分子生物学技术62513 PPT课件

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分子生物学技术[1]
目前应用较多的非放射性标记物是生物素 (Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半 抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素， 对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳 定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物 素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行 检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子， 可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于 生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检 测灵敏度可与放射性同位素标记的相当， 而特异性优于生物素标记，其应用日趋广 泛。
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分子生物学技术[1]
为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样 后的膜进行80℃真空烘烤2h。 应用斑点印迹技术，可在一张膜上同时进 行多个样品的检测，操作简便、快速，在 临床诊断中应用较广。适合进行特定基因 的定性及定量研究，但不能鉴定所测基因 的分子量。(2) Southern印迹(Southern blot) 这是指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离 后转移到固相支持物上的过程。常规处理 如下，先用限制性内切酶对DNA样品进行 酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳将
调节基因（regulatory gene)：编码控制其他 基因表达的RNA或蛋白质产物的基因。 操纵基因（operator): 指接受来自调节基因 合成的调节蛋白的作用，使结构基因转录 活性得以抑制的特定的DNA区段，也称为 控制单元。
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分子生物学技术[1]
储藏在基因中的遗传信息分转录和转译两 步进行表达，这种遗传信息从DNA到RNA 再到蛋白质的流向，在所有的细胞类型中 都是受到高度调节的，同时在有些情况下 也是严格协同的。基因表达的此种严格调 控机理，保证细胞不会浪费能量用于合成 它所不需要的基因产物。

质粒转化大肠杆菌的过程
感受态
非定向克隆 +
或
定向克隆
克隆的片段只能按
+ 特定方向连接基因组DNA的构建基因组DNA的类型
质粒（﹤10kb)噬菌体质经双向电泳之后，用蛋白质水解酶裂解成肽段，可 用于质谱分析。通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子， 然后用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比 值（M/Z值）的蛋白离子分离开，经过离子检测器收集分离 的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。
两种离子发生方法： 基质辅助激光解吸附/离子化（MALDI)、电喷雾离子化 （ESI)
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基 因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后， 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一 种技术。
将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进 行表达，得到表达不同蛋白的一定规模的 噬菌体展示库 。
将“诱饵”蛋白固定化，基于“诱饵”蛋白与 “猎物”蛋白之间的相互作用，可将展示库 中与固定化的“诱饵”蛋白有相互作用的“猎 物”蛋白分离纯化出来，再对“猎物”蛋白进 行质谱鉴定。
四、蛋白组学研究
蛋白质分离 蛋白质分析 蛋白质相互作用的研究方法： 酵母双杂交技术，噬菌体展示技术，表
面等离子共振技术，荧光共振能量转移 技术，蛋白质微阵列芯片技术，免疫共 沉淀技术，pull-down技术
蛋白质分离
最常用的蛋白质分离技术是20世纪70年代发明的双 向电泳（2-DE），是根据蛋白质的等电点不同在pH 梯度介质中进行第一次分离，即等点聚焦（IEF)，然 后根据蛋白质分子量的不同进行第二次分离，即 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
重叠延伸PCR原理
重叠延伸PCR技术由于使用了具有互补末端的引物， 使PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。可 简单迅速的将两个DNA片段连在一起，用于嵌合基因的构 建

2024/2/3
链的延伸
RNA聚合酶沿DNA模板 移动，催化RNA链的延
伸。
转录终止
RNA聚合酶在特定信号 作用下停止转录，释放
RNA链。
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转录后修饰
包括5’端加帽、3’端 加尾等修饰过程。
RNA的加工与成熟
剪接
去除内含子，连接外显子，形成成熟的 mRNA。
编辑
对某些核苷酸进行修饰或替换，改变RNA的 编码信息。
DNA复制和修复过程中的突变 和重组为生物进化提供了原材
料。
疾病发生与发展
DNA复制和修复异常可能导致 基因突变和基因组不稳定，进
而引发疾病的发生和发展。
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RNA转录与加工
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RNA转录的过程与机制
转录起始
RNA聚合酶与DNA模板 结合，形成转录起始复
合物。
疗。
基因治疗
通过导入正常基因或修复突变基 因，恢复细胞功能，达到治疗疾
病的目的。
精准医疗
结合基因诊断与治疗，为患者提 供定制化的治疗方案，提高治疗
效果和生活质量。
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07
分子生物学技术与应用
2024/2A重组技术
利用限制性内切酶、DNA连接酶等工具酶，实现 DNA片段的切割、连接和重组，构建重组DNA分子。
8
基因组的组成与特点
基因组的定义
基因组是一个生物体所有 基因的总和，包括核基因 组和细胞器基因组。
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基因组的组成
基因组由DNA序列、RNA 序列和蛋白质序列等组成， 其中DNA序列是主要的遗 传物质。
基因组的特点

