序列比对之Clustalx与Clustalw使用指南

一、实验目的：1、了解用ClustalX软件做多序列比对分析
2、掌握并实际操作用ClustalX做多序列比对分析
二、实验过程：
用ClustalX做多序列比对分析图示
1、打开程序
如下图所示：
2、Load Sequnce, 载入序列
如下图所示：
3、选择序列文件，FASTA格式的如下图所示：
4、用文本编辑器察看FASTA序列文件内容，这里用的是记事本，推荐用EditPlus或者Ultraedit 如下图所示：
5、序列Load进去之后如下图所示：
6、Do Complete Alignment, 通常情况下直接选这个即可，无须修改比对参数如下图所示：
7、点Do Complete Alignment之后弹出的文件对话框，.dnd的是输出的指导树文件，.aln的是序列比对结果，它们都是纯文本文件
如下图所示：
点“ALIGN”之后开始等待，如果序列不多，很快就可以算完，如果数据很多，可能要等一段时间，这时候可以用眼睛盯着ClustalX的状态栏，那里会有程序运行状态和现在正在比对那两条序列的提示信息，看看可以消磨时间。

8、比对结束之后，我们可以看到这个结果
如下图所示：
二、在NCBI搜索CO1基因1．NCBI首页：
2．搜索
3．下载序列：
三、用clustal X软件对下载的学列进行多学列对比：1．用记事本查看序列：
2．序列对比结果：
3．生成的dnd和aln文件（用记事本打开）：。

序列比对之Clustalx与Clustalw使用指南这几天实验需要做多序列比对，很久不做了，一时之间不知道如何使用clustal这个工具了。

在网上搜集了一些资料，做个整理，总结了Clustalx和Clustalw的使用，省得以后久不使用又生疏了，又要去整理了，在此分享给大家，希望有所帮助。

1.先提供下载地址：官方下载地址：/download/current/Clustalx、Clustalw的各种最新版本都能下载到，包括linux、Win、Mac...2.原理：序列同源性分析：是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小。

这是理论分析方法中最关键的一步。

完成这一工作必须使用多序列比较算法。

常用的程序包有CLUSTAL等;Clustal是一个单机版的基于渐进比对的多序列比对工具，由Higgins D.G.等开发。

有应用于多种操作系统平台的版本，包括linux版，DOS版的clustlw，clustalx等。

CLUSTAL是一种渐进的比对方法，先将多个序列两两比对构建距离矩阵，反应序列之间两两关系;然后根据距离矩阵计算产生系统进化指导树，对关系密切的序列进行加权;然后从最紧密的两条序列开始，逐步引入临近的序列并不断重新构建比对，直到所有序列都被加入为止。

3.操作3.1 Clustalx的操作第一步：输入序列文件。

第二步：设定比对的一些参数。

参数设定窗口。

第三步：开始序列比对。

第四步：比对完成，选择保存结果文件的格式--------------------------------------------3.2 Clustalw的使用(一)第一步：按屏幕提示选择1，输入序列文件注意：请把你需要比对的多条序列合并为一条，放在一个文件中第二步：选择保存文件的形式，按提示选择，你会的!第三步：参数设置好后，按Enter返回主界面，开始比对!EBI提供的在线clustalw服务/clustalw/可以在这里得到更多关于clustal的帮助：http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/Top.html。

实验四基于CLUSTAL算法的多重序列比对分析1. CLUSTAL简介CLUSTAL是对核苷酸或蛋白质进行多序列比对的程序，也可以对来自不同物种的功能相同或相似的序列进行比对和聚类，通过构建系统发生树判断亲缘关系，并对序列在生物进化过程中的保守性进行估计。

CLUSTAL有CLUSTALX和CLUSTALW之分，CLUSTALW 是以命令行格式运行，CLUSTALX则通过窗口格式进行操作。

目前最新版本为CLUSTAL 1.83，均可以从ftp:///pub/software/下载。

这里我们主要介绍CLUSTAL W，从ftp直接下载DOS文件夹下的CLUSTAL W到本地磁盘解压，其中有两个exe文件，CLUSTALW.exe是进行多序列比对和生成亲缘树的程序，而njplotWIN95则是对CLUSTALW.exe运行结果进行察看的程序。

