冷沉淀制备方法及质量影响因素

冷沉淀制备方法及质量影响因素【关键词】冷沉淀; 制备; 质量冷沉淀是用新鲜冰冻血浆为原料制备的一种成分血，主要用于血友病甲、血管性血友病、纤维蛋白原缺乏症患者，也可用于手术后出血、严重外伤及DIC等[1] 。

因冷沉淀中的Ⅷ因子为不稳定因子，受多种因素影响，所以每袋冷沉淀Ⅷ因子含量各不相同，现将本中心的冷沉淀制备方法及质量因素影响分析汇报如下。

1 材料与方法1.1 材料与仪器大容量低温离心机(CrYOFUge6000),日本日立公司生产的速冻冰箱(SanYO ),美国CYTOTHERM公司生产的CT-4T.6C型自动摇摆式恒温水浴溶化箱，日本产SYSMaX(CA-50)凝血因子分析仪，韩国产热合机(SE250)。

1.2 冷沉淀原料浆制备采用费森尤斯卡比(广州)生产的密闭四联袋，采集400ml全血6h内离心分离制成血浆60袋(200±10ml)，将血浆迅速置-80℃速冻机内，冻结后置-30℃冰箱备用。

1.3 制备冷沉淀取60袋血浆置室温中放置3min，待连接两袋的塑料管变软后分两组(A、B)放入低温水浴箱中(4℃~6℃)，A组30袋用水浴虹吸法制备冷沉淀，B组30袋用快速溶化离心法制备冷沉淀，计时。

A组新鲜冰冻血浆融化时固定于恒温摇摆式水浴箱的血袋夹中，垂直浸没于恒温的循环水浴中，水浴箱自动摇摆，血浆溶化，上清液虹吸流入空袋，袋中心剩余(25±5)ml未溶化的血浆及吸附在上面的冷沉淀。

B 组新鲜冰冻血浆融化时去掉固定夹，融化过程中人工给力捏碎血浆冰块，血浆溶解到尚存少许冰碴后，用大容量低温离心机离心，温度4℃，相对离心力3200g,离心20min，分离血浆，袋内存留(25±5)ml血浆冷沉淀，将A、B组冷沉淀快速置于速冻冰箱中冻结。

A组平均用1.2h，B组平均用2.0h。

1.4 质量检测用血凝仪对不同方法制备的冷沉淀进行凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原的测定,t检验分析。

