肿瘤细胞软琼脂克隆形成实验

检验技师考点：软琼脂培养法克隆
检验技师考点：软琼脂培养法克隆
(1)软琼脂的配制：含有20%NCS(小牛血清)的.2倍浓缩的RPMI1640.
①1%琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

②0.5%琼脂：由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。

置42℃保温。

(2)用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

(3)按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

(4)1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。

(5)混匀后立倾注于琼脂基底层上，在室温中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

(6)4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。

(7)检测抗体，扩大培养，必要是地再克隆化。

软琼脂克隆形成实验步骤完整版The latest revision on November 22, 2020注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。

适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。

试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。

细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。

接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。

1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWESTREGULARArgroseG10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。

2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。

提前融化血清和双抗。

3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。

4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。

5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。

对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。

6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。

每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。

克隆形成实验
克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的常用方法之一。

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体成为集落或克隆，其中细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。

贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

克隆形成依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆（Colony formation）和软琼脂克隆（soft agar colony formation）两类。

平板克隆即细胞培养在培养基中，应用于贴壁的细胞；软琼脂克隆即细胞被琼脂糖挂起来，主要应用于悬浮的肿瘤细胞和转化细胞系。

克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。

细胞克隆实验步骤及注意事项实验步骤一、平板克隆形成实验基本步骤：1.取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2.将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、2 00个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。

置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。

3.经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。

弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。

然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

4.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。

最后计算克隆形成率。

克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%二、软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：1.取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。

然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

2.用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。

3.按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(1 0cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

4.按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1. 2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。

待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。

1.双层软琼脂集落形成率实验于24 孔板中, 下层低熔点琼脂浓度为0. 5 % , 上层为0. 33 %,每孔上层低熔点琼脂含细胞数为2 000 个,每种细胞共铺5 孔。

把培养板移入CO2 孵箱,在37 ℃、5 %CO2 及饱和湿度环境下培养2～3 周后倒置显微镜下计数直径大于100μm或含50 个细胞以上的克隆,并计算克隆形成率(克隆形成数/ 接种细胞数×100 % = 克隆形成率) 。

2.软琼脂克隆形成实验将p27Kip1转染组、空载体转染组和未转染组细胞以每组600个细胞接种于60 mm 含底层5 g/L琼脂糖和顶层3 g/L琼脂糖的软琼脂中;37℃培养箱中培养14 d;倒置显微镜下观察克隆形成情况.计算克隆形成率.软琼脂克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%对照组克隆数-实验组克隆数抑制率= ×100%对照组克隆数3.软琼脂克隆形成实验用去离子水配制7 g．L-1和12 g．L -1琼脂溶液，高温高压灭菌后，于45℃水浴保温备用. 配制2×DMEM培养液，高温高压灭菌后45℃水浴保温. 将2×DMEM与12 g．L-1琼脂溶液等体积混匀后，按1 mL/孔加入24孔培养板，4℃放置30 min使之凝固. 再将2×DMEM与7 g．L-1琼脂溶液等体积混匀，之后加入单细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106个．L-1，此混悬液按每孔0.5 mL加入上述24孔板，铺平后室温放置使琼脂凝固，之后置于37℃，50 mL．L-1 CO2孵箱中培养2 wk，观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率. 同时设HO-8910为空白对照和8910-pcDNA3为空载体对照.4.软琼脂克隆形成试验细胞在35 mm的平皿中长至70％～80％铺满，然后与20 μμmol·I-1的AS －ODN。

共孵育4h，之后将细胞重悬于新鲜培养液配制6mL·L-1的底层琼脂，lml／孔加入24孔板中，调整细胞浓度并与 4 mL·L-1的琼脂混合，以每孔0.5 mL中含500个细胞加到底层琼脂上，置37℃培养2Wk后计数克隆形成数克隆大于100个细胞着计数。

细胞克隆形成实验步骤及方法细胞克隆形成实验步骤及方法一、技术简介细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等的重要技术方法。

实验方法包括平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。

由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强；初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强。

由于克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。

每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。

集落形成率表示细胞的独立生存能力。

各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。

通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测，细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。

贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

二、实验流程A．平板克隆形成实验：适用于贴壁生长的细胞。

1. 取对数生长期的各组细胞，制备细胞悬液。

2. 将细胞悬液作梯度倍数稀释，分别接种含培养液的皿中，培养2-3周。

3. 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。

4. 弃去上清液，4%多聚甲醛固定，GIMSA染色液染10-30 min。

5. 计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）× 100%。

6. 结果统计分析。

B．软琼脂克隆形成实验：适用于非锚着依赖性生长的细胞。

1. 制备细胞悬液，梯度倍数稀释。

2. 分别制备1.2%和0.7%琼脂糖溶液。

3. 下层琼脂凝固后放入37℃培养箱备用。

4. 加入细胞悬液，待上层琼脂凝固后，培养10-14天。

5. 计算克隆形成率，克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）× 100%。

学海无涯
克隆形成-琼脂平板
1、(细胞被干预（药物处理，转染，电转，感染）24小时后，作活细胞计数（台盼蓝染色），用完全培养基调整细胞密度至1×105 /ml（活细胞）；
2、(用超纯水分别配制1%的标准琼脂糖和0.7%的低溶点琼脂糖，高压灭菌后4℃保存，使用时，微波炉加热溶解，然后放在40℃水浴中至少平衡30min；
3、按1:1比例把1%的标准琼脂糖和完全培养基混合后，取1.5mL混合液加入35mm平皿中，冷却凝固作为底层琼脂；
4、把0.75 ml 0.7%的低溶点琼脂糖和0.75 ml完全培养基混合后，再向管中加入5,10,15,20,25或30μl细胞悬液，充分混匀，加入铺有底层琼脂的35mm平皿中，待上层琼脂凝固后，加入0.5-1ml完全培养基，置入37℃，5%CO2温箱中培养7-14天，每隔3-4天更换培养液；
5、待细胞克隆长至合适大小（100-200uM）取出，结晶紫染色，然后把盖子拿掉，用照相机拍照，注意拍6孔板的全貌, 手工计数克隆的数量，对数据进行统计分析；
6、实验周期比较长，一定要注意无菌操作，可以在培养液中加抗生素防止污染；注意事项：
1. 每孔接种细胞的数量，上面设计了6个细胞梯度，已经充分考虑了各种细胞的大小与生长速度；
3. 注意无菌操作，整个检测窗口为期7-14天，期间污染风险一定要控制；
4. 细胞接种至6孔板是否继续进行细胞干预？决定于处理因素起作用的时间；。

Soft Agar Colony Formation AssayDarren Carpizo, M.D.Overview: This assay is designed to assay a cell's ability to grow unattached to a surface and therefore suspended in agar. The assays are done in 6cm plates. A bottom layer of enriched media + agar is poured first (2.5ml), after solidifying this is followed by a layer containing a lower amount of agar and containing a specified number of cells (cell layer = 5ml), after solidifying a top layer is poured. The plates are placed in the incubator and after two weeks or so, colonies are counted by naked eye.1)Make sol'ns of 2X Iscove's Media (Gibco BRL, dissolve one 1L packet in 500ml of water)and filter sterilize, make about 100 ml of 1X by diluting the 2X, separate from this 100ml make 100 ml of 1X Iscove's containing 10% FBS2)Make Noble Agar (Difco) at 1.3% and place in 55° C water bath to keep in liquid phase3)Determine the number of sample pairs you will be making (a sample pair consists of oneplate control and one plate experimental. I usually made 4 sample pairs or an n of 4. Add one to this, so n of 4 +1 = 54)The bottom and top layer solutions are made as one and divided in half. The cell layersolution is made separately.5)Determine the volume of reagents that make up each of the above solutions according to thefollowing formula:Bottom/Top layer - 2X Iscove's 5ml X n sample pairs (5) = 25 mlFBS - 1ml X n sample pairs (5) = 5ml100X Glutamine .1 ml X n sample pairs = 0.5 ml1.3% Noble Agar - 5ml X n sample pairs = 25mlpour these volumes into a 50 ml conical and separate the total volume in 1/2 into one tube for the bottom and the other for the top**Do Not add the Agar until you are just ready to pour, so separate the total (without the agar) into a bottom and top tubes (the volume of agar that will be added to each will be12.5ml)Cell Layer media - 2X Iscove's 2 X n = 10ml1X Iscove's 4 X n = 20mlFBS 1 X n = 5ml100X glutamine 0.08 x n = .4 mlNoble agar 2 X n = 10ml (again do not add this until ready to pour)6)Pour 12.5 ml of 1.3% Noble agar to the bottom layer tube, mix thoroughly and pipette 2.5 mlto each of 8 plates, place in 37° C incubator7)Trypsinize cells, collect disattached cells and spin down, rususpend pellet in 5ml of 1XIscove's + 10% FBS for counting. Determine the conc of cells in cells/ml and then calculatethe volume of media that will yield 2 X 104 cells (one sample pair or n = 2 X 104 cells, or 1 X 104 cells/ 6cm plate)8)Add volume for 2 X 104 cells in a 15 ml Falcon tube containing 1 ml of 1x Iscove's media.Do this for n samples ( in this case 4 Falcon tubes, 2 control, 2 experimental)9)Add the volume of agar calculated for the cell layer to the tube containing the cell layersolution and mix thoroughly and add 9ml of the cell layer solution to each of the four Falcon tubes and mix thoroughly.10) Remove plates from incubator (bottom layer has solidified at this point) and add 5ml fromeach Falcon tube to each plate and allow to solidify for 30 min at RT.11)Add the last 12.5 ml of agar to the tube containing the top solution, mix throughly and pipette2.5ml to each plate.12)Place plates in incubator and remove when colonies can be seen with naked eye, (timingdepends of the tumorgenicity of the cell line but typically is around two weeks.13)To count colonies, take a digital picture of each 6cm plate by placing the plate on a light boxand using a digital gel photography set up. Print out a picture of each plate and manually count the number of colonies per plate. Determine the average number of colonies per plate for both control and experimental groups。