另外还有许多在线的Clustal W服务，例如：/Clustalw/2 . 本地运行Clustal WClustal W程序能自动识别输入的序列，通常当读入的序列字母85%以上为A、C、G、T、U或N时，则被认为是核苷酸序列，反之为蛋白质序列。

进行多序列比对时，要求所有输入的序列按顺序储存于一个文件中。

当有大量的序列文件时，可以在Unix操作系统下用cat file1.seqfile2.seq……>multiseq.seq命令合并成一个文件序列的储存格式必须为以下7种格式之一，他们分别是：NBRF/PRI、EMBL/SWISSPORT、Pearson（Fasta）、Clustal（*.aln）、GCG/MSF（Pileup）、GCG9/RSF和GDE，除了“－”和“．”外所有的非字母都将被忽略。

这里我们将不同来源的15条甲硫酰胺tRNA 合成酶的氨基酸序列，保存在单一文件multiseq.file中。

进入程序安装目录，双击CLUSTALW.exe文件，进入Clustal W的主菜单界面（见图1）。

工具：JModeltest下载地址：http://darwin.uvigo.es/补充工具：Clustalx下载地址：/1.使用Clustalx 工具进行多序列比对，将结果存储为FASTA 格式2.Clustalx 工具是一种多序列比对工具。

本次实验我使用的是2.0.12 版本，和以前的输出格式相比，又多了一种新的输出格式——FASTA 格式，这个格式是将比对结果中的gap 用“- ”替换，然后存储成一般的序列格式，这个格式对接下去JModeltest 的使用十分重要。

一般情况下FASTA 格式并不是默认的输出格式，需要在设置中添加。

首先，打开Clustalx, 再选择Alignment -> Output Format Options ，在弹出的对话框中将FASTA format 打上勾即可。

另外，Jmodeltest 也可以使用NEXUS 格式。

下面是一个例子，假设有两条序列（虽然是个多序列比对工具，还是举个两条序列的简单例子比较容易理解）：>P1ATGGGGTTTAGA TAA>P2ATGTTTAGTTAA比对之后存储的FASTA 结果应该是：>P1ATGGGGTTTAGA TAA>P2- - - ATGTTTAGTTAA注意事项：A. 输出时记得要对输出的文件名进行修改，否则会把原来的文件替换掉；B. 进行比对时，比对文件必须放在纯英文的路径下，否则软件无法读取；2. JModeltest 的使用：JModeltest 下载下来后不需要再安装，直接运行即可。

使用起来也简单易懂。

首先，点击File -> Load DNA alignment ，读取比对结果的FASTA 格式文件文件，之后选择需要进行测试的模型，点击Analysis -> Compute likelihood scores ，弹出对话框：对话框提供了4 种不同模式进行计算，每种模式包含的模型具体如下：3 schemes: JC, HKY and GTR.5 schemes: JC, HKY, TN, TPM1, and GTR.7 schemes: JC, HKY, TN, TPM1, TIM1, TVM and GTR.11 schemes: JC, HKY, TN, TPM1, TPM2, TPM3, TIM1, TIM2, TIM3, TVM and GTR.选择好这后就可以点击开始计算。

C l u s t a l x多重序列比对图解教程(B y R a i n d y) 本帖首发于Raindy'blog软件简介:CLUSTALX－是CLUSTAL多重序列比对程序的Windows版本。

ClustalX为进行多重序列和轮廓比对和分析结果提供一个整体的环境。

序列将显示屏幕的窗口中。

采用多色彩的模式可以在比对中加亮保守区的特征。

窗口上面的下拉菜单可让你选择传统多重比对和轮廓比对需要的所有选项。

主要功能：你可以剪切、粘贴序列以更改比对的顺序；你可以选择序列子集进行比对；你可以选择比对的子排列(Sub-range)进行重新比对并可插入到原始比对中；可执行比对质量分析，低分值片段或异常残基将以高亮显示。