2 结果用相同的溶化设备，采用不同制备方法制备所得冷沉淀质量有差异，见表1。

冷沉淀的获得方法冷沉淀是一种沉淀分离方法，在化学实验中广泛使用。

它的操作相对简单，适用于大量液体体系的固液分离。

下面是关于冷沉淀的详细介绍。

一、冷沉淀的原理冷沉淀是指在一定温度下，利用水溶液的溶解度随温度下降而减小的性质，使化学物质在水溶液中逐渐降温沉淀出来的过程。

通俗的说，就是利用温度的影响，把想要分离的化合物从水溶液中沉淀出来。

冷沉淀的原理就是利用化合物在不同温度下，饱和溶液中溶解度的不同。

在高温时，一些物质可以在水中充分溶解，但温度降低后会超过其饱和度，从而逐渐沉淀出来。

我们可以通过控制水温和配制适当的溶液，使想要分离的化合物在适当的温度下沉淀出来，并进行分离和提取。

二、冷沉淀的操作方法冷沉淀的操作相对简单，一般涉及以下步骤：1. 配制溶液：将想要分离的化合物加入到溶液中，搅拌至完全溶解。

2. 控制温度：将溶液放入低温环境中冷却，可以将它放在冰浴中，或将它置于冰箱中冷却。

3. 沉淀：当温度降低到一定程度时，目标化合物就会开始沉淀出来。

此时，可以过滤或离心收集沉淀。

4. 洗涤：将沉淀用适当的溶液洗涤，使其纯度提高。

5. 干燥：将洗涤过的沉淀放在干燥器中或在室温下干燥至干燥状态。

注意事项：1. 控制温度：控制温度是冷沉淀的关键。

如果温度过高或过低都可能会影响沉淀的形成，应该根据不同的实验需要调整温度。

2. 溶液的调配：需要根据化合物的特性和实验要求来调配浓度合适的溶液。

3. 沉淀收集：沉淀可以使用过滤或离心的方式进行收集，但需要仔细控制操作时间和力度，以避免损失或破坏沉淀。

三、冷沉淀的应用冷沉淀是一种常用的实验方法，广泛应用于化学、生物、医药等领域。

以下是冷沉淀的几个主要应用：1. 分离纯化化合物：冷沉淀被广泛用于从复杂的样品中分离出目标化合物。

冷沉淀可以简单、可靠地用来纯化晶体，以及从混合溶液中分离并回收化合物。

2. 提取金属离子：冷沉淀也可以用于提取金属离子。

一些重金属的沉淀可以用于水体、食品、土壤中金属污染物的分离和检测。

4 种方法制备冷沉淀的质量分析摘要】目的通过分析离心法和虹吸法制备冷沉淀（同批次制备）的质量，选择更加优化的冷沉淀制备方法。

方法取同一制备日期的冷沉淀原料血浆，分别采用冷藏融化离心法、水浴融化离心法（两种温度条件）、水浴融化虹吸法制备冷沉淀，分别按照机械抽样法抽样样品，检测冷沉淀中F Ⅷ含量并进行统计分析。

结果 4℃冷藏融化离心法的F Ⅷ含量为65.17±27.39（IU ／袋），合格率为40%（8／ 20）；4℃水浴融化离心法的F Ⅷ含量为89.67±39.96（IU ／袋），合格率为60％（12 ／ 20）；2℃水浴融化离心法的F Ⅷ含量为84.33±30.57（I U ／袋），合格率为：55％（11 ／ 20）；4℃水浴融化虹吸法F Ⅷ含量为108.85±42.41（IU ／袋），合格率为83.3％（25 ／ 30）。

经单因素方差分析，4℃水浴融化虹吸法的质量水平明显优于其他三种方法。

结论水浴融化虹吸法制备冷沉淀操作简便、快捷，F Ⅷ合格率高，明显优于冷藏融化离心法和水浴融化离心法，值得推广应用。

【关键词】冷沉淀凝血因子Ⅷ【中图分类号】R197.38 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）36-0061-02冷沉淀是采用特定的方法将保存期内的新鲜冰冻血浆（f r e s hfrozen plasma，FFP）在1℃～ 6℃融化后，分离出大部分的血浆，并将剩余的冷不溶解物质在1 小时内速冻成固态的成分血[1]。

根据冷沉淀在低温条件下不融化的特性，可制定不同的制备方法，目前血站常用的制备方法主要有：离心法，原料血浆放置于4±2℃冰箱或在4±2℃恒温水浴箱中融化，待基本融化后，在4±2℃重离心，分离出上层血浆，剩下少量血浆和沉淀物，制成冷沉淀；虹吸法，在4±2℃恒温循环解冻箱中放入原料血浆，转移空袋置于箱体外低位，松开止血夹，启动循环水流和震荡摇摆，血浆融化过程中，随时被虹吸至转移空袋中，当融化至剩下约少量血浆与沉淀物时，闭合导管，阻断虹吸，定量，制成冷沉淀[2]。

冷沉淀制备的关键控制环节目的：控制影响冷沉淀质量的关键环节，提高冷沉淀的质量。

方法：筛选从采集到制备间隔时间短、FⅧ损失少的全血制备的血浆留做冷沉淀原料浆。

保持良好的冷链系统，尽快低温分离成分血，控制好设备和环境温度，把握好制备的最佳时间等环节。

结果：2010年2-5月份冷沉淀质量控制结果显示，有25%不合格，不合格原因均为FⅧ因子含量达不到80 IU。

通过对上述各个环节的不断改进和控制，2010年6-9月份冷沉淀质量控制抽检全部合格。

结论：冷沉淀制备的质量控制涉及到全血的采集、储存和运输、分离以及新鲜冰冻血浆的融化、分离、入库等诸多环节，任何一个环节的失控，都会影响到冷沉淀的最终质量。

因此，要求心中有关部门加强沟通、紧密协作。

质量控制的关键是减少冷沉淀中的不稳定成分FⅧ因子的损失，而FⅧ因子的活性随温度的升高破坏很大，所以控制的核心内容是保持血液的冷链系统，最大限度地减少血液/血制品在常温下的时间。

