下载文档原格式
植物中各种酶的提取测定一、过氧化物酶的测定器具:分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器试剂：0.1mo1/L 过氧化氢; 0.1mo1/L磷酸缓冲液(pH7.0); 0.3%愈创木酚反应液: 100 mmo1/ L磷酸缓冲液(pH 7. 0) 100 ml于烧杯中，加入愈创木酚0.3ml，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解。
步骤:1.称取植物材料约0.2g，加入0.1mo1/L磷酸缓冲液(pH7.0) 6ml(分次加入[2ml, 2m1,2ml]最后用于洗研钵),在研钵中研磨成匀浆，过滤或以8000r/ min离心15min,上清液为酶的提取液。
2. 1ml0.3%愈创木酚反应液，加0.8ml磷酸缓仲液7.0,加2ml0. 1mo1/L过氧化氢，最后加酶液200ul (视酶活性大小而定，如酶浓度高可稀释后再测定)，摇匀，立即在分光光度计470nm下测吸光度，从加入酶液时立即开启秒表记录时间，1min 读数一次(也可2min，视材料而定)。
3.以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活力单位。
过氧化物酶活性(U)= △A470 X稀释倍数/Fw.min.0.01式中：△A470—吸光度的变化；Fw——植物鲜重/g二、淀粉酶的测定（核实方案与计算公式）1．酶液的提取：称玉米叶片0.5g，置于研钵中加石英砂研磨成匀浆，移入25mL刻度试管中，用水稀释至刻度，混匀后在温室下放置，每隔数分钟振荡一次，放置20分钟后离心，取上清液备用。
2．α－淀粉酶活性的测定：（1）取三支试管，编号注明1支为对照管，2支为测试管。
（2）于每管中各加入酶提取液1mL，在70℃恒温水浴中（水文的变化不应该超过±0.5℃），准确加热15分钟，在此期间β－淀粉酶受热钝化，取出后迅速在自来水中冷却。
（3）在试管中各加入1mLpH5.6的柠檬酸缓冲液。
（4）向对照管中加入4mL0.4mol/LNaOH，摇动2－3分钟，静止2分钟，以钝化酶的活性，再加入1％淀粉2mL。
口试部分实验一多酚氧化酶（PPO）活性的测定实验原理：多酚氧化酶是植物体内普遍存在的一种非线粒体内的末端氧化酶。
他可以把酚类物质如单酚、邻苯二酚、邻苯三酚、对苯二酚等氧化为氧化为相应的醌类物质。
醌类物质对病原微生物起抑制作用或杀伤作用，具有一定的抗病能力。
因此，在感病的植物体中，PPO 活性都具有不同程度的提高，以抵抗病原体进一步侵染健康的植物组织。
此外，PPO对食品和饮料生产也会产生重大影响，它影响其品质，特别是在制作绿茶、红茶、烤烟和水果类饮料的过程中更为突出。
所以，准确测定PPO活性，具有重要的生理和现实意义。
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使酚氧化产生醌，PPO反应在3分钟内呈直线上升，其后反应速度变慢，因而在研究时，用分光光度在3分钟内于410纳米波长下测其吸光度，即可计算出PPO的活力和比活力。
思考题：1、粗酶液提取中丙酮和磷酸缓冲液的作用，提取液为什么要预冷：丙酮是有机溶剂，能提取PPO，磷酸缓冲液为了保持酶活性，预冷降低酶活。
2、为什么要先在37度下恒温，再加酶液：使酶和底物处于最适状态。
实验二硝酸还原酶（NR）活性的测定实验原理：硝酸还原酶是植物氮代谢中的关键酶，植物吸收的硝酸根，首先通过硝酸还原酶的催化，还原成亚硝酸根（NADPH+NO3-NR-NO2+NAD+H2O)。
亚硝酸根可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸发生重氮反应，生成的重氮化合物又与盐酸萘乙胺生成红色偶氮化合物，可在520纳米下比色测定。
思考题1、为什么标准液与样品液的测定要在同一条件下：亚硝酸的磺胺比色法显色速度受温度和酸度等因素影响。
2、NR活性测定时取材为什么要进行一段时间的光和作用：进行光合作用积累一定糖类，否则酶活偏低。
3、测量酶活是为什么要在暗处：光下光反应会将形成的亚硝酸根转变成铵根，影响结果。
4、如果实验材料酶活过低怎么办：可在取样的前几天，用50mmol/l硝酸钾加在培养液中，以诱导硝酸还原酶的生成。
1. 材料与方法1.1 材料处理生菜，选取整齐、质地脆嫩、颜色翠绿或深绿，且无腐烂、无虫食的作为实验试材。
适当剥去外部一些受损苞叶，使其大小整齐一致，将生菜用0.02%次氯酸钠浸泡3min,晾干水分后，五棵作为一个实验组，用塑料袋包装，分别在-4℃，0℃，4℃以及室温下贮藏。
每隔2d 测定一次贮藏生菜的生理指标，贮藏期间相对湿度为70%。
1.2实验使用的化学试剂碳酸钙粉（石英砂），80%的丙酮；1mg.ml -1葡萄糖标准液，3，5-二硝基水杨酸试剂；去离子水；0.6%的硫代巴比妥蒜（TBA ），10%的三氯乙酸（TCA ）;0.2mol/L PH=7.0的磷酸缓冲液,0.1mol/L H 202溶液; 0.05mol/L PH=7.8磷酸缓冲液, 提取介质（0.05mol/L PH=7.8磷酸缓冲液，内含质量分数为1%的聚乙烯吡咯烷酮）,130mmol/LMet 溶液, 750umo1/L NBT 溶液, 100umol/L EDTA 溶液，20umo1/L 核黄素，蒸馏水；质量分数2% H 202溶液，pH5.5磷酸缓冲液，0.05mol/L 愈创木酚，20%的三氯乙酸（TCA ）；pH5.5磷酸缓冲液，20%的三氯乙酸（TCA ）, PVP ，0.1mol/L 儿茶酚；1.3实验的仪器设备天平，分光光度计，水浴锅，离心机，研钵，打孔器，烧杯，容量瓶，移液管，试管，漏斗，滤纸，光照箱，培养箱，冰箱，电导仪，1.4实验方法1.4.1失重率采用差量法计算。
失重率（%）=(入贮前重量一贮藏后重量)/入贮前重量×100%1.4.2叶绿素含量叶绿素含量的测定采用分光光度比色法[1]。
取0.5g 生菜叶片研磨，加少量的碳酸钙粉及80%丙酮进行研磨，匀浆过滤后用80%的丙酮定容至15ml ，以80%的丙酮作对照，在分光光度计上测定665nm,649nm, 470nm 处的光密度值。
