酶联免疫吸附试验实验报告

elisa酶联免疫吸附实验报告

一．实验目的

酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic

techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。

二．实验原理

用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

ELISA的基本原理有三条：

（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；

酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤

酶联免疫吸附测定（ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

实验步骤

1.标准品的稀释：按表1在小试管中进行标准品的稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 、标准孔、待测样品孔。 在酶标包被板上标准品准确加样50µl， 待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品10µl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.

10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值） 。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

12.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

BDNF的ELISA结果显示为毫微克/毫克组织（ng / mg）或皮克/ mL上清液（pg / mL），并表示为平均值±SEM。

浓度 标准品号 配法

160ng / L 5号标准品 150µl的原倍标准品加入150µl标准品稀释液

- 1 - 酶联免疫吸附试验 elisa原理

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的实验室技术，用于检测生物分子如蛋白质、抗体、荷尔蒙和病毒等。ELISA技术基于抗原和抗体的特异性结合，通过酶标记物和底物的反应来检测分子的存在或浓度。

ELISA技术的原理可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA等几种。其中，间接ELISA是最常见的类型，下面将详细介绍其原理和步骤。

一、间接ELISA的原理

间接ELISA利用抗体与抗原的特异性结合来检测分子的存在或浓度。该方法需要用到两种抗体：第一种是特异性抗体，用于检测目标分子；第二种是酶标记抗体，用于检测第一种抗体的结合情况。

具体步骤如下：

1. 将抗原溶液加入微孔板中，并在室温下孵育一定时间，使抗原吸附于微孔板表面。

2. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的抗原和杂质。

3. 加入一定浓度的非特异性蛋白质，如牛血清蛋白或奶粉，以防止非特异性结合。

4. 加入一定浓度的特异性抗体，使其与抗原结合。

5. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的抗体和杂质。

6. 加入一定浓度的酶标记抗体，使其与第一种抗体结合。

7. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的酶标记抗体和杂质。 - 2 - 8. 加入底物，使酶标记抗体产生颜色反应。

9. 测量吸光度，来确定目标分子的存在或浓度。

二、间接ELISA的优缺点

间接ELISA具有以下优点：

1. 可以检测极低浓度的分子，如病毒和荷尔蒙。

2. 可以同时检测多个样本。

3. 可以检测多种类型的生物分子，如蛋白质、抗体、荷尔蒙和病毒等。

4. 可以使用多种酶标记抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）和过氧化物酶（POD）等。

ELISA

Lin Chengyu Bio 04 2010030007

Experiment Date: 2012-03-12 Submitting Date: 2012-03-21

1 Introduction

1.1 Background information

ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) is a solid-phase assay for antibodies employing ligands labeled with enzymes which is widely used for immunological assays.

This technique can be applied to detect antigens or antibodies for qualitative or quantitative purpose. Since enzyme reactions are very well known amplification processes, the signal is generated by enzymes which are linked to the detection reagents

in fixed proportions to allow accurate quantification.1

1.2 Major principles

Figure 1 Schematic diagram of ELISA2

Figure 2 Procedure of indirect ELISA3

As shown in Figure 1 & 2, the general procedure of indirect ELSIA is to: incubate the plate well with antigen, wash off unbounded antigen, incubate with 1st antibody, wash