骨髓间充质干细胞在神经系统损伤修复治疗中的研究进展
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骨髓间充质干细胞在神经系统损伤修复治疗中的研究进展
骨髓间充质干细胞（MSCs）近年来成为干细胞分化和细胞移植治疗研究的热门对象。MSCs具有多向分化潜能，体外研究证明其可向内、中、外三个胚层组织分化，其中MSCs向外胚层分化可形成神经元和神经胶质细胞等，国内外学者将其应用于神经系统损伤修复中，并取得了一定的疗效。本文将对MSCs在神经系统损伤修复中的研究进展作一综述。
标签： 骨髓间充质干细胞；神经细胞；转化；损伤修复
干细胞治疗是目前医学研究的热点，在损伤修复的治疗中有广阔前景。自从发现神经组织中存在神经干细胞后，用干细胞移植修复损伤神经组织的方法被寄予很大的希望，这方面的研究也取得了可喜的进展。目前研究用于移植的细胞有胚胎干细胞分化的神经干细胞、胎儿神经组织中提取的神经干细胞、嗅鞘细胞、雪旺细胞等，但是这些细胞的应用都还存在一些问题：胚胎和胎儿的神经干细胞的应用面临伦理学的问题，其来源艰难，难以满足临床需要，供体细胞有传播疾病的可能，同种异体移植有免疫排斥反应，影响其功能的发挥；嗅鞘细胞和雪旺细胞虽然可以自体移植，但是取材不方便，手术损伤较大，体外扩增时间长等缺点。有鉴于此，近年来科学家对应用骨髓间充质干细胞（bone mesenchymalstem
cells，MSCs）自体移植修复神经系统损伤和病变表示了极大的兴趣。
1骨髓间充质干细胞的发现及命名
德国病理学者Cohnheim在1867年首次提出骨髓中存在有非造血实质细胞的干细胞，他在研究伤口修复时提出骨髓可能是纤维母细胞的来源。但直到20世纪60年代末期以后才有了直接的证据。Friedenstein等[1，2]将骨髓标本放入塑料培养皿中，4 h后倒掉非贴壁细胞，留下少量贴壁的细胞，其为梭形成纤维细胞样细胞、呈克隆生长，这些细胞能够克隆增殖并在体外分化成骨和软骨。根据以上特点，Friedenstein将这种细胞称为成纤维细胞集落形成单位（colony-forming units-fibroblastic，CFU－F）[3~5]。由于它们来自骨髓的支持结构，并且可以作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也被称为骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal cels，BMSC）[6]。Owen[7]认为骨髓基质细胞系统是伴随造血干细胞系统生长的，具有自我更新和多向分化能力，可以自我更新并分化为成纤维样细胞、网状细胞、脂肪细胞、成骨细胞等连接组织的细胞，由此提出了骨髓基质子细胞（marrow stromal stem cells）的概念。鉴于这些细胞都属于间充质系统细胞，所以又将其定义为间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）[8]。 以上这些名称实际是指同一种类型细胞，只是不同的名称强调了这种细胞某一方面的特征: 如果是重点考虑它可以分化为间叶组织，那么就称之为间充质干细胞；如果重点考虑它来源于骨髓的支持系统，那么又可以称之为基质干细胞。我们在这里统一称为MSCS。
2 骨髓间充质干细胞的分化潜能
骨髓间充质干细胞是一种重要的成体干细胞，有许多实验证明MSCs有多向分化能力，其中最经典的实验是Jiang和 Veffoillie发表在 Nature上的一篇文章[9]，实验将单个 MAPC（MSCs中的一个亚类）克隆增殖后，在体外能够诱导向内、中、外三个胚层组织分化，而且将带有GFP标记的单个 MSC用显微注射技术种植在小鼠的囊胚内，将囊胚移植到小鼠子宫内孕育，出生的小鼠体内的三个胚层组织中都可以检测到表达GFP和特定组织标志蛋白的细胞，有力地证实了MSCs的多向分化能力。不仅能分化出中胚层的骨、软骨、肌肉、肌位、脂肪、血管内皮等[10]，而且还令人惊奇地可以跨胚层横向分化（transdifferentiation）出内胚层的肝细胞[11]、肺泡上皮细胞[12]和外胚层的神经细胞[13]，由于MSCs的多向分化能力和传统的细胞生物学理论相矛盾，引起了极大的兴趣和争议。基于目前全世界不同的实验室有大量的实验结果支持MSCs具有多向分化能力，所以这种现象是比较可信的。