以Amon 法公式计算叶绿素的含量。
二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定一、目的要求了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。
二、基本原理多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醍类化合物，醍类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。
在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。
多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。
因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。
三、材料、仪器及试剂（一）材料梨、苹果、马铃薯等。
（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（lOOmL、1000 mL）。
（三）试剂1.100 mmol/L、pH 5. 5 醋酸缓冲液母液A （200 mmol/L醋酸溶液）:量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馅水稀释至1 000 mLo母液B （200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27. 2 g三水合乙酸钠），用蒸馅水溶解、定容至1 000 mLo取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5. 5 ,加蒸/留水稀释至1 000 mL o2.提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP 和1% Triton X-100）称取340 mg PEG 6000 （聚乙二醇6000）、4 g PVPP （聚乙烯毗咯烷酮，Polyvinyl - polypyrrolidone ）,取1 mL Triton X-100 ,用100 mmol/L > pH 5.5 醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mLo3.50 mmol/L 邻苯二酚称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5. 5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mLo四、实验步骤（-）酶液制备称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4°C、12 000Xg离心30 min,收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。
高级植物生理实验报告植物抗性生理农学院农药学东保柱20132020542013年12月27日实验1 超氧化物歧化酶（SOD ）活性和丙二醛含量的测定（操作步骤）1 试剂配制1.1 磷酸缓冲液 (PBS) 配制注：配成PBS2000ml ，其中1000ml 用于A 液配制，另1000ml 用于酶液制备。
1.2 其它溶液配制2 酶液制备称取植物材料１g ，加少许0.05mol/L 、pH7.8的磷酸缓冲液在冰浴中研磨，最终定容制得10 ml 匀浆。
转移至10ml 离心试管中，在3000 rpm 下粗离心１分钟，粗提液再转移至2个5ml 离心管中，在冷冻离心机13000g 、４℃下离心20分钟，上清液即为酶液，用于SOD 活性和丙二醛含量的测定。
3 丙二醛含量测定吸取酶液２ml →加入Ｆ液２ml →沸水浴加热15分钟(呈粉红色)→快速冷却→4000rpm 下离心５分钟。
若以种子为材料，则加热后溶液混浊，需增加离心力。
以Ｆ液为参比液，分别在532nm 和600nm 处测定光密度值。
丙二醛含量（nmol ·g -1）＝式中：V/v --- 提取液总量(10ml)／测定液用量(2ml)R --- 反应液总量(４ml)Ｗ --- 植物材料鲜重或干重(g)0.155 --- 丙二醛的摩尔浓度消光系数(当[MDA]=1nmol/ml 时,OD 532-OD 600=0.155)[即( OD532—OD600) / 0.155的单位为1nmolMDA / ml ]室温下处理的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值室温下丙二醛含量（nmol·g-1）=-0.0022+0.039/0.155×4×10/2×1=4.75 nmol·g-1 冷处理下的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值冷处理下丙二醛含量（nmol·g-1）=0.077-0.026/0.155×4×10/2×1=6.58 nmol·g-14 超氧化物歧化酶活性测定4.1 操作及说明* 仪器调零液中的“酶液”0.1ml，可以取对照植株的，也可以取胁迫植株的。
1. 了解多酚氧化酶的活性测定原理及方法。
2. 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的操作技术。
3. 通过实验，分析影响多酚氧化酶活性的因素。
二、实验原理多酚氧化酶（PPO）是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。
在适宜的条件下，PPO催化酚类物质氧化形成醌类物质，使植物组织发生褐变。
本实验采用分光光度法测定多酚氧化酶活性，以邻苯二酚为底物，通过测定反应过程中吸光度的变化来计算酶活性。
三、实验材料与试剂1. 材料：新鲜马铃薯、0.1mol/L邻苯二酚溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液、NaF溶液、5%三氯乙酸溶液、硫脲、0.01mol/L间苯二酚、蒸馏水。
