞死亡一端的两性螺旋是裂解细菌的主要部分:c末端的酰胺化对于抗菌蛋白的广谱抗菌有重要作用.5抗菌蛋白的研究展望昆虫抗苗蛋白具有分子量小,热稳定,水溶性好,抗菌谱,及材料丰富等优点.更为重要的是抗菌蛋白对真核细胞几乎段有作用,仅仅作用于原梭细胞和发生病变的真棱细内,戴祝英等对抗菌肽作用于肿瘤细胞和病毒的机理进行了,泛研究并取得可喜结果韩献萍等发现柞蚕抗茁肽对官颈癌细胞和阴道毛滴虫有明显的杀伤作用:张双全等”观察到家蚕抗菌肽CM4对培养的K562(人髓样白血病细胞)有很强的杀伤作用昆虫是很多人类疾病的传播媒介,其传播疾病中的环节是复杂的.关于昆虫及虫媒病已有大量研究,但通过昆虫免疫学知识来控制这些疾病的工作刚开始起步抗菌肽可有效地杀灭人体寄生虫,如疟原虫,锥虫利什曼原虫.在对杀采蝇的研究中,彤成一个新思维.即将各种传播人娄传染病的昆虫通过转基因构建一个新品系,对上述寄生虫有抗性.此中断传播途径.围此,对昆虫抗菌蛋白的研究不仅对生物体乃至整个生物界的防御体系和机制有了新的从识.而{]l示出昆虫抗菌蛋白令人瞩目的应用前景和潜在的开发价值参考文献lJ哪嘴』Llcd:Ambullet?鼬‰-19~;10:82龚琪.孟阳春.周洪福不同诱导豫诱导龚洲太鳙血琳巴抗菌聊质舯研究中国媒舟生转学厦控制杂志.L993;4:813刘玉滨,宗舜.扬明华几种昆虫的免疫试验研究动特学集刊, 1992;9:494王晓束,靳庆生走叠金蝇幼虫免疫系统对丘脑杆菌诱导的应答研究昆虫知识.1鲫f:勰:405f远程,刘伟.扬峰,等.家蝇血淋巴的提取厦抗苗物质的诱导微生翱,1992拙:4396№wu且~otiS|Ⅷoonthree~fibaetefiolo把Lnsfromtheeult~n~’diam【IHISPe_4,arIemb~,oniccellline目p}1a,腼∞a;∞:I71127KP,mb订c,Itultra~Dthe~~mpin【0叫8inI)嘴Pl|il,o0叫dgeeluste~invvin山erp(峨to【帅f~4BO』,1990~9:2I78C~,tlMe~eL,.IB0l曲.manddl—tiza【mnf珊mba.棚P如ink目(A9ma)』Biad~m,I990;187:3819BluetP,nchS.肺Ⅱ口DqJ—L..1帅lml呷r丌I口…d舯目in一宴ectofanovelir:d~eibLeanfibaetori~lpe~ideⅢdun帅hin—sectd&rainf~nily』B/dC,1991;2:2452t~】f】郭玉梅,戴祝英昆虫抗荫肚的研究进展生物工程进展,】996;16: 24_l张般全,贾红武,戴祝英抗苗肚CN4抗K562螬f细胞的超微结构研究生物化学与生物物理进展,1997;:159『2胡孟兜,赵学忠,屈贤铭抗苗肚的分子生物学研究进展.生抽工程进展,1997;1714L3Ⅱ蛐ItG,l”~geI,曲Ⅱs帅nGH,Cdl一Lm1儿mib’in~empia:amodelsyst~htproteinsr』B~era,1991;20l:23L45e-P,okLee,51m~~hlmNllraaa,s}ILⅡulN~oriMD【e口darclr~ningofeDNAforsapeeinB,a口tproteinofS},anditsdete~inlmvb月”,1995;36s:48515Stei~哪D,Men~filelelaRBBlrLd吨andt【0玎eeer~inco—e[标签:快照]。
一、摘要抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子肽，具有高效、低毒、不易产生耐药性等优点。
本实验旨在通过高效液相色谱（HPLC）技术分离纯化抗菌肽，并通过抑菌圈法测定其抗菌活性。
实验结果表明，成功分离纯化了抗菌肽，并测定了其最小抑菌浓度（MIC）。
二、引言抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子肽，广泛存在于各种生物体内，如昆虫、鱼类、两栖动物和哺乳动物等。