• 沉降系数(sedimentation coefficient, S)
蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示,沉 降系数与蛋白质的密度和形状相关 。
因为沉降系数S大体上与分子量成正比关系，故可 应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高 度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。
蛋白质的分子量和沉降系数
基因工程的基本原理! 生命的起源？
基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系
基因组学是基础、 转录组学是信息、 蛋白质组学是功能、 代谢组学是结果。
整合也是创新
• 方法的结合 • 形态与机能研究的结合 • 中西医的结合
21世纪分子医学发展的主要领域
• 分子诊断 • 基因治疗 • 生物工程药物
第一讲
++ +
+
+
+ ++
带正电荷的蛋白质
碱
酸
不稳定的蛋白质颗粒
－－
－
－
－
－－ －
带负电荷的蛋白质
溶液中蛋白质的聚沉
•免疫沉淀法（immunoprecipitation）
将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特 异抗体。
利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原 抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得 抗原蛋白。
测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法
• 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺 序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨 基酸顺序的结果。
氨基酸和肽的末端测定法
化学法
二硝基氟苯法（DNP法）
肼解法
二甲基氨基萘磺酰氯法（Dansyl-氯法）还原成氨基醇法
溶解法

• 核酸研究中的应用十分广泛。
探针技术
• 探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的 序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此 可用于检测核酸样品中的基因。
• 标记物：同位素、生物素或荧光染 Nhomakorabea • 核酸片段：人工合成、克隆的基因组DNA、
cDNA、RNA • 探针种类：DNA、RNA
印迹技术(Blotting): 将在凝胶中分离的 生物大分子转移(印迹)在固相化介质上 并加以检测分析的技术。
(1) DNA 印迹: Southern blotting (2) RNA 印迹: Northern blotting (3) 蛋白质印迹: Western blotting
印迹技术基本原理
凝胶电泳
转移
杂交
放射自显影 或化学显色
Southern blotting（DNA印迹技术）
组织或细胞中基因组DNA经限制性内切酶消 化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝 胶放入变性溶液变性后，使胶中的DNA分子转移 到NC膜上。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜 上，用于杂交反应可进行DNA印渍。
三个步骤为一个循环。新合成的DNA分子作 为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次） 后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要用途
目的基因的克隆 为重组DNA获得目的基因提供了简便快速的方法
基因的体外突变 利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因 的嵌合、缺失、点突变等改造。
DNA和RNA的微量分析 一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR 的检测需要。
DNA序列分析 基因突变分析
PCR衍生技术
反转录PCR技术
mRNA反转录生成cDNA, cDNA 为模板PCR扩增

3’
ATGCGGTACCAT
5’ 测序模板
5’
TA
5’
TACGCCA
第一套反应
5’
TACGCCATGGTA
TA C TACGC
第二套反应
TACGCC
TACG TACGCCATG
第三套反应
TACGCCATGG
T TACGCCAT TACGCCATGGT
第四套反应
A CGT
A
TACGCCATGGTA
T
②促进 突变基因对Bip基因表达的促进作用降低，进而影响了感光细胞中
的蛋白质折叠
11.（1）mRNA 核糖体 （见右图）
干扰人类其他基因的表达
（2）CO2（1分） 选择透过（1分） 种的肠癌细胞没有排斥反应
无胸腺，失去特异性免疫，对接
（3）反义脱氧核苷酸链 瘤体重量 （更加）接近100%
1. 5对 1、2、4
2.AD
3.⑴正常启动子P左侧序列未知 BglII和DNA连接
MscI C和B
⑷卡那霉素
X-Gluc 正常启动子P驱动gus基因仅在幼根及根毛中
特异性表达，而缺失体中gus基因在根、叶和花粉均表达
M、Q
4.（1）1、2、3 第3和第2枝段的PbmRNA 依次出现
由第1枝段依次向2、3枝段运输
（2）逆转录 mRNA
TACGCCATGGT
G TACGCCATGG
G
TACGCCATG
T
TACGCCAT
A
TACGCCA
C TACGCC
C TACGC G TACG
C TAC A TA TT
2.自动化测序 双脱氧链终止法荧光标记原理
ddATP-绿色荧光 ddTTP-红色荧光 ddCTP-蓝色荧光 ddGTP-橙色荧光

2024/1/30
切除修复
对于较复杂的DNA损伤 ，如嘧啶二聚体或DNA 链断裂，通过切除损伤 部位并合成新的DNA片 段进行修复。
重组修复
在DNA双链断裂等严重 损伤情况下，通过DNA 重组机制进行修复，涉 及同源序列的搜索和交 换。
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DNA重组的方式与意义
同源重组
发生在同源序列之间的重组，通过交 换DNA片段实现遗传信息的重新组合
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02
基因与基因组
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基因的概念与结构
01 基因的定义
基因是遗传信息的基本单位，控制生物性状的遗 传。
02 基因的结构
基因由编码区和非编码区组成，编码区包括外显 子和内含子。
03 基因的遗传效应
基因通过控制蛋白质的合成来控制生物的性状。
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基因组的组成与特点
01 基因组的定义
基因表达的调控方式
基因表达受到多种因素的调控，包括 转录因子、表观遗传学修饰、 microRNA等。
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03
DNA复制、修复与重组
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DNA复制的过程与特点
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DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶段，涉及多种酶和蛋白 质的参与，确保DNA的准确复制。
2 3
DNA复制的特点
结合分子生物学指标，对 药物疗效进行评估，为新 药研发和临床应用提供依 据。
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分子生物学技术在个体化医疗中的应用
基因检测
通过基因检测分析个体基 因组信息，为个体化医疗 提供基础数据。
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个体化用药指导
根据基因检测结果和药物 代谢特点，为患者提供个 体化用药建议，提高药物 治疗效果。