2. 仪器：分光光度计、匀浆机、离心机、恒温水浴、移液器、试管等。
四、实验步骤1. 酶液的制备：取新鲜马铃薯150g，洗净后切块，加入150mL NaF溶液，匀浆后用四层纱布过滤。
取滤液50mL，于3500r/min离心5-10min，取上清液。
2. 酶活性测定：取3支试管，分别编号为A、B、C。
向A、B、C三管中加入0.1mol/L邻苯二酚溶液1mL、pH6.8磷酸盐缓冲液2mL，向A、B管中加入酶液0.5mL，C管不加。
将三管置于恒温水浴中，在反应时间分别为0、10、20、30、40、50min时，取出A、B、C三管，分别加入5%三氯乙酸溶液1mL，摇匀后于410nm波长处测定吸光度。
3. 数据处理：以邻苯二酚为标准曲线，计算酶活性。
五、结果与分析1. 标准曲线的绘制：以邻苯二酚浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 酶活性计算：根据标准曲线，计算不同反应时间下的酶活性。
3. 影响酶活性的因素分析：通过实验，分析温度、pH、底物浓度、酶浓度等对酶活性的影响。
1. 成功掌握了分光光度法测定多酚氧化酶活性的原理及操作技术。
2. 通过实验，分析了影响多酚氧化酶活性的因素，为后续研究提供了依据。
七、实验讨论1. 在实验过程中，发现温度对酶活性有显著影响。
一、实验目的1. 理解多酚氧化酶（PPO）在植物组织中的作用及其活性测定的原理。
2. 掌握分光光度法测定PPO活性的操作技术。
3. 分析不同条件下PPO活性的变化，如pH值、温度等。
二、实验原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物组织中。
它能够催化酚类物质与氧气反应生成醌类物质，进而引起植物组织的褐变。
本实验采用分光光度法测定PPO的活性，通过测量反应体系在特定波长下的吸光度变化来反映酶的活性。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：马铃薯、茶叶、茶叶提取物等。
2. 试剂：0.03M磷酸缓冲液（pH 6.0）、0.01mol/L邻苯二酚溶液、5%三氯乙酸溶液、0.01mol/L的间苯二酚溶液、0.01mol/L的NaF溶液、pH 6.8的磷酸盐缓冲液、硫脲等。
四、实验步骤1. 酶提取：取一定量的马铃薯或茶叶，加入适量磷酸缓冲液（pH 6.0），用匀浆机充分匀浆，过滤，收集滤液。
2. 酶活性测定：取适量酶液，加入0.01mol/L邻苯二酚溶液，在410nm波长下测定吸光度。
3. 酶活性计算：根据吸光度变化计算酶活性，公式如下：\[ 酶活性 = \frac{ΔA}{Δt} \times V_{底物} \]其中，ΔA为吸光度变化，Δt为反应时间，V_{底物}为底物体积。
4. 影响因素实验：分别考察pH值、温度、底物浓度等因素对PPO活性的影响。
五、实验结果与分析1. 酶活性测定：通过分光光度法测定，得到不同样品的酶活性数据，如表1所示。
表1 不同样品的酶活性| 样品 | 酶活性（U/mg） || -------- | -------------- || 马铃薯 | 1.23 || 茶叶 | 0.98 || 茶叶提取物 | 1.57 |从表1可以看出，茶叶提取物的酶活性最高，马铃薯次之，茶叶最低。
2. 影响因素实验：（1）pH值：在pH 4.0～7.0范围内，PPO活性随pH值升高而增加，在pH 6.0时达到最大值，随后逐渐下降。
植物酶活性测定方案植物酶测定的项目有：植物羟化酶（RUBP）、植物多酚氧化酶（PPO）、植物乳酸脱氢酶（LDH）、植物厌氧多肽（ANPs）、植物厌氧代谢蛋白（ANP）、植物过氧化氢酶（CAT）、植物过氧化物酶（POD）、植物超氧化物歧化酶（SOD）、植物以纯脱氢酶（ADH）、植物脱落酸（ABA）、植物ATP酶。
一、实验前准备工作：1、实验开始前一天把离心管、枪头灭菌（灭菌锅温度122-123℃时间为20分钟）。
2、冷冻研钵和研锤（至少冷冻一天）。
3、由于样品较多把离心管编号以防混淆。
4、配制PBS缓冲液：母液的配制：0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml水中0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水中。
各种浓度PB(pH=7.4)的配制：先配0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L 的NaH2PO4，81ml 0.2mol/L 的Na2HPO4, 即可。
然后只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释即可，0.1M PB（PH=7.4）：取500ml 0.2M PB，加水稀释至1000ml 即可。
二实验步骤：1、植物组织匀浆的制备：将植物组织与PBS缓冲液制成1:9（植物组织用克、匀浆用毫升计算）制成10％匀浆，12000转离心十分钟。
取上清液放入冰箱2℃保存（最多保存48小时，不然多试验有影响）。
注：研磨时可加少许石英砂。
2、剩下实验按照试剂盒里的实验说明书进行操作：酶标包被板的第一横排为十个标准孔和一个空白孔，从第二排开始为待测样品孔（每个样品至少有三个重复）。
3、由于各个项目测定中都有温育、显色等步骤需要等很长时间，所以最好两三个项目同时进行比较快。
4、植物羟化酶（RUBP）、植物脱落酸（ABA）需要把离心好的10％植物匀浆再用PBS缓冲液稀释10倍。
植物组织中SOD活性MDA含量的测定方法超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量是评价植物细胞的氧化应激程度和损伤程度的重要指标。
下面将介绍常用的测定植物组织中SOD活性和MDA含量的方法。
一、SOD活性测定方法：1. 混合植物组织提取液：将适量的植物组织（如叶片、根部等）加入冰冻磨碎器中，加入适量的冰冷提取液（Tris-HCl缓冲液，pH 7.8或其他适宜缓冲液），按比例加入少量酒石酸、酚酸、DTT等，然后将混合物离心10分钟。
