色谱柱参数对分离的影响
气相色谱分析中柱长、柱内径、柱温、载气流速、固定相、进样等操作条件对分离的影响
１、柱长，柱内径：一般讲，柱管增长，可改善分离能力，短则组分馏出的快些；柱内径小分离效果好，柱内径大处理量大，但柱内径过大，将导致担体不能均匀地分布在色谱柱中。分析用柱管一般内径为３－６毫米，柱长为１－４米。
２、柱温：是一个重要的操作变数，直接影响分离效能和分析速度。选择柱温的根据是混合物的沸点范围，固定液的配比和鉴定器的灵敏度。提高柱温可缩短分析时间；降低柱温可使色谱柱选择性增大，有利于组分的分离和色谱柱稳定性提高，柱寿命延长。一般采用等于或高于数十度于样品的平均沸点的柱温为较合适，对易挥发样用低柱温，不易挥发的样品采用高柱温。
３、载气流速：载气流速是决定色谱分离的重要原因之一。一般讲流速高色谱峰狭，反之则宽些，但流速过高或过低对分离都有不利的影响。流速要求要平稳，常用的流速范围每分钟在１０－１００亳升之间。
４、固定相：固定相是由固体吸附剂或涂有固定液的担体构成。 （１）固体吸附剂或担体粗细：一般采用４０－６０目、６０－８０目、８０－１００目。当用同等长度的柱子，颗粒细的分离效率就要比粗的好些。 （２）固定液含量：固定液含量对分离效率的影响很大，它与担体的重量比一般用１５％－２５％。比例过大有损于分离，比例过小会使色谱峰拖尾。
５、进样：一般讲进样快，进样量小，进样温度高其分离效果好。对进液体样，速度要快，汽化温度要高于样品中高沸点组分的沸点值，一次汽化，保证色谱峰形不致展宽、使柱效高。当进样量在一定限度时，色谱峰的半峰宽是不变的。若进样量过多就会造成色谱柱超载。一般讲柱长增加四倍，样品的许可量增加一倍。对于常规分析，液体进样量为１－２０微升；气体进样量为０、１－５毫升。
实训操作规程
柱色谱分离技术操作规程
1．装柱
装柱的好坏直接影响分离效率。装柱之前，先将空柱洗净干燥，然后将柱垂直固定在铁架台上。如果色谱柱下端没有砂芯横隔，就取一小团脱脂棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面铺上一层厚0.5~1cm的石英砂，然后进行装柱。
装柱的方法有湿法和干法两种。
①湿法装柱：将吸附剂用洗脱剂中极性最低的洗脱剂调成糊状，在柱内先加入约3/4柱高的洗脱剂，再将调好的吸附剂边敲打柱身边倒入柱中，同时打开柱子的下端活塞，在色谱柱下面放一个干净并干燥的锥形瓶，接收洗脱剂。当装入的吸附剂有一定的高度时，洗脱剂流下速度变慢，待所用吸附剂全部装完后，用流下来的洗脱剂转移残留的吸附剂，并将柱内壁残留的吸附剂淋洗下来。在此过程中，应不断敲打色谱柱，以使色谱柱填充均匀并没有气泡。柱子填充完后，在吸附剂上端覆盖一层约0.5cm厚的石英砂或覆盖一片比柱内径略小的圆形滤纸。
②干法装柱：在色谱柱上端放一个干燥的漏斗，将吸附剂倒入漏斗中，使其成为细流连续地装入柱中，并轻轻敲打色谱柱柱身，使其填充均匀，再加入洗脱剂湿润。
2．加样
液体样品可以直接加入到色谱柱中，如浓度低可浓缩后再进行分离。固体样品应先用少量的溶剂溶解后再加入到柱中。在加入样品时，应先将柱内洗脱剂排至稍低于石英砂表面后停止排液，用滴管沿柱内壁把样品一次加完。在加入样品时，应注意滴管尽量向下靠近石英砂表面。样品加完后，打开下旋塞，使液体样品进入石英砂层后，再加入少量的洗脱剂将壁上的样品洗脱下来，待这部分液体的液面和吸附剂表面相齐时，即可打开安置在柱上装有洗脱剂的滴液漏斗的活塞，加入洗脱剂，进行洗脱。
3．洗脱
