关于TOPO和GATEWAY

Gateway实验方案TOPO® TA 克隆- 创建Gateway® 入门克隆∙步骤一–制备PCR 产物使用Taq 聚合酶和自己的方案生成PCR 产物。

通过最后7 到30 分钟的延伸步骤，结束PCR 反应。

步骤二- 进行TOPO® 克隆反应1. 按所示顺序使用试剂，以建立以下一种TOPO® 克隆反应。

对于电穿孔，将盐溶液稀释4 倍以制备稀释盐溶液。

试剂化学转染电穿孔法新鲜的PCR 产物0.5 至4 µl 0.5 至4 µl盐溶液 1 µl --稀释盐溶液-- 1 µl无菌水至终体积为 5 µl 至终体积为 5 µlTOPO® 载体 1 µl 1 µl总体积 6 µl 6 µl2. 轻轻混合并在室温下孵育5 分钟。

3. 置于冰上，然后开始转化One Shot® 化学感受态E. coli，步骤如下步骤三- 转化One Shot® 化学感受态 E. coli1. 每次转化时，解冻置于冰上的一小瓶One Shot® E. coli 细胞。

2. 在一小瓶One Shot® 化学感受态E. coli 中加入2 µl TOPO® 克隆反应液，轻轻混匀。

3. 在冰上孵育5 至30 分钟。

4. 将细胞置于42°C 下热休克30 秒，不振荡。

立即将试管转移至冰上。

5. 加入250 µl 室温S.O.C. 培养基。

6. 在37°C 下振荡孵育1 小时。

7. 在预热的LB 琼脂平板上涂布10-50 µl 细菌培养物（琼脂平板含有100 µg/ml 大观霉素），并于37°C 下过夜孵育。

Gateway® 反应的基础知识∙BP 反应从含有att B 侧翼序列的PCR 产物到生成Gateway® 入门克隆只需 1 小时的简单反应。

关于如何用ISA解决内网多个网段上网的问题/380503/271362一个公司里，可能会存在有多个网段，但也许你的外线只开通了一条，也没有什么高级的交换/路由设备，都是一些傻瓜型的，但公司会不定时的要你开通某某某计算机的外网，关闭某某某计算机的外网，它们又不在同一个网段，解决起来是不是有些麻烦呢？您是否遇到这种情况呢？下面我们用一台兼价机作为ISA SERVER，一台作为”软路由“，低价的解决这个问题。

TOPO图如下：实验目的：让192.168.0/8, 192.168.10/8 192.168.11/8都能够通过ISA服务器上网。

难点：因为ISA已有外网的网关，故不能再使用其它默认网关，它要如何把信息回传到10,11段的计算机呢？首先，我们要保证0,10,11三个网段的计算机是可以互访问。

由上图可以了解，上面用了一台计算机作为“软路由”，使这三个网段的计算机可以互相访问。

我们来试一下。

设客户端一计算机berlin，IP信息如下：可以看到，它属于11网段，且网关已指向11.254。

我们分别PING一个0，10两个网段的计算机我们发现，通讯是正常的。

这说明软路由“route”主机工作正常。

二，让ISA可以与内网的三个网段通讯我们先来试一下ISA的IP信息如下：我们发现，连向内网网卡(lan)的IP为：192.168.0.11，没有设网关。

外网IP通过PPPOE拨号得58.63.152.223，网关，怎么会是0.0.0.0呢？用route print查看它的默认网关这里我们可以看到，现在ISA的默认网关为：58.63.152.1，是WNA网卡拨号获得。

由上面的路由表可以表明，我们只能与内网0段，或与外网通信。

我们来试一下与三个段通信：（条件，ISA必须已设置许可“内网”与“主机”的通信）经测试证实，我们只能与内网的0网段通信，不能与10,11网段通信，原因很简单，因为我们的网关没有指向“route”（192.168.0.10），为什么不指向呢？因为我们要加接外网，需要外网的的网关，而WIN中不能同时使用两个“默认网关”，所以起作用的只有一个。

Gateway技术提供以下可能：通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间同时将您的基因转移到多个表达系统在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。

这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。

当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。

Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。

图1 Gateway技术的灵活性Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。

Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。

一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。

此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。

在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。

二、一项强大而可靠的技术Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。

一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。

Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。

BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。

BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。

LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。

LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。

分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。

Gateway™技术提供以下可能：∙通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间∙将您的基因转入到多个表达系统∙在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达Gateway™技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。