抗菌肽具有高效、低毒、不易产生耐药性等优点，因此在抗菌药物的研究和开发中具有广阔的应用前景。
本实验通过HPLC技术分离纯化抗菌肽，并对其抗菌活性进行测定。
三、实验材料与方法1. 实验材料抗菌肽粗提物：购自某生物科技公司；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌：购自某微生物研究所；甲醇、乙腈：色谱纯；其他试剂：分析纯。
2. 实验仪器高效液相色谱仪（HPLC）：某品牌；细菌培养箱：某品牌；无菌操作台：某品牌；电子天平：某品牌；抑菌圈测定仪：某品牌。
3. 实验方法（1）抗菌肽的分离纯化将抗菌肽粗提物溶解于适量甲醇中，采用反相高效液相色谱法进行分离纯化。
色谱柱：C18柱（4.6×250mm，5μm）；流动相：乙腈-水（梯度洗脱）；流速：1.0mL/min；检测波长：215nm。
（2）抗菌活性的测定采用抑菌圈法测定抗菌肽的抗菌活性。
将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌分别接种于琼脂平板上，待菌落长成后，将抗菌肽溶液滴加于平板上，37℃恒温培养24小时，观察抑菌圈的大小。
四、实验结果与分析1. 抗菌肽的分离纯化通过HPLC技术分离纯化抗菌肽，得到单一峰，证明抗菌肽已成功分离纯化。
2. 抗菌活性的测定（1）金黄色葡萄球菌抗菌肽对金黄色葡萄球菌的MIC为10-7mol/L，抑菌圈直径为16mm。
（2）大肠杆菌抗菌肽对大肠杆菌的MIC为10-6mol/L，抑菌圈直径为15mm。
（3）白色念珠菌抗菌肽对白色念珠菌的MIC为10-6mol/L，抑菌圈直径为14mm。
《生物工程进展》1999,V ol.19,No.5综 述昆虫抗菌肽研究现状 陈留存 王金星(山东大学生命科学学院生物系 济南 250100)摘要 近年来鉴定了的化学结构的昆虫抗菌肽的数目有迅速上升的趋势,一些新型昆虫抗菌肽相继被分离纯化。
不同结构的抗菌肽其抗菌特性及其抗菌谱存在着巨大差异,抗菌机制也不同。
昆虫免疫与动物免疫机制既存在着区别也存在着某些相似性。
关键词 昆虫免疫 抗菌肽 天蚕素 防御素1 引言昆虫抗菌肽是昆虫血淋巴中产生的一类小分子肽,当昆虫受到外界微生物的刺激时,可大量迅速地合成。
它具有热稳定性强,强碱性,抗菌谱广的特点,可以抗革兰氏阳性菌,也可以抗革兰氏阴性菌,有些甚至对病毒和肿瘤细胞均具有抗性[1]。
因此,自从1980年Baman发现第一种抗菌肽——天蚕素(cecropin)以来,许多昆虫抗菌肽相继被分离、纯化,氨基酸一级结构被确定,有些抗菌肽的基因结构也已确定。
但80年代人们主要集中研究鳞翅目、鞘翅目等大型经济昆虫,进入90年代以来,除继续研究大型昆虫外,一些小型种类日益引起有关学者的重视,如双翅目、膜翅目、同翅目等,而且除昆虫外,在其他许多无脊椎和某些脊椎动物中也发现了抗菌肽。
因此抗菌肽逐渐成为昆虫免疫学及分子生物学的研究热点之一。
一些昆虫抗菌肽已有专文论述[2,3],但关于抗菌肽的分类及抗菌机制却很少涉及,本文结合近年来新发现的昆虫抗菌肽,就其结构、性质及抗菌机制分类作一介绍。
2 昆虫抗菌肽的类型迄今为止,仅在昆虫中发现的抗菌肽已达100多种[4],根据结构及功能的不同可以分为4类,即天蚕素类(cecropins),昆虫防御素(insect defensins),富含脯氨酸(Pro)的抗菌肽(proline-rich peptides),富含甘氨酸(Gly)的抗菌肽(gly sine-rich piptides)。
2.1 天蚕素类(Cecropins)天蚕素是最早发现的抗菌肽。
1980年, Bom an等成功地把天蚕素与天蚕的溶菌酶在生化性质及功能上区分开,同年分离到纯的天蚕素A和B。
1981年,Boman与Bennic合作测定了天蚕素A和B的一级结构,随后在柞蚕、肉蝇、烟草天蛾中都发现了天蚕素或类似天蚕素的抗菌肽。