软琼脂克隆形成实验原理及步骤原理：软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用于此法。

某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。

让细胞处于不贴壁以及单细胞状态，模拟体内细胞处于半固液态的情况，在此状态下检测细胞的增殖能力。

单细胞处于soft agar中，就如胰酶消化后的状态，及圆形，此后细胞继续增殖、分裂，形成单克隆球形。

半固体环境肯定是要求恶性程度高的容易生长，所以不会比平板克隆快，只要能够和对照比较即有意义。

步骤：1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。

2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。

提前融化血清和双抗。

3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅中保持。

4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。

5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔板每孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。

对于一个6孔板，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。

6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。

一、目的：确定已转化肿瘤细胞的性质并对其进行定量;
二、原理：肿瘤细胞能无限繁殖形成细胞集落,而成熟分化的细胞则不能形成集落;CHO-EGFP和CHO-ECRT39/272细胞在体外无需加刺激因子,可在软琼脂培养基中形成集落,其他细胞则丧失了软琼脂中形成集落的能力;
三、操作
1．收集对数生长期的细胞如何鉴定,先测定细胞活力并进行活细胞计数,然后调整细胞浓度,用含20%FBS的DMEM制成1000活细胞／ml的细胞悬液;
2．用蒸馏水制备1.2%、0.7%两个浓度的低熔点琼脂糖,高压灭菌后,维持在40℃不会凝固；
3．1.2%琼脂糖和2xDMEM等体积混合,6孔板中加入1.4ml,RT凝固作为底层琼脂,置CO2温箱中备用；
4．0.7%琼脂糖和2xDMEM等体积混合,再加入细胞悬液充分混匀,RT凝固作为上层琼脂,勿有气泡,将实验组和对照组分两组加好,盖上盖并作好标记;在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固;
以上各步骤均在无菌条件下进行;
5．然后移培养板或平皿于CO2培养箱中37℃进行培养;
6．培养7～l0天,肉眼观察并计数细胞集落;
四、结果：以肉眼可见的细胞团含500个以上细胞作为计数集落的标准;集落的计数和计算：集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔,
集落形成率=集落数/接种培养细胞总数×100％。

软琼脂克隆形成实验1. 基本原理及实验目的软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用于此法。

某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。

2. 主要试剂1）5%琼脂溶液：称取5g 琼脂粉(低熔点)，溶于100ml 生理盐水，高压灭菌备用。

2）0.25%胰蛋白酶、含10%胎牛血清的培养基。

3. 操作步骤1）取对数生长期的细胞，0.25%胰蛋白酶消化，离心收集细胞沉淀。

2）完全培养基重悬，适当稀释后活细胞计数，调整细胞密度至1×103个/ml 。

3）取0.5ml 细胞悬液（即500个细胞），加入培养基，使体积达到9.4ml 。

37℃孵育。

4）底层琼脂的制备：5%琼脂置于沸水浴中，使之完全融化，取出1ml 移入无菌小烧杯中，待冷却到50度时，迅速加入9ml 预温37℃的完全培养基，混匀后立即取08ml 浇注24孔板，室温凝固。

5）上层琼脂的制备：步骤3中预温的9.4ml 细胞悬液中加入0.6ml 50℃的5%琼脂，迅速混匀，立即取08ml 浇入24孔板，置室温凝固，每孔即含有40个细胞，一般每个实验组重复3个样本。

