抗病毒的转基因植物

热带作物学报2024, 45(4): 837 846Chinese Journal of Tropical Crops基因沉默番木瓜环斑病毒复制酶基因（PRSV-Nib）获得抗病毒病番木瓜的研究吴清铧1,2，贾瑞宗2*，郭静远2，杨牧之2，胡玉娟2，郝志刚2，赵辉2**，郭安平2** 1. 海南大学热带作物学院，海南海口 570228；2. 海南省南繁生物安全与分子育种重点实验室/中国热带农业科学院三亚研究院/中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南三亚 572024摘要：番木瓜是重要的热带经济水果。

番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus, PRSV）是番木瓜的重要病毒病，经常导致严重的产量损失和质量恶化。

自从1998年第一例转基因番木瓜问世以来，使得基于“致病菌衍生的抗病性（pathogen-derived resistance, PDR）”的抗病育种策略获得成功广泛应用。

然而依赖于序列同源性的抗病性与病毒突变导致多样性增加之间的矛盾成为番木瓜育种科学家的新挑战。

本研究拟采用RNAi策略针对复制酶（nuclear inclusion b. Nib）获得广谱抗PRSV番木瓜新种质。

通过团队已建立的胚性愈伤诱导-农杆菌介导转化-再生苗诱导的番木瓜遗传转化体系，共获得经过抗性筛选的再生苗52株，通过特异性PCR进行筛选共计获得24株转基因阳性植株。

通过对T0代田间自然发病试验中，转基因番木瓜株系抗病性明显高于非转基因对照，其中NibB5-2田间抗病性最优。

通过hi TAIL-PCR方法确定NibB5-2插入位点位于第2号染色体supercontig_30的1976766的位置。

T1代接种试验中，无病毒积累且无发病症状，初步确认具有良好的病毒抗性，为番木瓜抗病育种提供新思路。

关键词：番木瓜；番木瓜环斑病毒；Nib基因；RNA介导的病毒抗性中图分类号：S436.67 文献标志码：AGene Silencing of Papaya ringspot virus Replicase Gene (PRSV-Nib) to Obtain Virus Resistant PapayaWU Qinghua1,2, JIA Ruizong2*, GUO Jingyuan2, YANG Muzhi2, HU Yujuan2, HAO Zhigang2, ZHAO Hui2**, GUO Anping2**1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China;2. Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitor-ing and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions / Sanya Research Institutey, Chinese Academy of Tropical Agri-cultural Sciences / Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Sanya, Hainan 572024, ChinaAbstract: Papaya is an economically important tropical fruit. Papaya ringspot virus (PRSV) is an important virus dis-ease of papaya, often causing significant yield losses and quality deterioration. Since the introduction of the first trans-genic papaya in 1998, PDR-based breeding strategies for disease resistance have been successfully applied. The contra-diction between disease resistance based on sequence homology and increased virus genetic diversity became a new challenge for papaya breeding. In this study, we propose to use RNAi strategies aim at nuclear inclusion b gene (Nib) to obtain broad-spectrum resistance to PRSV papaya. With optimized embryo callus generation-Agrobatium meidated transformation-shoot regeneration, 52 shoots were obtained after resistance screening and a total of 24 transgenic posi-tive shoots were obtained by specific PCR screening for the T0 generation. In the T0 generation field natural disease test, 收稿日期 2022-12-16；修回日期 2023-02-15基金项目 海南省重大科技计划项目（No. ZDKJ202002）；海南省重点研发计划项目（No. ZDYF2022XDNY257）；崖州湾科技城菁英人才项目（No. SCKJ-JYRC-2022-67）。

抗病毒转基因植物。

植物病毒病害已成为植物病害的最大类群之一，随着基因工程技术的发展，为培育抗病毒的植物品种开辟了新的途径。

目前已有多种方法获得抗病毒转基因植物。

利用植物自身编码的抗病毒基因培育抗病毒植物。

许多植物对病毒具有天然的抗性，将这些基因克隆并转化到其他植物中，可使转化的植物获得抗病毒的能力。

已报道在植物中有几种基因，其编码的蛋白具有抗病毒的功能。

商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein，PAP)是存在于商陆叶片细胞中的一种小分子糖蛋白，它可以抑制病毒蛋白的活性，具有广谱抗病毒能力。