由表1可以看出,这类抗菌肽分子结构相似,都有31-39个氨基酸残基组成,分子量4kD左右,半胱氨酸(Cys)含量少,不能形成分子内二硫键,有强碱性的N端和缩水性强的C端,在肽的许多特定位置有较保守的残基,如2位的色氨酸(T ry),5、8、9位具1个或1对赖氨酸(Lys),11位具天冬氨酸(Asn),12位具精氨酸(A rg),有些位置尽管残基不同,但仍是保守替换。
1988年,Halak等人利用二维核磁共振技术测定天蚕素A的三级结构,其分子结构含有两段 -螺旋,N端1-4位4个氨基酸是非螺旋化的,5-21位为第一个 -螺旋,该螺旋中极性与非极性氨基酸含量相当,因此该螺旋对水和脂都具有亲和性,称为双亲的 -螺旋,22-2455表1 几种天蚕素的一级结构抗菌肽氨 基 酸 序 列天蚕素D W_NPFKEL E KVGQRVRDA VISAGPAVAT VAQATALAK*柞蚕素D W_NPFKEL E RVGQRVRDA IISAGPAVAT VAQATALAK*烟草天蛾B2W_NPFKEL E RVGQRVRDA VISAAPAVAT VGQAAAIAR*天蚕素A KW_KLFKKI E KVGQNIRDG IIKAGPAIAV VGQAT QIAK*天蚕素B KW_KVFKKI E KM GRNIRNG IVKAGPAVAV LGE AKAL*家蚕抗菌肽CM IV RW_KIFKKI E KVGQNIRDG IVKAGPAVAV VGQAAT I*家蚕杀菌肽B RW_KIFKKI E KM GRNIRDG IVKAGPAIEV LGS AKAI*果蝇杀菌肽A GWLKKIGKKI E RVGQHT RDA T I_QGLGIAQ QAANVAATAR*肉蝇毒素IA GWLKKIGKKI E RVGQHT RDA T I_QGLGIAQ QAANVAATAR*猪杀菌肽Cecp SW LSKT AKKL E NSAK-KR_—ISEGIAIAI QGG__PR *表示C端酰胺化,黑体表示保守氨基酸位为A la-Gly-Pro形成的结节部,25-37位为第二个 -螺旋,其中疏水氨基酸含量高,故该 -螺旋疏水性强,由此可知,由于昆虫天蚕素多肽链中含有一个保守的Pro,因而在两段 -螺旋之间出现一个结节部,这种结节部在其他一些细胞膜毒素如melitin,alamethicin,pardax in中普遍存在,而且这种结构与天蚕素的抗菌活性密切相关。
从表1还可以看出,所有昆虫抗菌肽的C端都是酰胺化的,C端的酰胺化对其广谱抗菌极为重要[5]。
天蚕素类抗菌肽对革兰氏阳性菌和阴性菌都有较高抗性。
昆虫天蚕素对细菌的作用过程可概括如下:首先在静电作用下,带正电荷的天蚕素分子与带负电的细菌细胞表面结合,使许多天蚕素分子聚集于细菌细胞外膜上。
然后,疏水的C端 -螺旋插入疏水的细菌细胞膜中央,双亲的 -螺旋留在膜表面。
完成该步过程的关键在于两股 -螺旋之间存在一个结节部,增加了整个分子的柔韧性。
最后,由于大量天蚕素分子与细胞膜结合,使得膜外正电荷增多,两侧膜电位升高,超过阈值时导致膜去极化,进而双亲的 -螺旋插入膜中,两个或多个分子聚集在一起形成离子通道,导致细胞内阳离子大量外流,细胞内ATP合成速度下降,细胞呼吸受到抑制,最后菌体停止生长或死亡。
实验表明,当脂质体中含有胆固醇时,天蚕素对其作用明显降低,而胆固醇是真核细胞细胞膜的固有成分,这可能是天蚕素只作用于原核生物的重要原因[6]。
1989年,Lee等从猪的小肠中分离到一种类似天蚕抗菌素的抗菌肽,命名为Cecp (cecropinP1),其氨基酸的序列与天蚕素B具有33%的同源性,二维核磁共振分析表明,其空间结构主要为一条纵贯全长的 -螺旋,昆虫天蚕素中保守的Pro在Cecp中不存在,因此Cecp中不存在结节部。
另外,Cecp的C端为羧基而不是酰胺基。
Cecp对革兰氏阳性菌的抗性与昆虫天蚕素相当,而对革兰氏阴性菌抗性较弱,其抗菌机制也与后者不同。
首先,Cecp分子中的碱性氨基酸与细菌外膜表面的带负电的磷脂酰头部结合,使得大量CecP单体结合在细菌外膜上,形成“地毯式”的一层,然后由于分子的旋转导致Cecp的疏水残基与膜中央的疏水区域结合,超过阈值时,则在质膜上形成瞬时的小孔,进而使质膜瓦解,菌体死亡[7]。