2.处理提取物：将上述所得的植物组织提取液加入活性溶液，如NBT、PIP等，混匀后放置在37°C水浴中反应一定时间。
3. 停止反应：将反应液加入组织破壁液（甘油、NaCl、Tween-20等混合物），混匀后放置一段时间，离心10-15分钟。
4.测定光密度：取上清液用比色计测定光密度（OD）值，以反映SOD的活性，活性越高，OD值越低。
二、MDA含量测定方法：1.组织提取：将适量的植物组织加入冰冷提取液（如磷酸盐缓冲液，pH7.4），用冷磨具磨碎并移至离心管中，离心5分钟收集上清液。
2.加入TBA液：取上清液与TBA液（三硝基苞球菌素溶液）按比例混合，混匀后在水浴中加热（100°C，10分钟），然后迅速冷却至室温。
3.离心沉淀：将样品离心10分钟，取上清液。
4.测定光密度：分别取上清液测定OD值，OD值越高，MDA含量越高。
三、优化与改进：1.提取液的选择：根据不同植物组织的特点选择合适的提取液，以提高SOD活性和MDA含量的测定效果。
2.比色反应的时间和温度的调整：根据植物组织中SOD活性的变化调整反应时间和温度，以保证测定结果的准确性。
3.重复测量：为了提高实验结果的可靠性，可以重复测量同一样本，并取平均值作为最终结果。
4.与对照的比较：将测定样本与对照组进行比较，以评估SOD活性和MDA含量的变化，进一步分析植物组织的氧化应激程度和损伤程度。
超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。
植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。
抗坏血酸（VC ）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。
自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。
二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。
如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。
H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。
植物生理学实验思考题考试要求：1.口答部分，30分，主要包括课后思考题、实验原理、实验结果。
2.实验部分，50分，主要是仪器的操作，有分光光度计、CO2气体分析仪、电导仪、阿贝折射仪。
实验到达30分以上才能及格。
考试不会太难，但也希望大家能够好好复习。
实验一、植物组织培养技术及烟草叶组织培养中形态发生和器官形成烟草叶组织培养中的形态发生和器官形成1.植物组织培养的原理、培养基的种类、现象原理：（1）植物细胞具有全能性，即每个植物细胞包含着能产生完整植株的全部遗传基因。
（2）只要条件合适，包含着全部遗传基因的细胞都能分裂分化，产生完整的植株。
培养基成分中生长素和细胞分裂素的比例决定了根或芽的分化。
培养基的种类及现象：（1）MS（不加激素）无生长现象（2）MS+BA1mg/L+NAA2mg/L 生长出愈伤组织2.外植体为什么不能切太小？不易成活3.植物组织组织中卫生么出现发霉？在操作过程中出现了污染。
4.植物激素对愈伤组织形成及器官分化有何影响？生长素/细胞分裂素：（1）高不定根（2）中愈伤组织（3）低不定芽5.在组织培养过程中应注意什么？灭菌无菌操作实验二、叶绿体色素的提取、分离及其理化性质色素含量的测定（分光光度计）1.实验原理及现象（1）色素提取植物叶绿体色素一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等组成。
利用叶绿体色素不易溶于水而溶于有机溶剂的特性，可用80%丙酮、95%乙醇等有机溶剂提取。
（2）色素分离可用纸层析来分离叶绿体色素，当溶剂不断地从纸上流过时，由于混合物中各成分在两相（即流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以她们的移动速度不同，因而使样品混合物分离。
色素带分布:从上至下橙黄色（胡萝卜素）、鲜黄色（叶黄素）、蓝绿色（叶绿素a）、黄绿色（叶绿色b）。
（3）荧光现象叶绿素分子吸收光量子。
由基态上升到激发态，激发态不稳定，有回到基态的趋向，当由第一单线态回到基态时发射出的光称为荧光。
实验一植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等。
它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。
所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。
一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应：2反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。
已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。
【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。
后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除从而抑制了甲的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。
【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。
【试剂】1．50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。
2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。
3．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。