这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95％或更高。

当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。

Gateway™也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。

Gateway™利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。

一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您感兴趣的基因到Gateway™改造过的的各种表达载体（目的载体）。

此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆的测序担心。

在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。

图1-Gateway™技术的灵活性*目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。

一种强大而可靠的技术Gateway™技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。

一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。

Gateway™技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。

BP和LR两个反应就构成了Gateway™技术（表1和图2）。

BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。

LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。

LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。

Gateway™技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。

典型的效率是＞95％。

Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。

Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。

在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。

这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。

这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。

在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。

由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。

在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。

ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。

需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。

同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。

当需要将目的基因从入门载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。

实验方案Gateway® 反应的基本原理∙BP反应—构建Gatew ay® 入门克隆∙LR 反应—构建Gatew ay® 表达克隆∙一管模式—从PCR 产物构建Gatew ay® 表达克隆∙Gatew ay® 载体转化—将您喜爱的克隆载体转化成Gatew ay® 载体TOPO® TA 克隆- 创建Gateway® 入门克隆∙∙步骤一–制备PCR 产物使用Taq 聚合酶和自己的方案生成PCR 产物。

通过最后7 到30 分钟的延伸步骤，结束PCR 反应。

步骤二- 进行TOPO® 克隆反应1. 按所示顺序使用试剂，以建立以下一种TOPO® 克隆反应。

对于电穿孔，将盐溶液稀释 4 倍以制备稀释盐溶液。

试剂化学转染电穿孔法新鲜的PCR 产物0.5 至 4 µl 0.5 至 4 µl盐溶液 1 µl --稀释盐溶液-- 1 µl无菌水至终体积为 5 µl 至终体积为 5 µlTOPO® 载体 1 µl 1 µl总体积 6 µl 6 µl∙2. 轻轻混合并在室温下孵育 5 分钟。

3. 置于冰上，然后开始转化One Shot® 化学感受态 E. coli，步骤如下步骤三- 转化One Shot® 化学感受态E. coli1. 每次转化时，解冻置于冰上的一小瓶One Shot® E. coli 细胞。

2. 在一小瓶One Shot® 化学感受态E. coli 中加入 2 µl TOPO® 克隆反应液，轻轻混匀。

3. 在冰上孵育 5 至30 分钟。

4. 将细胞置于42°C 下热休克30 秒，不振荡。

立即将试管转移至冰上。

5. 加入250 µl 室温S.O.C. 培养基。

基于OPNET的低轨卫星星座通信系统仿真研究胡宸华;黄圣春;王玲;孟祥龙【摘要】基于OPNET搭建了一个低轨道卫星星座移动通信系统仿真平台,介绍了网络拓扑、节点模型、进程模型和无线链路模型的相关设计过程,并结合STK软件生成的极地圆轨道模型,对自主设计的一套低轨星座移动通信协议进行了验证.仿真结果表明,该平台能够正确模拟LEO星座通信系统中寻呼、建链等通信过程,以及长时延、频繁切换等卫星通信的特性,为低轨星座移动通信协议研究提供了有力支撑,可为卫星通信仿真工作提供借鉴和指导.【期刊名称】《通信技术》【年(卷),期】2018(051)010【总页数】7页(P2382-2388)【关键词】低轨卫星网络;通信协议;OPNET建模;无线链路【作者】胡宸华;黄圣春;王玲;孟祥龙【作者单位】湖南大学电气与信息工程学院,湖南长沙420082;国防科技大学电子科学学院,湖南长沙410073;湖南大学电气与信息工程学院,湖南长沙420082;海军潜艇学院,山东青岛266199【正文语种】中文【中图分类】TN927+.230 引言低轨道（Low Earth Orbit，LEO）卫星星座移动通信系统在军用和民用上都具有重大意义，是“一带一路”等国家战略中不可或缺的一环。

相比国外低轨卫星移动通信的高速发展，国内的LEO通信系统建设刚刚起步[1]。

通过软件仿真进行验证测试，对LEO星座移动通信系统建设具有重要的指导意义。

OPNET是一款主流的通信仿真软件，拥有丰富的无线网络和有线网络仿真模型，但在卫星仿真上却缺少相关功能模块[2-3]。

当前，基于OPNET的LEO网络仿真大多基于固定的卫星节点，甚至用有线节点来模拟低轨卫星通信，没有根据LEO卫星高速运动的特点来真实反映卫星通信链路和服务卫星的切换过程[4-5]。

本文旨在对OPNET环境下的LEO通信系统搭建过程进行分析，为低轨卫星移动通信协议设计的仿真验证工作提供支撑。