流感病毒的耐药性研究进展

流感病毒的耐药性研究进展

流感病毒作为全世界范围内对人类健康存在影响的主要病原，每年都会造成3000万～5000万人感染呼吸道疾病。自2009年，新甲型H1N1流感病毒在全世界范围内流行以来，该型别流感病毒已成为继季节性流感H3N2又一流行毒株。目前常用的抗病毒药主要有M2蛋白抑制剂和NA抑制剂两类，并且随着各类抗流感药物的出现和使用也带来了相应的耐药问题。目前常用的流感病毒NAI耐药性检测方法主要包括表型分析法和基因型分析法，两类方法常联合使用、互为补充。流感病毒产生耐药性的原因，①病毒自发性氨基酸置换产生了耐药性，②抗病毒药物对耐药株的选择性。因此，应避免抗病毒药物的不规范使用导致的耐药株的产生。

标签：流感病毒；耐药性；检测

流感病毒作为全世界范围内对人类健康存在影响的主要病原，流感每年都会造成3000万～5000万人感染呼吸道疾病，并造成25万～50万人死亡，大流行时死亡人数则数以百万计。由于流感病毒进化结果可导致抗原漂移和抗原的转换，这些均可引起大范围的流行，其中各片段之间的基因重排是其抗原转换的基础，这也是如1918年西班牙、1957年亚洲、1968年香港流感大流行的原因[1]。

1流感病毒的结构特点

流感病毒在病毒的分类上属于正粘病毒科，它是负链的有包膜的RNA病毒，其毒粒结构分为三层。最外层是双层类脂囊膜，它来自病毒复制的宿主细胞。囊膜上散布着形态不一的蛋白突起，一种像三角形的细长棒，称为血凝素（H或HA）；另一种像蘑菇样，称为神经氨酸酶（N或NA）。HA和NA在囊膜上的比例约为4：1。中间层为类脂膜，其下面的基质（M1）蛋白形成的一个或若干个分子厚的球形蛋白壳，里层即为裹在蛋白壳内的核壳体。A型流感病毒就是根据其表面HA和NA的结构及其基因特性的不同分成许多亚型[2]。迄今A型流感病毒已发现的HA有16个亚型（HI-H16），NA有9个亚型（N1-N9）。

2流感的用藥及耐药趋势

2.1全球耐药趋势 自2009年，新甲型H1N1流感病毒在全世界范围内流行以来，该型别流感病毒已成为继季节性流感H3N2又一流行毒株。目前常用的抗病毒药主要有M2蛋白抑制剂和NA抑制剂两类[3]。M2蛋白抑制剂（如金刚烷胺）通过阻断流感病毒M2蛋白形成的离子通道，干扰病毒早期复制阶段脱壳过程而抑制病毒的复制。而NA类抑制药物被批准临床使用有二种，即扎那米韦（zanamivir）和磷酸奥司他韦（oseltamivir phosphate）[4]。在新甲型H1N1流感病毒流行期间，另一种尚在临床试验阶段的准新药NA抑制剂帕那米韦（paramivir）被允许给入院的流感患者静脉使用，但用药前提为这些患者得不到其他药物治疗或治疗无效[5]。但随着各类抗流感药物的出现和使用也带来了相应的耐药问题，季节性H3N2亚型流感病毒对烷胺类药物的耐药毒株在1991～

1995年全球比例仅为0.8%[6]，但在2005～2006年流感季节期间，耐药株比例持续上升，全球整体比例高达90.5%[7]。随后耐药比例持续升高，在2007年以后多数地区对金刚烷胺的耐药株比例已接近100%[8]。此后WHO报道全球季节性H3N2亚型流感病毒均对烷胺类药物耐药。经鉴定全球报道的新甲型H1N1亚型流感病毒均对烷胺类药物耐药[9]。截止到2011年10月5日，全球共报道了605株新甲型H1N1奥司他韦耐药株，全球耐药株比例低于1%[10]。然而在2011年6～8月，澳大利亚出现聚集性病例感染新甲型H1N1奥司他韦耐药株事件，检测发现耐药株比例高达14%（25/184），其中有64%（16/25）的耐药株分离自未接受过奥司他韦治疗的患者[11]。

2.2我国流感耐药趋势 国内有研究表明2009年～2012年广东地区44株新型甲型H1N1流感病毒株对NAI药物均敏感，但2010年和2011年病毒株的奥司他韦IC50值较2009年低，且在奥司他韦和扎那米韦敏感性检测中均出现离散现象[12]。2013年3月开始，一种新型流感病毒H7N9开始出现人感染现象，并在随后的研究中发现1例上海患者身上检测到的流感病毒NA序列中携带K294R突变位点，并引起对奥司他韦类药物的耐受[13]。

3流感病毒的耐药机制

3.1 M2蛋白抑制剂类药物的耐药机制 M2蛋白抑制剂类药物耐药突变常发生在M2蛋白1个或多个氨基酸位点，主要发生了跨膜域螺旋区的L26F、L26P、V27A、V27T、A30T、A30V、S31N、S31R、G34E位点突变，致使药物不能与M2离子通道结合，Astrahan等发现，流感病毒可以通过增大离子通道口径，使药物虽然能够与M2蛋白结合却不能完全封闭离子转运，从而产生耐药性[14]。其中甲型H1N1流感容易发生V27A突变，而H3N2亚型病毒耐药多与S31N突变有关。

