实验三抗体形成细胞能力的检测QHS和次免疫培训课件

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医学免疫学免疫学检测技术ppt课件

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双抗体夹心法、间接法ELISA
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间接法ELISA
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ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器 17
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析
常用鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
先做凝胶电泳将蛋白质分区再将蛋白质转移至固相载体后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位
（1）直接荧光法荧光素一抗对每种抗体作标记特异测Ag
（2）间接荧光法：荧光素二抗不必标记每种抗体敏感测Ag/Ab
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免疫荧光法
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2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原
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II ) Precipitation （二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散
1. 单向免疫扩散：抗原的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析 3. 免疫电泳：电泳 + 双向免疫扩散（抗原分析）
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3. 细胞因子检测
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM
（2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验细胞毒（或细胞毒抑制）试验
（3）分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA
4. 皮肤试验：测试IV型超敏反应能力
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（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM

免疫检验课件ppt

移植免疫监测
器官移植后，患者需要接受免疫抑制治疗以防止排斥反应。通过监测免疫功能和相关抗体，有助于评估患者的免疫状态和移植效果。
02
CHAPTER
免疫检验基础知识
抗原是指能够刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答的物质，包括外源性抗原和内源性抗原。
抗原
抗体是指机体在抗原刺激下产生的具有高度特异性的蛋白质分子，能够与相应抗原结合，发挥免疫效应。
通过检测T细胞增殖和转化能力，评估机体的细胞免疫功能。
通过检测细胞因子表达水平，了解机体的免疫应答状态。
通过检测免疫细胞的杀伤、吞噬、释放细胞因子等功能，评估机体的免疫功能。
利用基因芯片等技术对免疫相关基因的表达水平进行检测，了解机体的免疫应答机制。
基因表达谱分析
通过制备针对特定抗原的单克隆抗体，用于免疫学检测和免疫治疗。
通过检测炎症因子（如IL-1、IL-6、TNF等）的水平，了解机体的炎症反应状态。
通过检测自身抗体（如类风湿因子、抗核抗体等）的水平，了解机体的自身免疫状态。
04
CHAPTER
常见免疫检验项目及解读
总结词
乙肝两对半检测是常见的免疫检验项目之一，用于检测乙型肝炎病毒的抗原和抗体。
详细描述
乙肝两对半检测包括乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、表面抗体（HBsAb）、e抗原（HBeAg）、e抗体（HBeAb）和核心抗体（HBcAb）的检测。通过检测这些抗原和抗体，可以了解个体是否感染了乙型肝炎病毒，以及感染阶段和免疫状态。
01
免疫组学技术
利用免疫组学方法，研究免疫细胞和分子的功能和相互作用，为免疫疾病的诊断和治疗提供新思路。
02
生物信息学
结合生物信息学技术，对免疫相关基因和蛋白质进行大数据分析，挖掘免疫相关疾病的发病机制和潜在治疗靶点。

体外抗体形成细胞检测—定量溶血分光光度计法(QHS)

脾脏B细胞＋SRBC＋补体
成抗原抗体复合物，激活补体系统，裂解SRBC而释放
补体经典激活途径
出血红蛋白，以分光光度计定量测定。所测值反映了抗
SRBC裂解
体形成细胞产生抗体的功能。
分光光度计检测
2
实验步骤
❖ SRBC及其制备脱纤维防凝处理的SRBC，以NS洗涤二次，
每次2000rpm 离心5min。弃上清，制成 SRBC悬液，然后用血细胞计数板计数细胞，最后稀释成1.5×108 sRBC/ml。
时间也要严格控制。
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细胞计数法
WBC
1mm WBC 1mm
WBC
WBC
细胞浓度/ml
= 4个大方格中的细胞总数/4 × 104
RBC
细胞浓度/ml
= 5个中方格中的细胞总数 ×5 ×1804
W
W
1mm
W
W
1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=0.1×10-3ml =10-4ml
细胞浓度: 细胞数/ml =5个中格的细胞数 ×5×104（RBC计数法）
细胞数/ml = 4个大格的细胞总数/4 ×104 （WBC计数法） 9
抗体制备
原理：抗原免疫小鼠，激活免疫系统，B细
胞活化并分化为浆细胞，产生针对特定抗原的特异性抗体。
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方法
❖ 1.用移液管吸取脱纤维防凝处理的绵羊血适量
❖ 2.加2-3倍体积生理盐水，混匀，2000rpm离心5分钟，小心吸尽上清。
实验管 1ml
1ml
1ml
—
3ml
3. 混匀，37℃水浴1小时。 4. 3000rpm 离心 5 min，取上清 5.721分光光度计测413nm处OD值（Hb 量）

