酶活测定的原理

酶活测定方法

还原法

酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下

比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 。

色原底物法

通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后 ,即可求出待测酶的活力。

粘度法

该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大 为降低。基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。

高压液相色谱法

酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值。

免疫学方法

常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、免疫凝胶扩散法。这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应 ,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。

琼脂凝胶扩散法

将酶作用的底物与琼脂混合熔融后 ,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径 的小孔。在点加酶样并培养24h以后 ,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。

蛋白酶活力的测定

随着生物技术的发展及环保要求的提高，越来越多的酶制剂应用于制革生产中。比如浸水，脱毛，软化，脱脂等工序都用到大量的酶制剂，从酶的作用性质来看制革生产中用到的主要是蛋白酶和脂肪酶。酶的本质是蛋白质，所以酶在出厂后的长途运输及存放过程中，由于条件的变化、振荡、阳光等的作用，其活力要有所改变，故在使用之前必须测定其活力。作为计算酶制剂用量的依据，以达到预期的脱毛效果。即现测现用。

纤维素酶一般至少由三种以上的酶组成，因此其综合酶活力测定一般用滤纸酶活来表示。滤纸酶活测定主要依据纤维素酶水解滤纸产生还原糖的数量，因此，首先要进行绘制葡萄糖标准曲线。

（1）测定葡萄糖含量的标准曲线绘制

制作葡萄糖标准曲线方法见表1：

表1 葡萄糖标准曲线

以上6只试管加3 mL DNS煮沸5 min立即冷却，加4.5 mL超纯水，以0号试管对作为空白调零，测定其他试管中葡萄糖溶液的OD540值。

根据葡萄糖浓度和测得的OD值做葡萄糖浓度—吸光度曲线。

标准曲线：BAxY

Y——吸光度值。

x——葡萄糖浓度（g/L）。

（2）纤维素酶酶活的测定

按表2，先对待测酶液进行100倍稀释（将酶进行稀释是为了使测得OD值处于0.1~1.0之间，提高结果的准确性，不同酶样品此处稀释倍数不同），然后根据不同处理加入底物和酶液等组分：

表2 TX3发酵液中纤维素酶活的测定

处理方式 纤维滤纸质量（mg） 酶液（ml） 缓冲液（ml） DNS(ml)

底物空白 0 0.5 1 3

酶空白 50 0 1.5 3

实验组(3个平行) 50 0.5 1

3 葡萄糖（ml） 去离子水（ml） DNS(ml) 反应体系中葡萄糖浓度（mg/ml）

0 1.5 3 0

0.1 1.4 3 0.067

0.2 1.3 3 0.133

0.3 1.2 3 0.200

0.4 1.1 3 0.267

0.5 1.0 3 0.333

水对照 0 0 1.5 3

所有试管在50℃反应60min后，加入3 mL DNS煮沸5 min，立即冷却，最后加入4.5 mL超纯水，以水对照作为空白，测实验组、底物空白和酶空白的ODλ540值。

实验组的OD值在依据标准曲线换算成葡萄糖浓度前，要减去底物空白和酶空白的OD值。

（3）酶活的计算

先将实验组所测定OD值，依据标准曲线换算成葡萄糖含量，再依据酶活定义折算成相应酶活。

0.067mol/L pH7.0磷酸缓冲液

分子量 0.067mol PH7.0(1000ml磷酸缓冲液)所需量（ｇ）

Ｎa2HPO4.2H2O 178.05 7.1184g

Ｎa2HPO4.12H2O 358.22 14.4004g

KH2PO4 136.09 3.6292g

Ｎa2HPO4.2H2O 7.1184g (或Ｎa2HPO4.12H2O 14.4004g)+ KH2PO4 3.6292g定容到1000ml容量瓶中

一 根系活性的测定

1、实验材料、试剂与仪器设备

1.实验试剂

乙酸乙酯(分析纯，次硫酸钠(Na2S2O4，分析纯)，粉末，1%TTC溶液，磷酸缓冲液(1/15mol/L，pH7.0)， 1mol/L硫酸。

2.仪器设备

小烧杯3个，研钵1个，移液管：0.5mL1支、10mL1支、5mL3支，刻度试管6支，分光光度计，电子天平，温箱，试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。

2、实验内容操作步骤

2、定量测定

(1)TTC 标准曲线的制作 取0.4％TTC溶液0.2ml放入大试管中，加9.8 ml乙酸乙酯，再加少许Na2S2O4粉末摇匀，则立即产生红色的TTF 。此溶液浓度为每毫升含有TTF80μg。分别取此溶液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF20μg、40μg、80μg、120μg、160μg的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参照，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

（2）称取根尖样品0.5g，放入小烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液(pH7.0)各5ml，使根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1—2h，此后立即加入1mol/L硫酸2ml ，以停止反应。(与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，37℃下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上)。

酶活测定方法

羧甲基纤维素酶(CMC酶)活力测定

取.05%CMCNa溶液lml,加入PH4.8,0.1M乙酸缓冲溶液4mL,蒸馏水lml,酶液1mL,于50℃水浴中糖化30min,取出,立即于沸水中煮沸15 min使酶失活,得糖化液,取糖化液lml,加3,5-DNS显色剂2mL,在沸水中显色15min,冷却后加蒸馏水22ml,摇匀,在550nm处比色。

以每分钟催化CMC水解生成1微克葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。

淀粉酶活力测定

在试管中加入1%可溶性淀粉溶液(用pH4.8,0.1M乙酸盐缓冲溶液配制)1mL,

加入pH4.8,0.1M乙酸缓冲溶液4mL,蒸馏水1mL,酶液lmL,40℃水浴中保温30min,以后操作与羧甲基纤维素酶(CMC酶)活力测定相同。

定义以每小时酶促生成lmg葡萄糖的酶量定为一个酶活力单位。

漆酶活力测定

O.1MpH4.5的乙酸缓冲液3.4ml,加入3.36mM的邻联甲苯胺1mL,再加入适当稀释的粗酶液0.5mL,25℃保温30min,756MC紫外可见分光光度计测600nm处的OD值。定义每分钟引起0.01个吸光度的增加所需的酶液量为一个酶活力单位。

超氧物歧化(SOD)酶活性的测定

1.将反应介质与核黄素按39:1比例混合。

2.在同样的六支试管,各加入反应介质与核黄素混合液4ml,再在测试管中加入酶液50ml,两支对照管中不加入酶液,可用50mL提取介质代替酶液。

3.照光1小时后测定样品在560nm处吸光度。

4.定义将硝基四哇蓝的还原抑制到对照一半(50%)时所需的酶量为一个酶活力单位。

过氧化物酶(POD)活性测定

取光径1cm比色杯两只,在一只中加入反应混合液3 mL,以KH2PO41 mL作为校零对照,另一只比色杯中加入反应混合液3 mL。酶液l mL(如酶活性过高可稀释之),立即开启秒表记录时间,反应20分钟后,于分光光度计上测量吸光度值,读数于波长47Omn下进行。