当前版本:1.83PS:如果你是新手或喜欢中文界面,推荐使用本人汉化的Clustalx1.81版链接地址:ist&ID=7435(请完整复制)应用:Clustalx比对结果是构建系统发育树的前提实例：植物呼肠孤病毒属外层衣壳蛋白P8(AA序列)为例流程：载入序列―>编辑序列―>设置参数―>完全比对―>比对结果1.载入序列：运行ClustalX，主界面窗口如下所图（图1），依次在程序上方的菜单栏选择“File”－“LoadSequence”载入待比对的序列，如图2所示，如果当前已载入序列，此时会提示是否替换现有序列(Replaceexistingsequences)，根据具体情形选择操作。

图1图22.编辑序列：对标尺(Ruler)上方的序列进行编辑操作，主要有Cutsequences(剪切序列)、Pastesequences(粘贴)、SelectAllsequences(选定所有序列)，ClearsequenceSelection(清除序列选定)、Searchforstring(搜索字串)、RemoveAllgaps(移除序列空位)、RemoveGap-OnlyColumns(仅移除选定序列的空位)图33.参数设置：可以根据分析要求设置相对的比对参数。

多序列比对软件Clustalw使用方法2011年06月23日星期四 16:44Clustal的基本思想是基于相似序列通常具有进化相关性这一假设。

比对过程中，先对所有的序列进行两两比对并计算它们的相似性分数值，然后根据相似性分数值将它们分成若干组，并在每组之间进行比对，计算相似性分数值。

根据相似性分数值继续分组比对，直到得到最终比对结果。

比对过程中，相似性程度较高的序列先进行比对，而距离较远的序列添加在后面。

作为程序的一部分，Clusal可以输出用于构建进化树的数据。

Clustal程序有许多版本，ClustalW(Thompson等，1994)，根据对亲缘关系较近的序列间空位情况，确定如何在亲缘关系较远的序列之间插入空位。

同样，相似性较高的序列比对结果中的残基突变信息，可用于改变某个特殊位置空位罚分值的大小，推测该位点的序列变异性。

ClustalW是一种渐进的多序列比对方法，先将多个序列两两比对构建距离矩阵，反应序列之间两两关系;然后根据距离矩阵计算产生系统进化指导树，对关系密切的序列进行加权;然后从最紧密的两条序列开始，逐步引入临近的序列并不断重新构建比对，直到所有序列都被加入为止。

ClustalX是CLUSTAL多重序列比对程序的Windows版本。

Clustal X为进行多重序列和轮廓比对和分析结果提供一个整体的环境。

软件下载地址:使用步骤如下:Step 1: 软件初始化界面Step 2:选择1 进入如下界面Step 3:输入序列名1Seq_650_300.txt.txt 进入如下界面Step 4:选择2 进入如下界面Step 5:选择9 进入如下界面Step 6:选择1 进入如下界面Step 7:选择4 进入如下界面Step 8:选择0 进入如下界面Step 9:直接按Enter键后进入如下界面Step 10:输入X键后进入如下界面Step 11:输入H键后进入如下界面Step 12:输入X键后进入如下界面Step 13:输入X键后进入如下界面Step 14:再次输入X键后退出界面。

实验六：多序列比对- Clustal、MUSCLE西北农林科技大学生物信息学中心实验目的：学会使用Clustal 和MUSCLE 进行多序列比对分析。

实验内容：多序列比对是将多条序列同时比对，使尽可能多的相同（或相似）字符出现在同一列中。

多序列比对的目标是发现多条序列的共性。

如果说序列两两比对主要用于建立两条序列的同源关系，从而推测它们的结构和功能，那么，同时比对多条序列对于研究分子结构、功能及进化关系更为有用。

例如，某些在生物学上有重要意义的相似区域只能通过将多个序列同时比对才能识别。

只有在多序列比对之后，才能发现与结构域或功能相关的保守序列片段，而两两序列比对是无法满足这样的要求的。

多序列比对对于系统发育分析、蛋白质家族成员鉴定、蛋白质结构预测、保守motif 的搜寻等具有非常重要的作用。

我们这节课主要学习两个广泛使用的多序列比对软件-Clustal、MUSCLE。

一、Clustal/Clustal 是一种利用渐近法（progressive alignment）进行多条序列比对的软件。

即先将多个序列两两比较构建距离矩阵，反应序列之间的两两关系；随后根据距离矩阵利用邻接法构建引导树(guide tree)；然后从多条序列中最相似（距离最近）的两条序列开始比对，按照各个序列在引导树上的位置，由近及远的逐步引入其它序列重新构建比对，直到所有序列都被加入形成最终的比对结果为止（Figure 6.1）。