6）常规培养2-3周。

7）将培养板置于显微镜下计数克隆数，每个细胞集落含50个或大于50个细胞为1个克隆，计算克隆形成率，拍照。

集落数=n 孔中细胞集落数总和/n克隆形成率=（集落数/接种细胞数）100%8）统计学分析：根据集落数和克隆形成率进行t 检验，分析不同组别之间的差异。

4 注意事项1）软琼脂克隆的操作相对复杂，在实验过程中一定要注意无菌操作。

2）在将琼脂于培养基混匀时，要注意琼脂温度，而且动作要迅速，避免局部结块。

3）制备好底层琼脂后，要待其完全凝固后再浇上上层琼脂。

1、平板克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。

(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。

一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。

置37℃5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。

(3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。

弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。

然后去固定液，加适量Giemsa 应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。

最后计算克隆形成率。

克隆数克隆形成率= —————×100%接种细胞数平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。

适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。

试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。

细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

2、软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。

然后根据实验要求作梯度倍数稀释。

(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。

(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。

克隆形成实验克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。

所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。

细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼至)染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。

也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。

代入下式得出细胞密度。

细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。

一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。

此外还可用0.02%的藻红B染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。

细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。

各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。

在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。

二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。

常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。

测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养一周(7天)，期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。

软琼脂法实验服务周期及流程
软琼脂法实验是一种测定细胞转化及致瘤性的实验方法。

该实验需要细胞锚定非依赖性生长状态（肿瘤细胞生长特性）。

相比于2D单层培养，该3D培养法的生长条件可以更准确地反映出癌细胞的自然生长环境，因此动物实验进行之前的软琼脂法实验是至关重要的。

实验前，将细胞（用致癌物质或致癌物抑制剂处理的）于软琼脂培养21-28天。

而后，克隆子可经细胞染色法进行形态学分析并且计数。

实验流程：
1. 基层琼脂
2. 在基层琼脂上加入细胞琼脂，培养6-8天
3. 形成克隆子
4. 溶解琼脂（形成均质细胞悬液）
5. 细胞溶解并检测。

活性分析软琼脂克隆形成实验评价药物体外抑瘤性与成瘤性*齐乃松1，2，郭建3，王雪1，文海若1**（1.中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心，药物非临床安全评价研究北京市重点实验室，北京100176；2.河南省食品药品检验所，郑州450003；3.首都医科大学附属北京同仁医院急诊科，北京100730）摘要　目的：分别采用肿瘤细胞系和转化细胞系摸索软琼脂克隆形成实验的适宜条件，并对冬凌草甲素（oridonin，ORI）的抑瘤性和没食子酸乙酯（ethyl gallate，EG）促瘤性进行评价。

方法：1）摸索实验条件：采用6孔板固态培养法，按不同密度（每孔500~20 000个）将肿瘤细胞系（Hela，K562和HepG2）和转化细胞系（Bhas 42）与软琼脂混合铺板，计数克隆形成率。

2）HepG2细胞分别与质量浓度为0.016、0.08、0.4、2、10、50 μg·mL-1的ORI溶液混合后铺板；Bhas 42细胞预先经质量浓度为0.3、1、3 μg·mL-1的EG溶液处理后，镜下观察细胞达到转化状态后，与软琼脂混合铺板培养。

