β-半乳糖苷酶活性测定方法

β-半乳糖苷酶活性测定方法β-半乳糖苷酶活性测定（β-galactosidase assays）1、将过夜培养的菌液按1%接种量到新鲜培养基中培养，待OD600至0.6时取出，放置于冰上；（或可检测不同OD600时，菌的酶活性）2、取50-100μl 菌液至1.5 ml 的离心管中，加370-420μl Z buffer；3、加20 μl 氯仿和10 μl 0.1% SDS，振荡混匀，裂解细胞，放置于冰上30分钟；4、向离心管中加入100 μl 浓度4 mg/ml 的ONPG，混匀后立即置于30℃反应30-60分钟；5、待颜色变黄后，加入250 μl 1 M Na2CO3中止反应，准确记录变色反应的时间；6、取200μl上清，测定420 nm 和550 nm 处的吸光度；7、计算β-半乳糖苷酶酶活力：Miller Units = 1,000×[(OD420－ 1.75×OD550)] / (t×V×OD600)，其中，OD420和OD550----显色后的反应液读数；OD600----用于显色分析的培养液的细菌密度；t ----显色反应时间(单位min)；V ----用于显色分析的培养液体积(单位ml)。

Z buffer (总体积100 ml)：Na2HPO4·12H2O 100mM 3.5814 gNaH2PO4·H2O 40mM 0.624gKCl 10mM 0.07455gMgSO4·7H2O1mM 0.0246gβ-mercaptoethanol 5.4μl / ml 540μl加水到总体积90 ml，待试剂溶解后调pH 至7.0，最后定容到100 ml，4℃储存。

Substrate solution(总体积10ml)----现用现配Na2HPO4·12H2O 60mM 0.215 g NaH2PO4·H2O 40mM 0.0624g ONPG 4mg/ml 0.04g终止液（100ml）：Na2CO3 1M 10.6g。

摘要从土壤中筛选出一株产β-半乳糖苷酶的枯草芽孢杆菌，并对菌株和其产生的β-半乳糖苷酶进行了测定。

单菌落的最佳生长时间是10h，最佳接种量是2.0%，最佳培养时间24h；该菌株产生的β-半乳糖苷酶的最适pH 是6.5，最适生长温度为37℃，酶的稳定性较高，4h后相对酶活仍能维持85%以上；Mg2+对酶活性的促进作用最强，当浓度为10 mmolL时，酶活力可达112.24％，Cu2+对酶活性抑制作用最强，少量Cu2+（1mmolL）就可使酶失活。

本实验还进行了β-半乳糖苷酶的固定化实验。

以海藻酸钠为栽体、戊二醛为交联剂，对乳糖酶进行固定化。

研究了海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、戊二醛浓度、固定化时间对酶固定化的影响，并对固定化酶酶促反应的最适pH、温度等进行了测定。

结果表明，4％的海藻酸钠，在温度37℃、pH6~7、氯化钙浓度1％、戊二醛浓度0.1%下对乳糖酶的固定化率最高。

酶促反应特性测定结果表明，固定化后乳糖酶的稳定性增强，最适温度范围较非固定化乳糖酶大，最适pH范围与非固定化乳糖酶大致相同。

但固定化酶珠体机械强度较差，尚待改进。

关键词：β-半乳糖苷酶酶活性酶的固定化AbsractA strai n isolated from soil in producing β-galactosidase of Bacillus subtilis, and strains and β-galactosidase were measured which produces. A single colony of the best growth time is 10h, the best inoculum was 2.0%, the best culture time 24h; optimum pH β-galactosidase enzyme produced by this strain is 6.5, the optimum temperature is 37℃, enzyme be maintained above 85%; Mg2+on the activity of promoting the strongest, when the concentration of 10 mmolL, the enzyme activity of up to 112.24%, Cu2+ inhibition of enzyme activity most, a small amount of Cu2+ (1mmolL) can inactivate the enzyme.The experiments were also β-galactosidase immobilization experiments. The lactase was immobilized on sodium alginate carrier by cross-link with glutaraldehyde. The effects of flutaraldehyde concentration, amount of the enzyme and temperature immobilization were analyzed. The reaction conditions (optimun pH and temperature) of the immobilized lactase were studied. The results show that the of enzyme目录摘要 (I)Absract (II)目录 ............................................................................................................................................ I II 第1章绪论 (7)1.1 研究背景 (7)1.2 课题研究目的和意义 ..................................................................... 错误！未定义书签。