免疫实验免疫学和免疫检测技术试验培训课件

免疫实验免疫学和免疫检测技术试
6
验
本次实验检测血清IgG，应用的是双抗体夹心法。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
7
验
二、实验方法：
1、包被抗体：包被抗体浓度为：用包被液稀释（包被聚苯乙烯要
在偏碱性条件下进行，所以该包被液用pH9.6的碳酸盐缓冲溶液）抗体至10或20ug/ml，每孔加100ul。加18孔
•标准抗原1-5的浓度分别为： 50，100，200，300，500ng/ml (都从500ng/ml加，分别加10，20，40，60，100ul至各孔，再分别补加90，80，60，40，0ul保温液即可)
•荧光各孔：阴性对照：Ab-Ag-FITC-Ab，阳性对照用 200ng/ml，500ng/ml
4、洗涤：同样营免养疫实液验免洗疫涤学和2免次疫检，测洗技术去试淋巴细胞分离
2
液，离心： 500g 10min 验
5、检查细胞存活率：（1）将1滴细胞悬液和1滴台盼兰混匀，静置5-10分钟。（2）上述混合液滴入细胞计数板，在显微镜下观察细胞，计数活细胞数和死细胞数。
三、注意事项：
1。血液制品
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
三、注意事项：
1．斑点大小控制。 2．勿用力戳破膜。 3．给第一抗体和封闭蛋白（BSA）一定吸附时间。 4．把你的实验结果粘贴于实验报告上，报告测定结果，指出阳性点和阴性点。
免疫实验免疫学和免疫检测技术试
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验
实验四、免疫荧光检测技术
一、基本原理：
荧光双抗夹心法定位与定量抗原
免疫实验免疫学和免疫检测技术试验
2、加于淋巴细胞分离液上层，离心：500g 20min

细胞免疫功能检测方法PPT课件

了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End
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感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
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➢ 在ELISPOT板的移动过程中也要避免ELISPOT板的摇动，否则会造成斑点的分布不均。
➢ 在细胞培养完成之前一定要进行严格的无菌操作，试验过程中各步的洗涤工作一定要充分。否则会造成背景的不清晰，针尖样杂斑的增多。
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ELISPOT应用实例
跟据间接ELISA结果判定标准（P/N>2.1），由表1OD450值可以看出，小鼠免疫后第1、3、5、7天的P/N值分别为1.02、1.33、1.97和2.22，抗体水平呈现逐渐升高的趋势，在第7天才出现抗体阳性。而机体的 IFN-γ水平则呈现先升高后降低的趋势，在免疫后的第三天达最高值，此时分泌IFN-γ脾淋巴细胞比率177/106。分析可知，在NDV免疫小鼠时，细胞免疫与体液免疫存在着一定的时差关系，在血清抗体阳性检出的前期IFN-γ的分泌降至最低水平。
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应用及展望
白细胞中能够分泌IFN-γ的细胞为TH2和CTL细胞,
活化条件对细胞内免疫染色IFNγ和IL-4法检测人外周血Th1和Th2细胞的影响
➢ Th0/Th1/Th2 细胞转换（Th1与Th2细胞亚群均来源于共同的Th0前体细胞，抗原呈递细胞(APC)可活化Th0细胞。遗传因素、抗原类型、剂量、有无佐剂以及抗原进入体内的途径，均可影响APC活化Th0细胞时的微环境，而微环境中细胞因子的类型决定Th0细胞是否分化为Th1细胞或Th2 细胞）。