经培养后观察给药处理对克隆形成率的影响。

3）利用流式细胞仪分析ORI和EG对细胞周期的影响。

结果：细胞接种密度为每孔1 000 个左右时，利用肿瘤细胞和转化细胞开展软琼脂克隆形成实验效果较好。

ORI作为抑瘤药物在低浓度条件可显著降低HepG2细胞的克隆形成率（P<0.01），且对细胞增殖有抑制作用。

EG随给药浓度增加可显著升高Bhas 42的克隆形成率（P<0.01），但对细胞增殖影响不显著。

结论：软琼脂克隆形成实验以克隆形成率为检测指标，可较为简便而灵敏地检测药物引起的抑瘤性和促瘤性。

该实验结果与细胞周期分析结果相互印证。

两者的有机结合，可用于药物对细胞增殖及成瘤性的影响的初步分析。

关键词：软琼脂克隆形成实验；试验条件；肿瘤细胞系；转化细胞系；成瘤性；抑瘤性；冬凌草甲素；没食子酸乙酯中图分类号：R 917 文献标识码：A 文章编号：0254-1793（2017）03-0444-07doi：10.16155/j.0254-1793.2017.03.12Tumor suppression effect and tumorigenicity of drugsevaluated by soft agar colony formation assay*QI Nai-song1，2，GUO Jian3，WANG Xue1，WEN Hai-ruo1**（1．Beijing Key Laboratory，National Center for Safety Evaluation of Drugs，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100176，China；2．Henan Provincial Institute of Food and Drug Control，Zhengzhou 450003，China；3．Emergency Department，Beijing Tongren Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100730，China）Abstract　Objective：To zinvestigate the appropriate conditions for soft agar colony formation assay using tumor and transformed cell lines，and evaluate the tumor suppression effect of oridonin（ORI）and the tumorigenicity of *　国家“重大新药创制”科技重大专项（2015ZX09501004-002）；中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金课题（2014C1）；北京市自然科学基金项目（7142127） **　通信作者　Tel：（010）67876252；E-mail：wenhairuo@ 第一作者　Tel：185********；E-mail：qinaisongcpu@ethyl gallate（EG）respectively．Methods：1）Experimental conditions：tumor cell lines（Hela，K562 and HepG2）and transformed cell line（Bhas 42）were mixed with soft agar on 6-well culturing plates at different density（500-20 000 cells per well），and the colony formation rates were calculated．2）HepG2 cells were mixed with ORI at concentrations of 0.016，0.08，0.4，2，10，50 μg·mL-1；Bhas 42 cells were pretreated with EG at concentrations of 0.3，1，3 μg·mL-1 and subsequently plated with soft agar while the transformation state was observed．The effects of ORI and EG on colony formation rates were examined．3）Effects of ORI and EG on cell cycles were analyzed by flow cytometry．Results：Both tumor cells and transformed cells achieved optimized effects when the cells were plated at the density of 1 000 cell per well．ORI as an antitumor drug significantly reduced the clone formation rate（P<0.01）and exhib ited inhibition effect on proliferation of HepG2 cells．EG was able to increase the clone formation rate in a concentration-dependent pattern，but had no effect on the cell proliferation．Conclusion：In the soft agar colony formation assay，clone formation rate is used to estimate the tumor suppression effect and the tumorigenicity induced by drugs in a simple and sensitive manner．Our colony formation assay results are consistent with the cell cycle analysis data．By combining both methods，drug-induced cell proliferation and tumor suppression/ tumorgenicity could be effectively predicted．Keywords：soft agar colony formation assay；test conditions；tumor cell lines；transformed cell lines；tumorigenicity；tumor suppression effect；oridonin；ethyl gallate软琼脂克隆形成实验采用肿瘤细胞系或转化细胞系，通过观察细胞在软琼脂中的细胞集落形成能力，对其可能发生转化并在动物体内的成瘤性潜能进行评价。

克隆形成试验-软琼脂克隆形成试验克隆形成率细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。

而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。

并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

1、平板克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。

(2)将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。

一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。

置37℃ 5% CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。

(3)经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。

弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。

加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分钟。

然后去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

(4)将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。

最后计算克隆形成率。

克隆数克隆形成率= —————×100%接种细胞数平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。

适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。

试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。

细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

2、软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。

人恶性肿瘤细胞的克隆培养
刘文;高凌
【期刊名称】《实用癌症杂志》
【年(卷),期】1989(004)001
【摘要】在双层软琼服上用食管癌、乳腺癌、卵巢癌等60例肿瘤标本作细胞克隆培养,其中73%形成≥5克隆/50万接种细胞。

而≥30克隆/50万接种细胞的阳性率为58%。

对克隆形成观察时间的比较研究表明,培养12～14天判定结果比较合适。

此外,比较了单层软琼脂与双属软琼脂的克隆培养效果。

初步结果表明,单层软琼脂
在所用的营养条件下克隆形成率几乎与双层软琼脂的效果相当。

【总页数】2页(P12-13)
【作者】刘文;高凌
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R73－351
【相关文献】
1.人脐静脉血内皮克隆形成细胞的分离培养与鉴定 [J], 周丽;常青;李自成
2.有限稀释克隆法培养分离人牙周膜干细胞实验研究 [J], 封艳;牛巧丽;尹宏斌;钟
良军;赵今
3.内皮克隆形成细胞条件培养基对人真皮成纤维细胞生物学作用的影响 [J], 王布霖;吴燕虹;王玉芝;郭晓瑞;李勤
4.人参培养细胞单细胞克隆的条件培养 [J], 罗建平;郑光植
5.全人源抗VEGF165单克隆抗体培养工艺的研究 [J], 李昕然;刘睿;刘方堃;刘煜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。