3 骨髓间充质干细胞与神经组织的修复
3.1 骨髓间充质干细胞向神经细胞分化
Aziz[14]将人MSCs细胞悬液注射到大鼠纹状体，72天后发现植入的细胞约有20％在大鼠脑中存活并迁移至其他脑区，迁移路径和神经干细胞及星形细胞的迁移路径相同，即广泛分布于脑中。移植的MSCs不再表达Ⅰ型胶原，纤维连接蛋白（fibronectin）的表达也明显降低，显示MSCs移植后失去骨髓基质细胞在培养中的典型特征而形成星形胶质细胞的许多特征。Kopen等[15]研究同样表明体外培养的骨髓基质细胞可在小鼠脑中存活并迁移，此外他认为脑组织中分泌的FGF-2能促进MSCs的增殖，分泌的神经营养因子能作用于MSCs的神经生长因子的受体NGFR，促进其向神经细胞分化。Prille等[16]用激光共聚焦显微镜观察GFP标记的MSCs移植到脑组织后的变化。实验显示l～6月时脑内的GFP阳性细胞较少，但移植15个月后发现小脑中有 GFP阳性的成熟的浦肯野细胞（purkinje cells），表达Y氨基丁酸（GABA）合成酶和谷氨酸脱氢酶，表明细胞中有神经递质的合成。Corti等[17]检测骨髓移植后移植细胞在脊髓內表达神经细胞表型的能力。实验将转染GFP基因的小鼠骨髓细胞通过尾静脉注射移植到放射线照射后的小鼠中，3个月后受体小鼠的外周血中70％的单核细胞GFP阳性，GFP细胞在脊髓内广泛分布于白质和灰质的血管周围以及软脑膜下，多数细胞表达小胶质细胞标志Mac-l和F4／80，少数细胞表达易形细胞标志GFAP和神经元标志NeuN，NF，Tujl。DNA指数分析表明以上双标细胞有一个细胞核，没有出现细胞核融合。此实验中，脊髓未受损伤，所以脊髓内移植的细胞数和表达神经细胞标志的细胞数较少。脊髓损伤后，由于血脑屏障的破坏和损伤局部环境的作用，向局部迁移的细胞数和表达神经细胞标志的细胞数将增多。
在体外MSCs分化成神经元的研究中, 只有一个研究提供了强有力证据证明体外诱导MSCs 分化的神经元具有功能活性。Kohyama J 等[18]用另外两种方法诱导骨髓MSCs分化成神经元。一种是诱导培养基含有10 mol/L 5－氮胞苷(5-azacyt idine, 5-A za-C) 神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、BDNF 和神经营养蛋白NT3。MSCs 被诱导96 h后, 培养基被换以添加了HLA-B27 的DMEDM /F 12 培养基, 其中也含有NGF、NT -3 和BDN F。另一种是使用神经
元诱导剂noggin。2 种方法都诱导骨髓MSCs 分化成神经元, 这些神经元形成轴突, 表达神经元特异的标记, 并开始对去极化刺激起反应, 表明MSCs 被有效地诱导成具有功能的神经元。
这些结果表明MSCs 经过诱导可以分化成神经细胞,并可获得成熟神经细胞的机能，而且由于MSCs 易增殖, 这样可以构成丰富、易获得而且是可以自体移植的细胞库来治疗许多种神经系统疾病。
3.2 骨髓间充质干细胞与神经损伤修复
发现MSCs能诱导成为神经细胞后，研究者就开始尝试用MSCs移植治疗脊髓损伤。Chopp等[19]用NYU法制作大鼠脊髓损伤模型，l周后将含 2．5