Lodge等将编码PAP蛋白的基因转移到烟草中，获得的转化株能抵抗多种病毒的侵染。

病毒侵染植物时，植物会产生过敏性坏死斑，而过敏性坏死斑的形成是由植物内一种称为N基因表达的结果。

多数过敏性坏死斑反应是由单个基因控制，将N基因转移到番茄中，获得的转基因番茄对烟草花叶病毒（TMV）表现了强烈的过敏反应。

此外，植物病程相关蛋白pathogenesis-related protein，PR蛋白)对病毒也表现了一定的抗性，它是植物受到病毒袭击或其他因子影响后产生的一种蛋白，它可能参与植物细胞壁的抗侵染作用。

病毒外壳蛋白转基因植物。

病毒外壳蛋白(coat protein，CP)转基因植株抗病毒的机制有两种观点：其一是认为将病毒外壳蛋白基因转移到植物细胞后，转化株内CP基因表达的蛋白能将入侵病毒裸露的核酸包裹，从而阻止入侵病毒核酸的翻译和复制；其二是认为CP基因的表达可抑制入侵病毒的脱壳，从而抑制病毒的繁殖。

自1986年Beachy等将TMV外壳蛋白基因转移到烟草后，至今已有30多种植物病毒的CP基因转移到烟草等十多种双子叶植物中，并获得了抗性强弱不等的转基因植株，某些转基因植物已释放到大田中，取得了明显的经济效益。

如Monsanto公司将TMV的CP基因转移到番茄中，转基因植株的接种后发病率小于5％，产量几乎不受影响；而对照株发病率为100％，果实减产26％—35％。

一、实验背景随着科学技术的不断发展，转基因技术在农业领域的应用越来越广泛。

白菜作为我国重要的蔬菜作物之一，其转基因研究对于提高产量、改善品质、增强抗病性等方面具有重要意义。

本实验旨在通过农杆菌介导法将抗病毒基因导入白菜，探究转基因白菜在抗病毒性方面的表现。

二、实验材料与方法1. 实验材料- 白菜（Brassica rapa ssp. chinensis）：取材于本地种植的结球白菜。

- 农杆菌：选择含有Ti质粒的根癌农杆菌C58。

- 抗病毒基因：TuMV-NIa及LMV-CP。

- 植物激素：6-BA、NAA、AgNO3。

2. 实验方法1. 基因转化1.1 准备农杆菌：将根癌农杆菌C58在含有卡那霉素的YEB培养基中培养至对数生长期。

1.2 制备外植体：取白菜叶片，用70%酒精消毒后，用无菌水清洗3次，再将其切成小块。

1.3 共培养：将外植体与农杆菌混合，共培养于含有植物激素的培养基上，共培养时间为2-3天。

1.4 诱导再生：将共培养后的外植体转入含有植物激素的再生培养基中，诱导其再生。

1.5 抗性筛选：将再生植株转入含有抗生素的培养基中，筛选出阳性植株。

2. 分子鉴定2.1 PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。

2.2 Southern blot检测：将转基因植株DNA进行 Southern blot，检测目的基因是否整合到植物基因组中。

3. 抗病毒性检测3.1 人工接种：将转基因植株和对照植株分别接种TuMV和LMV病毒。

3.2 观察记录：观察记录植株发病情况，比较转基因植株和对照植株的抗病毒性。

三、实验结果1. 基因转化通过共培养和诱导再生，成功获得转基因白菜植株。

2. 分子鉴定PCR和Southern blot检测结果均显示，目的基因已成功导入白菜基因组中。

3. 抗病毒性检测与对照植株相比，转基因植株在接种TuMV和LMV病毒后，发病率明显降低，表现出较强的抗病毒性。

转基因作物种类转基因作物是通过基因工程技术将外源基因导入植物细胞中，使植物获得新的性状或改善原有性状的作物。

目前，转基因作物已经涉及到多个作物品种，下面将介绍几种常见的转基因作物。

1. 转基因水稻转基因水稻是通过将抗虫基因或抗病基因导入水稻中，使其具备抗虫抗病的能力。

例如，转基因水稻Bt水稻，它导入了一种来自于一种土壤杆菌的基因，使其在体内产生杀虫蛋白，可以抵抗水稻螟等害虫的侵害。

此外，还有抗病毒的转基因水稻，通过导入病毒抗性基因，使水稻免受病毒感染。

2. 转基因玉米转基因玉米主要是为了提高其抗虫能力和耐逆性。

例如，Bt玉米是通过导入一种来自于一种土壤杆菌的基因，使其在体内产生杀虫蛋白，可以有效抵抗玉米螟等害虫的侵害。

此外，转基因玉米还可以导入耐干旱、耐盐碱等基因，提高其耐逆性，适应恶劣环境的生长。

3. 转基因大豆转基因大豆主要是为了提高其抗除草剂的能力，例如，转基因大豆RR大豆，导入了抗除草剂的基因，使其具备对一种广谱除草剂——草甘膦的耐受性，可以在施用该除草剂后存活，有效控制杂草的生长。