细胞衰老检查的实验技术及原理（一）关键词：细胞色素成纤维细胞酶磷酸试剂标准物质北京标准物质网衰老细胞的形态变化主要表现为形状变大、变平、胞核增大、核膜内陷、染色质固缩、胞内溶酶体变多等。

衰老细胞中细胞器数量尤其是线粒体数量减少，胞质内有色素堆积和空泡形成，最终导致细胞死亡。

总体来说衰老细胞的各种结构呈退行性变化。

根据其特征，目前常用于检测衰老的方法如下：一、β-半乳糖苷酶活性1995年，Dimiri等发现体外培养二倍体成纤维细胞在培养基pH值为6时，其β-半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而逐渐上调，他们把这种中性β-半乳糖苷酶定义为SA-β-gal，即衰老相关的β-半乳糖苷酶。

衰老细胞或组织产生的β-半乳糖苷酶可以催化底物X—Gal，生成深蓝色产物，从而在光学显微镜下很容易观察到(图5-5-1)。

在人体表皮角质层细胞中，也可以发现SA-β-gal 随年龄的增加而增加。

并且，SA-β-gal不依赖于DNA复制，可以区分衰老细胞与静止期的细胞。

SA-β-gal是一种体内体外都适用的检测衰老的生物标记物。

由于检测SA-β-gal的方法简单易行，其在检测衰老细胞方面有很广泛的应用，目前已经有2400多篇论文应用了这种方法。

二、端粒长度的检查端粒是位于真核细胞染色体末端顶部的核蛋白结构，由高度保守的TTAGGG 重复序列组成，其存在可以保护染色体末端，是维持染色体稳定的重要因素。

鉴于端粒的特殊结构，端粒的长度会随着每次细胞的分裂而缩短，因此，端粒长度是衰老的一个重要生物标志。

这里我们主要讨论端粒限制性片段(TRF)分析及荧光原位杂交(FISH)法。

端粒限制性片段分析：TRF分析也称作端粒的Southern印迹法，是应用针对端粒重复序列的探针来检测限制性酶切后所保留的端粒的方法。

限制性酶会将基因组DNA消化为短的片段，留下大量完好的端粒，即所谓的端粒限制性片段。

以凝胶电泳分离基因组片段，通过放射性探针(CCCTAA)。

荧光素酶活性实验（1）.以5*104的细胞/孔接种于24孔板中，24hr后用磷酸钙转染，转染所有所需的DNA。

包括受体表达载体、包含荧光素酶报告基因的各种表达质粒和B-gal半乳糖苷酶表达质粒共转入细胞中。

(2).弃去培养液后，PBS洗一次，每孔加入120ul裂解液，4℃放置10min，13000rpm离心5min，取上清。

（3）.B-gal半乳糖苷酶活性测定：配制B-gal半乳糖苷酶活性测定液：880ul ONPG+40ul 100*镁离子溶液+2280ul 0.1M磷酸盐缓冲液。

每个样品加入B-gal测定液120ul和细胞裂解液20ul。

以上混合液于37℃孵育至有黄色出现为止，加入60ul 1M的Na2CO3终止反应。

于酶标仪410nm 测定吸收值，以此作为B-gal半乳糖苷酶的相对活性，用于内对照，已标定转染效率。

（4）.荧光素酶活性测定：将20ul的细胞裂解液（用细胞裂解液补至100ul）与10ul的荧光素酶检验试剂（Lueiferin solution荧光素一管和ATP一管）混匀，立即用sepctrafluor plus检测发出的荧光信号，该荧光值与相对应的B-gal半乳糖苷酶的OD值之比为标定后的荧光素酶的相对活性。

附:试剂配方：磷酸盐缓冲液：NaHPO4， Na2HPO4 pH7.3 详细配法见分子克隆100*镁离子溶液(0.1M MgCL2, 5M B-巯基乙醇)ONPG 4mg( O–nitropheny-B-D-galactopyanoside)溶于1ml 0.1M磷酸盐缓冲液Lueiferin solution:10 mg Lueiferin溶于36ml 5Mm KH2PO4(pH7.8),分装成432ul每管.储存于-80℃.用前应先于室温放30min, 注意避光。