要保证各个环节的的严格受控，制备优质的冷沉淀，除了配备必要的设备外，还要提高员工的质量意识和效率意识，提高专业技能，两个方面缺一不可。

冷沉淀是新鲜冰冻血浆在1 ℃~4 ℃条件下不溶解的白色沉淀物，其中主要含有五种成分：纤维蛋白原(Fg)、FⅧ、血管性假血友病因子(vWF)、凝血因子X Ⅲ、纤维结合蛋白(Fn)等多种成分。

冷沉淀是存在于血液中的一种功能性成分，具有广泛的生理功能和很高的临床应用价值。

近年来，冷沉淀的应用已突破传统的用于甲型血友病、纤维蛋白原及凝血因子缺乏所致的出血性疾病的治疗，在临床肿瘤手术、多发伤和手术创伤、弥散性血管内凝血(DIC)、深度烧伤、黏膜和皮肤疾病、自发性气胸、糖尿病足等方面得到广泛应用，并且取得了显著的效果。

冷沉淀中FⅧ因子极其不稳定，FⅧ的体内生物半衰期变化较大，一般为8~12 h，其活性易丧失[1-2]。

新鲜速冻血浆(FFP)融化后，FⅧ因子活性随着时间的延长而有明显的降低，其活性衰减了41.17％[3]。

影响冷沉淀质量的关键因素分析冷沉淀（cryoprecipitate）是新鲜冰冻血浆（ffp）在低温（约0~4℃）解冻后沉淀的白色絮状物，是ffp的部分凝血因子浓集制品，其中主要成分有：ⅷ因子、纤维蛋白原以及血管性血友病因子，纤维结合蛋白、ⅹⅲ因子等。

冷沉淀因其制作工艺简单、价格低廉，临床应用广泛。

适用于先天性或获得性纤维蛋白原缺乏症及ⅷ因子缺乏症患者，血管性血友病（vwd）、儿童及成年人轻型甲型血友病患者，dic及大出血患者的替代治疗等。

因冷沉淀中的ⅷ因子为不稳定凝血因子，受多种因素影响，所以每袋冷沉淀ⅷ因子含量各不相同，通过查阅相关资料及跟踪验证，对影响冷沉淀质量的关键因素分析，现报告如下：1 冷沉淀的制备方法冷沉淀制品是以新鲜冰冻血浆为原料，近年来因多联采血袋的广泛应用，冷沉淀的制作工艺更加简单，安全性更强，各地中心血站均能生产。

目前国内冷沉淀的制备常用两种方法[1]：1.1 离心法取出待制备冷沉淀的新鲜冰冻血浆（ffp），置室温中约5分钟，待双联袋导管（连接管）变软后，将血浆置入2～6℃水浴箱中融化。

当血浆基本融化时，取出血浆，在2±2℃的环境下重离心，使冷沉淀凝血因子下沉于塑料袋底部。

将上清分入空袋内，血袋底部的沉淀内大约含有20～30ml血浆，即为冷沉淀凝血因子。

1.2 虹吸法取出待制备冷沉淀的新鲜冰冻血浆（ffp），置室温中约5分钟，待双联袋导管（连接管）变软后，将新鲜冰冻血浆袋置于2～6℃水浴箱中，另一空袋悬于水浴箱外且位置低于血浆袋，两袋形成一定的高度落差。

新鲜冰冻血浆融化时，上清血浆随时被虹吸入空袋中，冷沉淀遗留在新鲜冰冻血浆袋中。

在融化过程中控制水浴温度在2～6℃。

待新鲜冰冻血浆融化至约40～50ml时，即为冷沉淀凝血因子。

以上两种方法制备好的冷沉淀需迅速放入速冻机中冷冻，于-20℃以下冰箱中保存，保存期不超过一年，输注前于37℃水浴融化，并于4小时内输注。

2 冷沉淀的质量标准根据《全血及成分血质量要求》gb18469-2001规定，冷沉淀外观：肉眼观察30℃~37℃融化的冷沉淀凝血因子无纤维蛋白析出、无黄疸、无气泡、无重度乳糜。