免疫学基础-免疫学检测与防治(全科医生培训) ppt课件

ppt课件 5
2.沉淀反应
可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应。 ★单向免疫扩散
★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳
★免疫比浊法
ppt课件 6
3.中和反应如抗“O”试验 4.免疫标记技术用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原用以测定相应抗原或抗体的技术称为免疫标记技术。常用方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫检测技术等。特点：敏感、特异、快速，能定性、定量、定位。
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免疫学诊断
●抗原或抗体的检测 ●免疫细胞及其功能检测
ppt课件
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一、抗原或抗体的检测 (一) 检测的原理
1. 已知抗体测抗原（多用于定性）
2.已知抗原测抗体（多用于定量）
ppt课件
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（二）常见抗原抗体反应的种类
1.凝集反应
细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块称凝集反应。 ★直接凝集反应 ★间接凝集反应 ★间接凝集抑制试验 ★协同凝集试验
ppt课件 7
★免疫荧光技术
★酶免疫测定法(ELISA) ★放射免疫测定法
★斑点金结合试验 ★免疫印迹法
ppt课件 8
渗滤法、层析法
二、淋巴细胞的测定
（一）T细胞总数及亚群的测定
（二）T细胞功能的测定 1.淋巴细胞增殖试验形态学方法、3H-TdR掺入法等。 2.细胞毒试验 3.细胞因子测定
ppt课件 9
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接种剂量次数量较大，2~3次副作用免疫效果较大较差，维持数月~数年疫苗保存较易保存
ppt课件
ppt课件
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一、人工免疫的概念及种类
人为地给机体输入抗原以增强机体的免疫功能，或直接输入免疫血清、

21_细胞免疫功能检测方法-ppt课件

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ELISPOT的流程
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底板与捕捉抗体的包被
➢ 底板类型：硝酸纤维素膜板、PVDF膜板等 ➢ 捕捉抗体：如抗某细胞因子抗体（Purified
Rat Anti-Mouse IFN-r Monoclonal Antibody ）。 ➢ 抗体包被：用无菌PBS（PH9.6）来稀释包被抗体，包被量通常在1-2μg/mL（1.25ug/ml ）。 ➢ 次日倾倒包被液，PBS洗涤数次，在灭菌吸水纸上扣干后，用完全培养基37℃封闭2h。 ➢ 倾倒封闭液，加入检测细胞进行细胞培养。
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突变型乙型肝炎病毒前C-C DNA疫苗的基础研究张敏中国人民解放军军医进修学院2007-07-052007博士
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欢迎各位老师同学提出宝贵意见！
ELISPOT与其他细胞免疫检测方法的比较
当特异性抗原和T细胞结合后激活细胞释放出 IFN-Y，IFN-YELISPOT可灵敏的检测出T细胞释出的IFN-Y，该方法己被用于多种CTL的检测。Yang.J的研究表明，ELISPOT方法检测 CTL不但有高度的敏感性还有高度的特异性和 HLA限制性，在用LMP2肽段CLG作为激刺原检测CTL时发现，只有相同HLA型别(HLA-A2) 的CDS+细胞能起阳性反应。
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培养时间对斑点数的影响
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NDV抗原浓度对斑点数的影响
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影响试验效果的其他因素
➢ 细胞是否具有活力是试验成功进行的先决条件，凡是活力高功能保持完好的细胞， ELISPOT检测时必定背景干净，阴性对照斑点少，而试验组斑点圆润鲜亮。
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➢ 在ELISPOT板的移动过程中也要避免ELISPOT板的摇动，否则会造成斑点的分布不均。

免疫细胞功能检测技术概述课件

原理(yuánlǐ)：
N-N-
C
+ H+
N=N-R-
四氮唑基（淡黄色）
N-NH2
C
N=NH
甲臜（紫黑色）
免疫细胞功能检测技术概述
第三十五页，共四十三页。
中性粒细胞 (zhōngxìng)
NBT
甲臜颗粒(kēlì)沉积于胞质中
免疫细胞功能检测技术概述
第三十六页，共四十三页。
二、巨噬细胞功能(gōngnéng)检测
免疫细胞功能检测技术概述
第二十二页，共四十三页。
2. 方法学：
➢ 经典(jīngdiǎn)溶血空斑形成试验 ➢ 被动溶血空斑试验
免疫细胞功能检测技术概述
第二十三页，共四十三页。
3．临床应用(yìngyòng)与评价
➢溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素(yīn sù)对体液免疫功能的影响 ➢评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体免的疫细胞能功能力检测。技术概述
2. 淋巴细胞转化(zhuǎnhuà)的刺激物
非特异性刺激物：
PHA ------T细胞 ConA -------T细胞
PWM -------T、 B细胞
LPS -------B细胞特异性刺激物：
异种(yì zhǒnɡ)抗原
同种组织抗原
免疫细胞功能检测技术概述
第七页，共四十三页。
3. 检测(jiǎn cè)方法
（2）3H-TdR掺入法
培养液 PHA
3H-TdR
淋巴细胞
全
血
离
心
分层液
过滤测量放射性
免疫细胞功能检测技术概述
第十一页，共四十三页。
试验孔A均值 SI对照孔 57A 0n均 m 值

抗体生成细胞检测.