ATP:25 ml 1M Tris+5ml 1M MgCL2 + 0.48gATP分装成120ul每管.储存于-80℃.0.1M PBS 溶液，以1L量为例：NaCl 80g 9Na2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠，最常见，不怎么吸潮，如果你有无水的这两种磷酸盐也行，换算一下即可，无水的容易吸潮。

1.5 β—半乳糖苷酶粗酶液的提取将菌株接种于产酶培养基中，30℃培养60h，过滤收集菌体，充分洗涤，加柠檬酸--磷酸氢二钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.0）研磨，破壁菌液离心所得上清液即为粗酶液。

1.6 酶活力的测定在试管中加入100µl邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷（ONPG），800µL 10.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，100µl酶液，混匀，50℃水浴中反应10分钟，加2ml 1mol/L终止反应，测定计算酶活力。

酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟分解ONPG，生成1µ mol邻硝基苯酚（ONP）所需的酶量为1个酶活力单位（U）。

1.2.1 酶活力的测定以ο-NPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。

酶活力单位定义为以ο-NPG为底物37℃保温酶解，每分钟释放出1µmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。

β-半乳糖苷酶活测定采用Genstar 的β-半乳糖苷酶检测试剂盒法。

在有β-半乳糖苷酶存在的条件下，无色的反应底物会转化生成黄色的硝基酚(o-nitrophenol)。

向各管中加入一定量的反应终止液，离心测定420 nm 和550 nm 下的吸光度。

β-半乳糖苷酶活性单位数(U)=1000- (OD420 -1.7 OD550)/Time(min)×V(mL)×1.5 酶活力测定方法将pH6.5的磷酸缓冲液500µl和0.25%的ONPG 200µl加入比色管,在25℃的温度下温浴5min,加入适当稀释的粗酶液0.5ml,反应10min,加入800µl 5%Na2CO3终止反应,蒸馏水定容至10ml,用分光光度计420nm测定OD值,通过标准曲线方程计算酶活。

在上述条件下1ml粗酶液1min催化水解ONPG生成1µmol邻硝基苯酚(ONP)的量,定义为1U。

1.2培养基初筛培养基：乳糖0.5%，硫酸镁0.007%，磷酸氢二钾0.01%，氯化钙0.004%，硫酸铵0.01%，琼脂1.5%，自然pH，每100mL培养基中加入20mg/mL X-gal溶液200µL；复筛培养基：乳糖1.5%，蛋白胨1.0%，酵母浸膏0.3%，氯化钠0.1%，pH值7.0；发酵培养基：乳糖3.0%，蛋白胨1.5%，酵母浸膏1.0%，氯化钠0.3%，pH值7.0。

β-半乳糖苷酶标准-回复标题：β-半乳糖苷酶的标准：理解、应用与评估一、引言β-半乳糖苷酶，也被称为乳糖酶，是一种在生物体内广泛存在的水解酶。

它主要负责催化β-半乳糖苷键的断裂，从而在各种生物过程中发挥关键作用。

本文将详细探讨β-半乳糖苷酶的标准，包括其定义、性质、功能、应用以及评估方法。

二、β-半乳糖苷酶的定义和性质β-半乳糖苷酶是一种糖苷水解酶，属于GH家族的一类酶。

它能特异性地催化β-半乳糖苷键的水解反应，生成半乳糖和非还原性末端。

这种酶在酸性和中性pH条件下具有活性，最适pH值通常在6.0-7.0之间。

β-半乳糖苷酶的分子量通常在50,000-100,000 Da之间，其三维结构包含一个或多个β-螺旋和α-螺旋结构域。

这些结构域共同构成了酶的活性位点，其中包含一个或多个保守的氨基酸残基，这些残基直接参与底物的识别和催化反应。

三、β-半乳糖苷酶的功能β-半乳糖苷酶在生物体内的功能多种多样。

在消化系统中，乳糖酶是人体分解乳糖的关键酶，对于乳糖的吸收和利用起着至关重要的作用。

在工业生产中，β-半乳糖苷酶被广泛应用于食品、制药、纺织和环保等领域。

在食品工业中，β-半乳糖苷酶常用于乳制品的加工，如乳糖的水解、奶酪的成熟和风味的改善等。

在制药工业中，β-半乳糖苷酶可用于制备药物前体和生物标记物。

在纺织工业中，β-半乳糖苷酶可用于棉织物的预处理和染色。

在环保领域，β-半乳糖苷酶可用于废水处理和生物质能源的生产。

四、β-半乳糖苷酶的应用1. 食品工业：β-半乳糖苷酶在乳制品加工中的应用最为广泛。

例如，通过乳糖酶的作用，可以将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，使得乳糖不耐受的人群也能享受到乳制品的美味。