×1.05BrdU标记的MSCs细胞悬液 4 μl在5 min内注射到脊髓损伤中心处，对照组用PBS注射。用BBB（Bass－Beattie－Bresnehan）评分法分析脊髓功能恢复情况，术前正常值为21分，脊髓挫伤后为0~6分。对照组逐渐自然恢复到11.5分，但是到第3周后即为平台期，以后恢复缓慢。实验组注射MSCs4周后恢复到15.3分，而且未出现平台期，继续呈好转趋势，到4周时大鼠四肢运动协调，可支撑身体重量。免疫组化发现损伤脊髓移植MSCs后，脊髓室管膜细胞、胶质细胞和脉管系统表达Nestin增加，脊髓室管膜细胞由单层细胞增殖为多层细胞。免疫双标技术表明植入的MSCs表达神经元标志NeuN。Chopp分析MSCs植入促进脊髓损伤恢复可能的作用机制，认为一方面有可能移植的MSCs整合到神经组织并替代受损神经细胞，另一方面移植的MSCs被脊髓损伤后的局部微环境诱导，表达多种能促进神经恢复的因子，促进室管膜细胞等的增殖，增强脊髓的内源性的修复能力。
Koshizuka等[20]利用造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）移植治疗脊髓损伤，也取得了一定的效果。实验从骨髓中分离出Lin－cKit＋Sca-l造血干细胞，制作脊髓压迫损伤模型，l周后将10 000个HSCs注射到脊髓损伤中心，5周后小鼠后肢运动功能评分移植组为4.2，较对照组（＝2．9）增高。移植的HSCs表达O4（少突胶质细胞标志）、GFAP和nestin，没有表达神经元标志。移植的HSCs均为单个细胞核，没有和脊髓内的细胞发生融合。
有实验证明MSCs也可以在体外向雪旺细胞转化，移植到外周神径后可以修复神经病变。Sasaki等[21]将MSCs用β-ME诱导胚胎干细胞向神经细胞分化，实验发现未诱导的 MSCs表达少量P75和S-100，不表达GFAP和O4；诱导后的 MSCs呈现雪旺细胞样外形，表达 p75、S-100、GFAP和O4。实验将诱导后的MSCs和基质材料Mndgil混合，浓度为(l～2)×107/ml，注射到中空纤维管中，缝合到大鼠切断的坐骨神经上，3周后有神经纤维再生和髓鞘形成，有朗飞结和基底层（basa iaminae）形成，l周后神经纤维再生2.2 mm，3周后达到8～10 mm；用未诱导的 MSCs移植，3周神经纤维再生为2.5 mm；只用基质材料无神经再生。移植的MSCs表达GAP-43、髓鞘相关糖蛋白（myclin associated glycoprotein，MAG）和MBP。Cuevas等[22]也研究了MSCs移植到切断的坐骨神经后的作用。试验将大鼠的坐骨神经切断，然后立即缝合神经断端，在远端注射5 μl含50 000个MSCs的细胞悬液，单纯显微缝合未移植MSCs作为对照。术后18 d与术后
33 d移植组坐骨神经功能指数分别比对照组提高36％和78％。术后33 d对照组（共10只）中有7只出现不同程度的自残（autotomy）后脚、趾的感染和水肿，移植组无自残现象。移植组神经近、远断端间连接好，断端间出现纵向紧密排列的雪旺细胞样细胞，移植的细胞有5％表达S-100，并从移植处向周围迁移8 mm。由于雪旺细胞比较难以取材和纯化，在体外要扩增到适当的数量需10周时间，所以用 MSCs代替雪旺细胞移植治疗外周神经损伤有一定的适用价值。
4 展望
神经损伤后的修复一直是一个世界性难题。传统观点认为不论是中枢神经细胞还是周围神经的节细胞，在出生后都不能分裂增生，及为永久性细胞（permanent cells）。MSCs的发现开辟了神经修复领域的新纪元, 近期的研究已经证实了其在神经损伤修复中具有广阔的应用前景。虽然间充质干细胞具有优越的生物学特性和良好的增殖分化潜能, 动物模型试验和临床应用研究也取得了一定的效果。目前对MSCs的研究尚处于探索阶段, 还存在很多问题，有待进一步解决, 如对MSCs本身特性的研究, 如何提纯等等，尚需进一步研究。相信随着对MSCs研究的逐步深入, MSCs在神经系统损伤修复治疗中的应用前景将更广阔。