3.2 NA抑制类药物耐药机制 NA抑制剂（NAI）则通过特异性结合于NA活性催化中心氨基酸残基部位，抑制病毒的复制和脱落。神经氨酸酶抑制类药物如奥司他韦（达菲）等已成为药物预防和治疗流感病毒的主要制剂。奥司他韦是目前最常用的NA抑制剂。流感病毒针对不同的NA抑制剂，耐药位点也不同。研究发现，NA第274位和294位突变导致对奥司他韦和帕拉米韦耐药，第152位突变导致对扎那米韦耐药，而第119位发生的突变会导致对奥司他韦和扎那米韦耐药[15]。此外NA突变也可以引起流感病毒对NA抑制剂的多重耐药。近来，在新甲型H1N1流感病毒感染患者中发现了1种新型的I222V NA突变，它可以引起中等强度的多重耐药性。随后发现I222V NA突变自身导致的奥司他韦耐药性水平并不高，但I222V突变可与E119V突变协同作用提高季节性H3N2病毒对奥司他韦的耐药水平，也提高了对帕托米韦的耐药性[16]。

4流感病毒耐药检测手段

常用的流感病毒NAI耐药性检测方法主要包括表型分析法和基因型分析法，两类方法常联合使用、互为补充[17]。常用化学发光或荧光底物法进行表型耐药分析，而基因型分析则是通过常规测序或焦磷酸测序等方法测定抗性突变的分子

标记[18]。4.1表型分析法 表型分析法是确定流感病毒耐药性的”金标准”，它不需事先已知耐药位点，可以检测出发生已知突变、新型突变或联合突变的耐药株或药物敏感性降低毒株，且能检测出基因型分析法无法检出的毒株对药物敏感性的变化趋势[19]。

表型分析法中以NA抑制试验（NIT）最为常用。该法具有高通量、操作简便的特点，主要包括荧光法（fluorescence-based assay，FL）和化学发光法（chemiluminescence-based assay，cL）。这两种方法所需的实验步骤类似，但各有特点。荧光法用4-甲氧-N-乙酰神经氨酸4-methylumbelliferyl-N-acetyIneuraminic acid，MUNANA）作为底物，使用荧光光度计进行检测，可使用商品化试剂盒如NA-Flour，也可自行配制试剂检测；而化学发光法目前主要使用商品化试剂盒，如NA-Star和NA-XTD，其底物分别为NA-Star和NA-XTD，需用化学发光光度计检测[17]。在表型分析法中，一般是通过比较所测毒株与敏感株半数抑制浓度（half maximal inhibitory

concentration，IC50）的相差倍数，以确定毒株是否耐药。

4.2基因分析法 基因型分析法通过检测NA基因上耐药突变的分子标记检测毒株是否耐药。最常检测的耐药突变分子标记是季节性流感病毒A（H1N1）和新甲型H1N1中可导致奥司他韦耐药性的H275Y（NI numbering），其他还包括：新甲型H1N1流感病毒的I223R/K/V（NI numbering）、A（H3N2）的E119V（N2

numbering）和R292K（N2numbering）、B型流感病毒的R150K（B numbering）等[20]。基因型分析法中最常用的是测序法。测序法主要包括Sanger测序法和焦磷酸测序法（pyrosequencing）。獲得测序结果后，可利用生物信息软件（如Lasergene、BioEdit、Mega等）分析毒株序列的基因变异特点，同时获得耐药相关位点。

Sanger测序法即双脱氧核糖核酸链末端终止法，所测片段较长（每次约1200bp），可获得基因片段全长，提供可能导致耐药性的目标基因序列的详细信息。不过Sanger测序法耗时较长且不能检测SNP，更不能为之定量[20]。

焦磷酸测序法是近年发展比较成熟的一种可进行定量序列测定的技术，目前该技术在流感病毒耐药性快速鉴定上得到成功应用[17]。它通量高、速度快（约5h），而且敏感性和重复性较好，可定量检测SNP，获得携带NA H275Y突变或其他耐药突变位点的耐药株在混合毒株中所占的比例。

这类方法大多可直接利用临床标本而非细胞培养物，极大缩短了耐药性检测时间，而且这类方法特异性高、敏感性高，可直接检测耐药突变的分子标记，为耐药性检测提供了一个高通量且快速的平台[19]。

5流感病毒耐药性预防

流感病毒产生耐药性的原因，一是病毒自发性氨基酸置换产生了耐药性，二是抗病毒药物对耐药株的选择性。因此，应避免抗病毒药物的不规范使用导致的耐药株的产生[21]。目前的流感毒株大多依然对NA抑制剂敏感，故目前NA抑

制剂是治疗和预防A型、B型流感的有效药物。此外，对现有药物进行结构改造、发现新的药物作用靶点以及寻找新的天然药物是今后的重要发展方向。

参考文献：

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