2. 制药工业：β-半乳糖苷酶可用于制备某些药物的前体，如抗生素、抗癌药物等。

此外，它还可以用于生物标记物的制备，如用作诊断工具的糖缀合物。

3. 纺织工业：在纺织工业中，β-半乳糖苷酶可用于棉织物的预处理和染色。

它可以去除棉纤维表面的半乳糖基团，提高染料的吸附性和染色效果。

β半乳糖苷酶染色统计方法β半乳糖苷酶染色统计方法引言β半乳糖苷酶是一种重要的酶，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。

为了准确测定β半乳糖苷酶的活性，我们需要针对其染色来进行统计分析。

本文将详细介绍几种常用的β半乳糖苷酶染色统计方法。

方法一：比色法1.准备样本：收集待测试的样本，如细胞培养液或组织切片。

2.制备底物：制备含有4-甲基-β-半乳糖苷（MUG）的底物溶液。

3.加入样本与底物：将样本与底物溶液混合，以触发酶底物反应。

4.加入停止液：加入含碱性溶液，停止反应，生成可测量的产物。

5.比色测定：使用比色法测量产物的吸光度，根据标准曲线计算β半乳糖苷酶的活性。

方法二：荧光法1.准备样本：与比色法相同，收集待测试的样本。

2.加入底物：使用荧光底物（如4-甲基-7-氨基香豆素）进行反应。

3.反应停止：加入相应的化学物质停止反应，生成可测量的荧光产物。

4.荧光测定：使用荧光光谱仪或流式细胞仪来测量荧光产物的荧光强度，并计算β半乳糖苷酶的活性。

方法三：显微镜法1.准备样本：制备待测试的组织切片或细胞样本。

2.染色：使用具有底物性质的染色剂（如X-β-D-GlcA）来染色。

3.显微镜观察：使用显微镜观察到染色后的样本，测量正、负染色细胞的数量。

4.统计分析：根据正、负染色细胞的数量计算出β半乳糖苷酶的活性。

方法四：酶组学技术1.准备样本：收集待测试的细胞或组织样本。

2.酶组学分析：使用高通量酶组学技术（如蛋白质微芯片）来评估多个酶的活性。

3.数据分析：将得到的酶组学数据进行统计分析，计算β半乳糖苷酶的活性。

4.结果验证：使用其他方法对结果进行验证，如比色法、荧光法或显微镜法。

结论根据上述介绍的方法，研究人员可以选择适合自己研究需求的β半乳糖苷酶染色统计方法。

无论是比色法、荧光法、显微镜法还是酶组学技术，都可以提供准确的β半乳糖苷酶活性数据，助力相关研究的开展。

在选择方法时，需根据实验条件、设备设施和预算等因素进行综合考虑，以确保研究结果的可靠性和准确性。

迪信泰检测平台
β-半乳糖苷酶检测
β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase）是广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中的一种水解酶，能够催化β-半乳糖苷键水解，还具有转半乳糖苷的作用。

β-半乳糖苷酶不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还可以在多糖代谢、细胞壁组分代谢过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。

此外，β-半乳糖苷酶可作为老化的标志物以及监测基因表达的指标印记。

因此，β-半乳糖苷酶已广泛应用于食品工业、生物技术和医药等领域。

迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测β-半乳糖苷酶的活性变化。

此外，我们还提供其他糖代谢类检测服务，以满足您的不同需求。

生化法测定β-半乳糖苷酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。

周期：2~3周。

项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）。

2. 相关参数（中英文）。

3. 图片。

4. 原始数据。

5. β-半乳糖苷酶活性信息。

迪信泰检测平台可根据需求定制其他物质测定方案，具体可免费咨询技术支持。