4. 转基因棉花转基因棉花主要是为了提高其抗虫能力和耐逆性。

例如，Bt棉花是通过导入一种来自于一种土壤杆菌的基因，使其在体内产生杀虫蛋白，可以有效抵抗棉铃虫等害虫的侵害。

此外，转基因棉花还可以导入耐干旱、耐盐碱等基因，提高其耐逆性，适应恶劣环境的生长。

5. 转基因番茄转基因番茄主要是为了提高其抗病能力和延长果实的保鲜期。

例如，转基因番茄可以导入抗病毒的基因，提高其抵抗病毒的能力。

此外，还可以导入一种叫做多糖酶的基因，使番茄果实在采摘后保鲜期延长，减少果实腐烂的情况。

以上只是转基因作物中的几种常见种类的简要介绍，除了上述作物，还有转基因马铃薯、转基因小麦等。

转基因作物的研发和种植在农业生产中起到了重要的作用，可以提高作物的产量和质量，减少农药的使用量，增加农民的收益。

但同时也需要加强对转基因作物的监管和评估，确保其对环境和人类健康的安全。

转基因生物种类汇集一览基本证实转基因生物种类一、转基因植物种类1、转基因树木：桉树（速生桉）；741抗虫杨树；双抗烟草花叶病毒(TMV)；2、转基因五谷：转基因水稻种：湖北的华恢1号、BT汕优63；转基因玉米种：转植酸酶基因玉米BVLA430101、NK603玉米、MON810玉米、先正达Bt－176、“先玉335”玉米、“星联”转基因玉米；“迪卡007”玉米；转基因小麦种：特优转基因9506小麦；转基因大豆种：Roundup Ready soybean (RR大豆)……；3、转基因棉花：转基因棉花种：抗虫棉33b、以及抗虫棉33b为基础研制的数百种甚至上千种。

主要都是转Cry1A基因、转Cry1Ac、转Cry1A和CpTI基因为主……；4、转基因蔬菜种：华农1号木瓜、夏威夷木瓜、延熟番茄、抗甲虫马铃薯、抗病毒病的南瓜和西葫芦、“华番l号”番茄、转基因抗黄瓜花叶病毒番茄“8805R”、甜椒“双丰R”、美国的转基因抗病毒南瓜“FreedomII”、北大的转基因抗黄瓜花叶病毒(CMV)的番茄“8805R”、转基因抗芜菁花叶病毒(TuMV)的大白菜“福山大包头”、转基因抗西瓜花叶病毒(WMV)的西瓜、黄瓜花叶病毒(CMV)的“农大40”辣椒及“湘研1号” 辣椒、“189”番茄、“布利塔”茄子已进行转基因研究的蔬菜有：甜瓜、彩椒、甜椒、胡萝卜、甘蓝、花椰菜、生菜、菠菜、茴香、豌豆、石刁柏、芥菜、洋葱、小白菜、高粱、油菜、豇豆、甜菜、紫番薯……5、转基因水果种类：苹果、柑橘、梨、木瓜、香蕉、哈密瓜、草莓、圣女番茄、葡萄、弥猴桃、樱桃、菊苣、6、转基因观赏花种类：牵牛花、蓝玖瑰、万寿菊、向阳葵、珍珠红、金球、红金铃、裸女花……转基因花卉品种介绍：A．中文名称，向阳葵；英文名称：HUKSACHS 树高：5米--7米；花色，黄色，众多的小黄花组成大黄球，初夏开始很象向日葵，渐渐形成黄球状，适应：花园、校园、庭院、街道。

在抗病毒转基因植物中，为什么使用病毒外壳蛋白基因可
以抗病毒侵染？
关于病毒外壳蛋白（coat protein，CP）基因导入植物后的抗病毒机理，目前有几种假说。

一种假说认为：CP基因在植物细胞内表达积累后，当入侵的病毒裸露核酸进入植物细胞后，会立即被这些外壳蛋白重新包裹，从而阻止病毒核酸分子的复制和翻译。

另一种假说认为：植物细胞内积累的病毒外壳蛋白会抑制病毒脱除外壳，使病毒核酸分子不能释放出来。

然而最近的研究表明，如果将病毒的外壳蛋白的AUG起始密码缺失，使之不能被翻译，或者将外壳蛋白基因变成反义RNA基因，整合到植物细胞染色体上，转基因植物则有很好的抗性。