试剂与器材
1. 小鼠；
2. 绵羊红细胞悬液（2.5%）；
3. 指示细胞悬液：含10% 绵羊红细胞悬液
0.5ml，补体0.3ml，Hank’s液2.0ml；
4. 细胞裂解液0.17mol的NH4Cl； 5. Hank’s 液（pH7.2）、凡士林油；
6. 动物解剖器械、注射器（5ml）、平皿、试管、吸管、载玻片、盖玻片、双面胶；
溶血空斑试验
制作反应板加样：30ul 温箱10分钟
双面胶盖玻片
Department of Immunology
Department of Immunology
定量溶血分光光度法（quantitative hemolysis spectrophotometry，QHS）
该法又称B细胞介导的红细胞定量溶血分光光度法，是根据溶血空斑试验的原理衍化而来，可用以测定由B细胞产生和分泌的抗体裂解红细胞所释放的血红蛋白(以吸光值表示)，从而反映机体的体液免疫功能。试验时，将免疫的脾细胞与SRBC及新鲜豚鼠血清等体积混合，于 37℃水浴1小时，离心后测上清吸光值，其与产生抗体的量成正比。
将SRBC免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定量的SRBC在琼脂凝胶内混合，在补体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC溶解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要用于测定B细胞抗体产生能力。
Department of Immunology
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实验原理
ELISPOT不仅可应用于B细胞分泌抗体功能的测定，也能检测分泌细胞因子的T细胞和巨噬细胞。
Department of Immunology
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抗原+抗体
结合补体
抗原+抗体+补体
补体活化，形成MAC
靶细胞裂解
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( QHS——Quantitative Hemolytic Spectrophotometric determination )
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结合抗原之前
结合抗原之后
Fc段
CH1
C1q 结合
CH2
位点被屏
障
IgM CH3区，IgG CH2区
暴露的 C1q结合位点
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3. 方法：
1ml
Hank’s
脾细胞
2）抗原-抗体-补体反应：
加1ml SRBC 溶液加1ml补体
彻底混匀
37℃孵育1h 离心，3000rpm，5min
分光光度计检测上清液 413nm波长下的吸光值
2. 材料：
SRBC免疫小鼠新鲜SRBC溶液 (1.5×108/ml) 经SRBC吸收的补体溶液
来自豚鼠血清经SRBC吸收去除非特异性抗体
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3. 方法：
取脾，以Hank’s 液漂洗经200钼铜网，以针拴研磨脾脏成单细胞悬液
1）制备脾细胞
收集细胞悬液，加适量Hank’s 洗涤
离心1500rpm, 5min 弃上清
细胞沉淀中加入4.5ml蒸馏水，用力混匀 40s 迅速加入0.5ml 9%NaCl 离心 1500rpm, 5min 弃上清，加入1.2ml Hank’s溶液
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抗原
脾脏
IgM
SRBC
免疫小鼠
4 days later
+ SRBC 补体
浆细胞
分光光度计定量分析
Hb
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4. 注意事项：
新鲜SRBC溶液，用前晃匀保持脾细胞活性
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Test 2 第三次免疫
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2. 方法:
处，请联系网站或本人删除。
脱纤维绵羊红细胞（SRBC）
加入3ml 生理盐水，混匀 2000rpm, 离心，5min
弃上清加入3ml 生理盐水，混匀
2000rpm, 离心，5min
弃上清
制备绵羊红细胞溶液20%、 25%、30%、40%
取0.1ml 皮下注射免疫小鼠
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Complementbinding site
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WBC
1mm WBC 1mm
WBC
WBC
细胞浓度/ml = 4个大方格中的细胞总数/4 x 104
RBC
细胞浓度/ml = 5个中方格中的细胞总数 x 5 x 104
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