Clustal 软件有多个版本。

其中Clustalw 采用命令行的形式在DOS 下运行；Clustalx 是可视化界面的程序，方便在windows 环境下运行；Clustal omega 是最新的版本，优点是比对速度很快，可以在短短数小时内比对成百上千的序列，同时由于采用了新的HMM 比对引擎，它的比对准确性也有了极大的提高，有DOS 命令行和网页服务器版。

我们今天主要学习clustalx 的使用。

范例1. 采用clustalx 进行多序列比对。

clustalx多序列比对结果建树
在ClustalX中进行多序列比对后，可以使用其提供的建树工
具将比对结果转化为树状结构。

以下是使用ClustalX建树的
步骤：
1. 打开ClustalX软件，点击"File"，选择"Open Alignment"，选择之前进行多序列比对的文件。

2. 点击"Tree"，选择"Build Tree"，进入建树参数设置界面。

3. 在参数设置界面中，可以选择不同的建树方法，如
Neighbor-Joining、UPGMA等。

可以根据需要选择合适的方法。

4. 设置完参数后，点击"OK"开始建树过程。

5. 建树完成后，可以在软件界面的右侧窗口中查看树状结构。

可以通过点击树状图上的节点来展开或折叠子树。

需要注意的是，ClustalX建树功能只是提供了一种简单的可视
化方法，用于初步了解序列的进化关系。

如果需要更加精确的进化关系推断，可以考虑使用其他更专业的建树软件如PhyML、PAUP*等。

利用clustalx 2.1对蛋白进行多序列比对目录1. 方法介绍1.1概念1.2理论基础1.3任务1.4目的2研究内容3. 工具3.1 clustalx简介3.2 clustalx 后台运作流程3.3 clustalx的下载3.4 clustalx菜单设置4.操作步骤4.1获取目标序列4.2执行比对4.3 treeview软件制作进化树5. 结果分析正文1. 方法介绍：多序列比对1.1 概念：多序列比对即通过多个核苷酸或氨基酸的序列进行比较，确定序列之间可能由于功能、结构或进化上的关联而形成的相似片段。

1.2 理论基础：1）生物学一个最基本的假设是地球上所有物种都有共同的祖先，从这个祖先开始以树状形式发展，通常称为生命之树。

2）基于序列比对的同源即具有共同祖先。

同源序列一般相似；相似可以用百分比来描述。

序列不一定是同源的，相似序列在进化上具有趋同性。

序列决定结构，结构决定功能。

3）现有的基因、蛋白质等携带生物学信息、具有生物学功能的分子都是由原有的分子演化而来；现有的基因及其他核酸序列，都是由已经存在的基因或其他序列经过复制、转移、合并、删减等方式形成的；不同物种的基因、蛋白质在结构、序列上的相似性与其进化上亲缘关系密切相关。

1.3 任务：发现序列之间的相似性，找出序列之间共同的区域，辨别序列之间的差异。

1.4 目的：通过“相似序列→相似的结构→相似的功能“来判别序列之间的同源性，进而推测序列之间的进化关系。

2. 研究内容：通过对人类、家鼠、大鼠和鸡体内BMP-2（bone morphogeneticprotein 2）即骨形态发生蛋白2的多序列比对得到的dnd结果文件来揭示在四种生物中的该蛋白的同源性。

3. 工具：clustalx 2.13.1 clustalx简介：Clustal是用来对核酸与蛋白序列进行多序列比对的软件，可以用来发现特征序列，进行蛋白分类，证明序列间的同源性，帮助预测新序列二级结构与三级结构，确定PCR引物，以及在分子进化分析方面均有很大帮助。