因此，有人认为抗性机理不是外壳蛋白在起作用，而是CP基因转录出RNA后，与入侵病毒RNA之间的相互作用起到了抗性作用。

利用CP介导的抗病毒性还存在一些问题：①转基因植物对病毒的抗性有局限性，仅限于特定的病毒（被使用CP基因的病毒）或密切相关的病毒；②转基因植物大多数只是发病延缓，一般为两周，并非根治；③潜在着植物表达的外壳蛋白包被与另一种病毒形成新的杂合病毒的危险。

专题1 §1.3 基因工程的应用知识目标：举例说出基因工程应用及取得的丰硕成果。

能力目标：关注基因工程的进展，认同基因工程的应用促进生产力的提高。

学习重点：基因工程在农业和医疗等方面的应用。

学习难点：基因治疗。

预习导学：一、植物基因工程的成果植物基因工程技术主要用于提高农作物的能力、以及改良农作物的和利用植物产生等方面。

（一）抗虫转基因植物1、杀虫基因：、、、。

2、成果：抗虫植物如水稻、棉、玉米、马铃薯、番茄等。

3、好处：减轻、有利人类、可以降低生产等。

练习：转基因抗虫棉可以有效地用于棉铃虫的也应当。

在大田中种植转基因抗虫棉的同时，间隔种植少量非转基因的棉花或其他作物，供棉铃虫取食。

这种做法的主要目的是（）A、维持棉田物种多样性B、减缓棉铃虫抗性基因频率增加的速度C、使食虫鸟有虫可食D、维持棉田生态系统中的能量流动（二）抗病转基因植物1、病原微生物：、、等。

2、抗病基因种类：（1）抗病毒基因：、等。

（2）抗真菌基因：、等。

3、成果：抗烟草花叶病毒的转基因烟草和抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄等。

（三）抗逆转基因植物1、抗逆基因：调节细胞的基因使作物抗碱、抗旱；鱼的使作物耐寒能力提高；使作物抗除草剂等。

2、成果：具抗寒能力的烟草、番茄，具抗除草剂的大豆、玉米等。

练习：为了培育节水高产品种，科学家将大麦中与抗旱节水有关的基因导入小麦，其水分利用率提高了20％。

这项技术的遗传学原理是（）A．基因突变 B．基因重组 C．基因复制 D．基因分离（四）利用转基因改良植物品质1、优良基因：必需氨基酸的蛋白质编码基因、控制番茄果实成熟的基因和植物花青素代谢有关的基因等。

2、成果：转基因玉米、转基因延熟番茄、转基因矮牵牛花等。

二、动物基因工程的成果（一）提高动物的生长速度1、生长基因：外源基因2、成果：转基因绵羊、转基因鲤鱼等。

（二）改善畜产品的品质1、优良基因：肠基因。

2、成果：转基因奶牛分泌的牛奶中减少。

第3节基因工程的应用一、基因工程在农牧业方面的应用1．转基因抗虫植物(1)方法：从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物。

(2)成果：转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。

2．转基因抗病植物(1)背景：许多栽培作物由于自身缺少抗病基因，因此用常规育种的方法很难培育出抗病新品种。

(2)方法：将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物，培育出转基因抗病植物。

(3)成果：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。

3．转基因抗除草剂植物(1)背景：杂草常常危害农业生产，而大多数除草剂不仅能杀死田间杂草，还会损伤作物，导致作物减产。

(2)方法：将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。

(3)成果：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。

4．改良植物的品质优良基因成果必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因富含赖氨酸的转基因玉米与植物花青素代谢有关的基因转基因矮牵牛5.提高动物的生长速率(1)基因：外源生长激素基因。

(2)成果：转基因鲤鱼。

6．改善畜产品的品质(1)基因：肠乳糖酶基因。

(2)成果：转基因牛分泌的乳汁中，乳糖含量大大降低，而其他营养成分不受影响。

(1)转基因抗虫棉的Bt抗虫蛋白基因能抗病毒、细菌、真菌()(2)“转基因植物”是指植物体细胞中出现了新基因的植物()答案(1)×(2)×1．从环境保护角度出发，分析转基因抗虫棉与普通棉相比在害虫防治方面的优越性。

提示减少了化学农药的使用量，降低了环境污染。

2．种植转基因抗虫棉若干年后，害虫会不会对转基因抗虫棉产生抗性？为什么？提示会；害虫会因遗传物质发生改变产生对转基因抗虫棉的抗性。

二、基因工程在医药卫生领域的应用1．利用微生物或动植物细胞生产药物成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。

2．利用哺乳动物生产药物(1)方法：将药用蛋白基因和乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由该受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物。