RNA、微小RNA、时序RNA） 翻译的自我调节 翻译后水平的调控
谢谢大家！
高级结构的形成（折叠、亚基缔合、辅基 连接）
靶向输送（翻译－运转同步机制 ，Cotranslation ；翻译后转运，Post-translation ）
原
核
生
物 概述 基
因 表
原核基因调节特点
达
调
控
基因表达（Gene expression） 基因表达调控的基本原理 基因表达的调控方式
其与DNA的结合
转座引起插入突变 造成插入位点靶DNA的少量碱基
对重复 插入位点出现新基因 引起染色体畸变 转座引起的生物进化 切除效应 外显子改组
转座机制与细菌的转座子类 似（玉米的Ac-Ds元件、果 蝇的P元件）
转作机制类似逆转录病毒 （果蝇的Copia元件）
RNA
RNA合成的特点
核mRNA的 拼接体的拼接
类型ⅰ 自我拼接
类型ⅱ自我 拼接
剪接、3’末端CCA结构、碱基修饰 内含子切除（核酸酶的作用，不是
转酯反应） 连接外显子
蛋 白 参与蛋白质生物合成的物质 质 的 蛋白质生物合成过程 生 物 蛋白质合成的干扰与抑制 合 成 蛋白质的降解
mRNA tRNA 核蛋白体 酶 供能物质、无机离子
遗传密码 密码子 密码子的特点 ORF
通用性； 连续性； 方向性； 简并性； 摆动性； 专一性。
二级结构
三级结构 种类
起始tRNA 延长tRNA
识别位点
同工tRNA
◆ 氨基校酸正接tR受N位A点
◆ 氨酰—tRNA合成酶识别位 点 ◆ 核糖体识别位点 ◆ 反密码子
功能 类型
对氨基酸有极高的专一性 对tRNA具有极高专一性 校对作用（水解位点）

转基因技术
转基因技术是将外源基因导入生物体，实现基因的过 表达或补充。转基因技术的关键在于选择合适的载体 和导入方法。
THANKS
感谢观看
基因编辑技术的应用
基因编辑技术在许多领域都有广泛的应用，如罕见病治疗、癌症免疫治疗、农业育种等。 通过基因编辑技术，可以实现对特定基因的敲除、敲入或修饰，以达到治疗或改良的目的 。
基因编辑技术的伦理问题
虽然基因编辑技术具有巨大的潜力，但也引发了伦理和法律等方面的争议。在应用基因编 辑技术时，需要充分考虑伦理和法律问题，确保技术的合理应用和规范发展。
发展趋势
基因组学、蛋白质组学、代谢组学等 多组学研究，跨学科交叉融合，生物 信息学和计算生物学的发展等。
02
分生物学基本概念
基因与DNA
基因
基因是生物体内携带遗传信息的最小 单位，负责编码蛋白质或RNA分子 。
DNA
DNA是生物体的主要遗传物质，由四 种不同的脱氧核苷酸组成，通过特定 的序列排列储存遗传信息。
高通量测序
高通量测序是指一次可以对大量DNA或RNA分子进行序列测定的技术。高通量测序技术极大地提高了 基因组学和转录组学研究的效率，为生物医学研究提供了强大的工具。
04
分子生物学应用
生物医药研究
01
02
03
药物设计与开发
利用分子生物学技术，研 究药物与靶点的相互作用 ，提高药物的疗效和降低 副作用。
分子生物学前沿研究
表观遗传学研究
01
表观遗传学研究
表观遗传学是研究基因表达的调控机制，通过研究DNA甲基化、组蛋
白修饰等机制，揭示基因表达的调控规律，以及环境因素对基因表达的
影响。
02

局限性 联合应用
RNA制备
• Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织 或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol 法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直 接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+ 分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
• RNA提取试剂盒：国产、进口 常用总RNA提取试剂盒 尽量选用含DNA酶的试剂盒
步骤
• 以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积 不能超过所用Trizol体积的10%。
• 研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的 比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
• 取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙 醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10 分钟。
• 操作过程中带手套、口罩。
PCR
• 聚合酶链式反应(PCR)扩增：指数扩增是一 种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的 RNA。
• 一种选择性体外扩增DNA的方法. • 一种将微量的目的DNA片段在体外快速、
大量扩增的技术。 • 半保留复制
• 三个基本步骤: • (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下
PCR反应体系的基本成分
• 模板: cDNA • 引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚核苷
酸片段，一般18-30bp, 上下游引物 • DNA聚合酶: 如Taq酶 • 底物: 等浓度的四种核苷酸（dNTP） • 反应环境: 含有Mg2＋的Tris-Cl缓冲液。
含DNA聚合酶的2×反应混合物
PCR反应体系的基本成分
✓ 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使 非特异性增高。