ClustalX Help可以在下列地址得到 ClustalX 的最新版本:ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/ClustalX/General help for CLUSTAL X (1.8)Clustal X 是一个windows 界面多序列对比程序。

可以用剪切和粘贴的方法改变对比的顺序；可以在比对中选择较小的区域重新比对，并将比对的结果插回到原来的比对结果中。

能够进行比对质量评定，低分片断和多余的残基将突出显示。

序列输入序列和轮廓（已经存在的比对）利用菜单文件输入，所有的序列必须放到一个文件中，7种序列可以被自动识别： NBRF/PIR, EMBL/SWISSPROT, Pearson (Fasta), Clustal (*.aln), GCG/MSF (Pileup), 除用于表示间隙的"-" 例外 ("." in MSF/RSF)，所有的非字母字符将被忽略。

序列和轮廓比对Clustal X 有两种比对格式: 多重比对格式和轮廓比对格式。

做一系列序列的多重比对时要保证选择多重比对模式，然后展示单一序列数据。

比对菜单既可以产生比对的指导树又可根据指导树进行比对，还可以做全多重比对。

在轮廓比对模式下，出现两个序列数据区，允许对两个比对结果进行比对。

轮廓允许添加新序列到旧的比对中，或者应用二级结构指导比对进程。

旧比对中的间隙用 "-"表示。

轮廓可以用以下任何一种格式输入，只有用 "-" (or "." for MSF/RSF) 代表每一个间隙位置。

在轮廓比对状态下， "Lock Scroll"按钮 is displayed which allows you to scroll the two profiles together using a single scroll bar. When the Lock Scroll is turned off, the two profiles can be scrolled independently.进化树进化树可以从旧的比对或新比对中产生。

实验三：多条序列比对——Clustalx（一）ClustalXClustal是一种利用渐近法（progressive alignment）进行多条序列比对的软件。

即从多条序列中最相似（距离最近）的两条序列开始比对，按照各个序列在进化树上的位置，由近及远的将其它序列依次加入到最终的比对结果。

（Figure 3.1）/1.安装clustalx程序。

双击安装clustalx-2.0.12-win.msi.exe文件到自己的电脑上。

也可从/download/current/下载，列表中的倒数第二个文件。

clustalx-2.0.12-win.msiFigure 3.1 clustal 算法2.准备要比对的序列请查找至少存在于5个物种中的同源序列（核酸或蛋白质皆可），并保存为fasta格式，存为文本文件（所有的序列请粘贴到同一个文本文件中）。

选择NM、XM或NP打头的序列，不要选择NC或NW打头的序列，那是全基因组序列。

做法可参照邮箱中的preparations for practice3.doc文件。

3.打开clustalX程序开始菜单－程序－clustalX2- clustalX24.载入序列点最上方的File菜单，选择Load Sequence-选择你刚保存的序列文件，点打开。

在左侧窗口里是fasta格式序列的标识号，取自序列第一行“>”后的字符。

(Figure 3.2) 注意：ClustalX程序无法识别汉字，无法识别带空位的文件夹名，如 my document。

各位同学保存的序列文件不要保存在桌面上或带汉字的文件夹中，推荐保存在D盘根目录下。

常见文件打开错误原因：１．序列格式有问题，非正确的fasta格式。

２．文件中有序列重复粘贴。

TIPS: 想要方便识别序列所属物种，可在每条序列“>”后输入物种名，加空位即可。

EXAMPLE：原格式：>gi|262050536|ref|NM_002218.4| Homo sapiens inter-alpha (globulin) inhibitor H4 (plasma Kallikrein-sensitive glycoprotein) (ITIH4), transcript variant 1, mRNA改为：>human gi|262050536|ref|NM_002218.4| Homo sapiens inter-alpha (globulin) inhibitor H4 (plasma Kallikrein-sensitive glycoprotein) (ITIH4), transcript variant 1, mRNAFigure 3.2 载入序列5.比对参数的选择可以对两条序列比对的参数和多条序列比对的参数进行设置。