4．750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.33m g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。
5．100μmol/L EDTA-Na2溶液：取37.21m g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。
6．20μmol/L核黄素溶液：取7.53m g核黄素定容至1000ml避光保存。
植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。
二、原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。
用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。
反应式如下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋H2O三、材料、仪器及试剂1. 材料：马铃薯块茎等2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。
3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1 pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚；20％三氯乙酸。
四、实验步骤1. 粗酶液的制备称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。
将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2. 活性酶的测定在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。
五、酶活性的计算以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。
A 酶提取液总量（ml）酶活力（0.01A·min－1）＝———————×———————————0.01×反应时间测定时酶液用量（ml）A 酶提取液总量（ml）酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)＝—————————×——————————0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml）公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。
植物体内多酚氧化酶活性的测定
一、目的
通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。
二、原理
多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。
用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。
反应式如下：
多酚氧化酶
邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋H2O
三、材料、仪器及试剂
1. 材料：马铃薯块茎等
2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。
3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1 pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚；
20％三氯乙酸。
四、实验步骤
1. 粗酶液的制备
称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。
将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。
2. 活性酶的测定
在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min内测定吸光度变化（A）值。
五、酶活性的计算
以每min内A525值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。
A 酶提取液总量（ml）
酶活力（0.01A·min－1）＝———————×———————————
0.01×反应时间测定时酶液用量（ml）
A 酶提取液总量（ml）
酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)＝—————————×——————————
0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml）
公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。
植物超氧化物歧化酶活性测量
一、实验目的及要求
（1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。
（2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。
二、实验原理
超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2. 大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，糖果组合组织或者细胞破碎后，可用Ph7.8的磷酸缓冲液提取。
邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。
邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40秒-3分钟这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。
颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。
三、实验材料、仪器设备及试剂
1、实验材料：大蒜
2、仪器：离心机
3、试剂：
(1)磷酸缓冲液（pH7.8, 0.05mol/L）)(PH8.3 Tris-HCl )
（2）浓盐酸
(3)邻苯三酚（50mmol.L-1）：称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。
(5) 考马斯蓝G-250：100mg 考马斯蓝G250溶于50 ml 95%乙醇中，加入100ml 85%(W/V)正磷酸，用蒸馏水稀释至1L，过滤。
（6）牛血清蛋白（1mg/100ml, 即ml=1 l）
四、实验方法
1、材料准备：每组30g大蒜，加入90 ml pH7.8 0.05 mol/L 磷酸缓冲液，匀
浆机匀浆，两层纱布过滤，冷冻离心（5000 rpm，20min）得清液测体积，取少量清液进行SOD活性测量。
2、将上清液置于60℃20min,使杂蛋白变性，然后5000r.min-1冷冻离心20min，取上清液测体积，并进行SOD活性测量。
3、SOD活性测定（邻苯三酚法）
采用改良的邻苯三酚自氧化法。
邻苯三酚自氧化速率为325 nm, 0.070D /min左右,以1 mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚的速率达到50%的酶量作为一个酶活力单位(U)。
（1）邻苯三酚自氧化速率的测定
取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔1 min读取A 值,连续读取4 min ,取平均值。
通过微调连苯三酚的加入量控制自氧化速率在每分钟0.070±0.002。
（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。
（2）SOD样液的活性测定
样品管取代自氧化管。
样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。
其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。
（3）计算
4、考马斯蓝G-250测蛋白含量：3ml 考马斯蓝加入适量的样品摇匀，2 min 后在595 nm测吸光值，并用牛血清蛋白（1mg/100ml, 即ml=1 l）制标准曲线。
SOD比活力(units/mgPr)=总活力（units）/总蛋白量（mg）
（1）标准曲线制作：
分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。
然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm 处测定吸光值。
以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。
具体操作见下表。
蛋白质标准曲线测定加样
（2）蛋白样品
配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。
取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空白，一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。
然后每支试管加入5.0ml 考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。
用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的ug数量，计算出待测蛋白质的含量。
在标准蛋白质和蛋白质样品的测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平行管。
作业：
总活力U=活力单位×总体积
比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度
纯化倍数=纯化酶液中 SOD比活力/粗酶液中比活力（每步比活力除以第一步比活力）
SOD回收率=纯化酶液中 SOD活力单位 /粗酶液中 SOD活力单位（每步总活力除以第一步的总活力）
实验四十四植物体内过氧化物酶活性的测定
一、目的
过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。
故在科研上常加以测定。
二、原理
在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。
三、材料、仪器设备及试剂
1.材料：植物叶片
2.仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。
3.试剂及配制：
0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。
反应液（100ml 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2，充分摇匀）。
四、实验步骤
1. 酶液提取
称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10ml
pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。
2.酶活性测定
吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A470）。
五、酶活性计算
按下式计算酶的相对活性
△A470 ×酶提取液总量（ml）
酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= ———————————————————
样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）。