在洗脱过程中，样品在柱内的下移速度不能太快，如果溶剂流速较慢，则样品在柱中保留的时间长，各组分在固定相和流动相之间能得到充分的吸附或分配作用，从而使混合物，尤其是结构、性质相似的组分得以分离。但样品在柱内的下移速度也不能太慢(甚至过夜)，因为吸附剂表面活性较大，时间太长有时可能造成某些成分被破坏，使色谱带扩散，影响分离效果。因此，层析时洗脱速度要适中。通常洗脱剂流出速度为每分钟5~10滴，若洗脱剂下移速度太慢可适当加压或用水泵减压，以加快洗脱速度，直至所有色带被分开。
1. 离子交换色谱是一种成熟的技术，柱填料含有极性可离子化的基团，如羧酸、磺酸或季铵离子，在合适的pH值下，这些基团将解离，吸引相反电荷的物质。由于离子型物质能与柱填料反应，所以可被分离。
缓冲溶液常被用作离子交换色谱的流动相。缓冲溶液的pH值和离子强度将影响化合物从柱中的洗脱。这是由于改变pH值，可改变化合物的解离程度所致。样品电离度的降低，减少了样品与色谱柱的反应，样品组分就可以较快地从柱中流出。增加流动相的离子强度，平衡移向不利于样品与柱填料反应的方向，利于样品从柱中较快流出。
2.分子排阻色谱法是基于样品分子量大小不同而多样品进行分离的色谱法。固定相是有一定孔径的多孔填料，小分子量的化合物进入孔中，流动相是可以溶解样品的溶剂。分离过程是按分子量大小的顺序，分子量大的化合物先从柱中洗脱。
分子排阻色谱法常用于分离高分子化合物或复杂的物质，如组织提取物、核酸、蛋白质等。
2. 1.离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。 凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离.
2.排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。
常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。
层析柱分离的一般是本身有颜色或在紫外灯下有荧光的物质。必须先做薄层色谱（TLC）分离试验，以寻找柱色谱的最佳分离条件。
1.薄层色谱操作方法：
所需的东西主要有溶剂、展开剂、玻璃点样毛细管（内径0.3mm）、硅胶铝箔板、染缸。
将被分离的试样用溶剂溶解后，用玻璃点样毛细管（内径0.3mm）蘸取少量溶液，在距薄层板底端约10mm处点样，斑点直径不要过大，约2mm即可，待样点干后放入盛有少量展开剂的染缸中展开。试样中各组分在薄层板上上升的高度依赖于组分在展开剂中的溶解能力和被吸附剂吸附的程度，选取合适的展开剂就可将代表各组分的样点分离开。注意：样点要在染缸中展开剂的液面以上。
化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升的高度的比值称为该化合物的比移值 Rf（0≤Rf≤1）。（计算上升高度的起始位置是样点的原始位置）同等条件，极性小的组分Rf大，极性大的组分Rf值小。
单一溶剂极性和展开能力递增顺序：
石油醚
多元展开剂应互溶，且被分离物也最好能溶解于其中。由实验确定所需用的展开剂的方法为：选用一个极性强的溶剂和一个极性弱的溶剂并按不同比例调配，即在非极性溶剂中加入少量极性溶剂，极性由弱到强，比例由小到大，以得到合适的比例。一般最常用的是乙酸乙酯（极性较高）和石油醚（非极性）。先用乙酸乙酯作为展开剂点板，若样点随展开剂整体移动位移较大，用如上的方法，在石油醚中逐渐加大乙酸乙酯的比例，可找到合适的比例将样点分开；若样点能明显的分开，用乙酸乙酯即可；如若样点在原地不动或动的很少，则需加大展开剂的极性，选用乙醇作展开剂，再和石油醚配比，以求能分开，如用乙醇样点仍原地不动或动的很少，则需再加大展开剂的极性，直至样点能分开。（若待分离的试样极性特别高可选用乙腈+水+少量磷酸二氢钾）。理论上可以通过调节石油醚和乙酸乙酯的比例，获得可以取代极性在石油醚和乙酸乙酯之间的各种溶剂，但考虑到试样的溶解性，有时也需要用到甲苯、氯仿、二氯甲烷等溶剂。