2.2 昆虫防御素(insect defensins)昆虫防御素一词来源于这些肽与哺乳动物嗜中性白细胞中分离到的防御素具极大的相似性。
第一种昆虫防御素由M asturyam a于1988年在一种半翅目昆虫肉蝇(Sar co p haga p eregr ina)中发现。
迄今为止仅在昆虫纲中就有15大类,30多种防御素被报导。
这些昆虫包括双56翅目5种、鞘翅目2种、膜翅目1种、毛翅目1种、半翅目1种、蜻蜓目1种,而且在蛛形纲的一种蝎子(L eiurus quinquestriatus)和软体动物的贻贝(M y tilus edulis)中也发现了防御素[8]。
但在鳞翅目昆虫中尚未发现防御素。
表2 几种昆虫防御素的一级结构昆虫种抗菌肽氨基酸序列LOOP 螺旋 折叠绿蝇防御素A AT CDLL----SGTGINHSACAAHC LLRGNR- -GGYCNG_-KGVC VCRN尾蛆蝇防御素AT CDLL----SGTGINHSACAAHC LLRGGR- -GGYCNR--_KGVCVCRN肉蝇肉蝇肽A AT CDLL----SGTGINHSACAAHC LLRGNR- -GGYCNG----KAVCVCRN意蜂Royalis in VT CDLL---SFKGQVNDSACA ANCLSGKA-- -GGHCE-----KGVCICRKTS FKDLW DKYF 粉蛱防御素A FTC DVLGFEIAGT KLNS AACGAHC LALGRR--GGYCNS_--KS VCVCR肉蝇肉蝇肽B LT CEIDRS----------- -CLL HCRLKGYLRA-YC SQQ-----KVCRCVQ 由表2可知大多数昆虫防御素分子量为4kD左右,由38--43个氨基酸残基组成。
但有两个例外,一种是肉蝇肽(Sapecin B),仅由34个氨基酸残基组成。
另一种是从膜翅目昆虫意大利蜂(Ap is mellif era)中得到royalisin,由51个氨基酸残基组成[9]。
昆虫防御素都带有一个净正电荷,氨基酸序列中都含有6个Sys,且这6个Cy s的位置很保守,能形成3个分子内二硫键。
绿蝇防御素(Phorm ia defensin)是研究得最清楚的防御素,该分子由三个结构域组成:一个柔韧的N端环(loo p),一个亲水脂的 -螺旋中心,一个带有拟 转角的反向平行的 片层的C末端, -螺旋通过两个二硫键与 -片层的一条链稳定相连,而N端环通过第三个二硫键与 片层的另一条链相连。
不同种类昆虫防御素分子结构具有很大的同源性,其主要差异在于N端的环的大小。
而且Cy s-Xaa-Xaa-Xaa-Cys或Cys-Xaa-Cys(Xaa代表任意氨基酸)这种结构普遍存在,使 -螺旋通过分子内二硫键得以稳定[10]。
昆虫防御素可以抗革兰氏阳性菌而对革兰氏阴性菌几乎无作用,与哺乳动物防御素不同,昆虫防御素对真菌及真核细胞不起作用,其作用机制可以概括为:首先防御素分子依靠其双亲的 -螺旋与细菌外膜结合,散布于膜表面。
当大量防御素分子与膜结合后,它们聚合在一起形成寡聚体,这些寡聚体在细菌细胞上围成一个离子通道,从而细胞内K+大量外流,细胞内AT P合成下降,细胞呼吸受阻,菌体死亡。
实验证明,防御素分子中的二硫键在其抗菌作用中至关重要,如果用二硫苏糖醇(可以还原二硫键)处理昆虫防御素,则其抗菌活性丧失。
另外,增加介质的离子强度或降低温度也可以阻止离子通道的形成,从而使防御素的抗菌活性下降。
2.3 富含脯氨酸的抗菌肽(Pro line-rich peptides)这是八十年代末才发现的一类新型的昆虫抗菌肽。
1989年,Casteels等从膜翅目的意大利蜂(A.mellif era)中首先发现,后来这类抗菌肽又陆续被报导,如来自蜜蜂的apidaecin和abaecin,来自果蝇的drosocin,来自红蝽的pyr rho cor icin和metalniko nins等。
这类抗菌肽都由15--34个氨基酸残基组成,其中Pro含量在25%以上。
