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双水相萃取

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《双水相萃取技术》课件

《双水相萃取技术》课件
影响因素
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2

双水相萃取解析

双水相萃取解析

➢ 一般采用室温操作： 成相系统聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋 白质不会发生变性； 常温下溶液粘度较低， 容易相分离； 常温操作节省冷却费用。
4.双水相萃取技术的发展
（1）历史：
➢ 早在1896年，Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与 可溶性淀粉溶液相混时，得到一个混浊不透明的溶液，随 之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉）， 这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility）； ➢ 20世纪60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A及同事 最先提出了双水相萃取技术； ➢ 1979年，西德的Kula M R等人首次将ATPE应用于生物产 品分离；
➢大量研究表明：生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统 间的各种相互作用，主要有静电作用、疏水作用和亲和作用等， 其分配系数可为各种相互作用之和。
ln m ln me ln mh ln ml
①静电作用：两相系统中若有带电溶质存在，会ห้องสมุดไป่ตู้大分子在两 相间的分配系数产生影响。（图5-15） Donnan Potential:当大分子或粒子带有静电荷时，在带有电荷 分配不相等时，就会在两相间产生电位差，称为道南电位。 ②疏水作用：某些大分子物质表面具有疏水区，溶质的表面疏 水性会对其在两相间的分配系数产生影响。
3.影响双水相分配的主要因素
高聚物的相对分子质量 高聚物的浓度 盐的种类和浓度 PH值 温度
（1）高聚物的相对分子质量：
➢在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的相对分子质 量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如细 胞或细胞碎片和细胞器，将更多地分配于该相。
以PEG-Dextran体系为例，↓Dextran→K↓ ↓PEG→K↑（表5-4）

双水相萃取详细资料

双水相萃取详细资料

三步两水相萃取酶的流程：
细胞匀浆液
第一步双水相萃取
+PEG +盐（或是葡聚糖）
分离机
下相 ） 细胞碎片
杂蛋白 （核酸、多糖）
上 相（PEG相
（目标产物）如prot、E +盐
第二步双水相萃取 静置分层
下 相（盐相） 核酸多糖
上 相（PEG相） 目标产物
杂蛋白
（亲水性较强）
+盐
第三步双水相萃取 静置分层
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
➢ 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
优点：1.与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的 扩散阻力，故反应速度快，生产能力较高；2.生物催化剂在两水 相系统中教稳定；3.两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度 分散的系统，分散相液滴在10μm一下，有很大的表面积，有利于 底物和产物的传递。
PEG系统中细胞碎片分配到下相中较容易 分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐（有时也可 加入适量的PEG），尽兴第二次双水相萃取，以除去多 糖和核酸，它们的亲水相较强因而容易分配在盐相中， 而蛋白质就留在了PEG相中；在第三步萃取中，应该使 蛋白质分配在盐相中（例如：调节pH），以使和主体 PEG分离。色素由于其疏水性，通常分配在上相。主体 PEG可循环使用，而盐相蛋白质则可用超滤方法去除残 余的PEG以提高产品的纯度。

蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术

蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术

蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。

双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。

1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。

早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。

双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。

双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。

当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。

双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。

美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。

2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，在粮食、食品加工，以及医药行业等都经常使用，由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。

双水相萃取

双水相萃取
如下图中， 如下图中，
2.2％的葡聚糖水溶液
0.72％甲基纤维素钠的水 ％ 溶液 葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
{
发现, 早在1896年,Beijerinck发现 当明胶与琼 年 发现 脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个 混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含 明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称 聚合物的不相溶性（ 为聚合物的不相溶性（incompatibility） 聚合物的不相溶性 ） 从而产生了双水相体系(Aqueous two phase 双水相体系(Aqueous 双水相体系 ATPS)。 system, ATPS)。
当两种高聚物水溶液相互混合时， 当两种高聚物水溶液相互混合时， 它们之间的相互作用分为三类： 它们之间的相互作用分为三类： 互不相溶(imcompatibiliy) 互不相溶 复合凝聚(complex coacervation) 完全互溶(complete miscibility)
2.2 双水相体系的组成
pH影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋 影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋
白质所带电荷和分配系数。
离子环境也有影响。
5.3 疏水反应的影响 疏水反应的影响
消除电化学效应后， 消除电化学效应后，粒子表面的疏 水性占主要地位。 水性占主要地位。如被分配的蛋白 质具有疏水性的表面，则其分配 可以改变。 系数可以改变。
(4)分相时间短，自然分相时间一般 5min～15min； 为5min～15min； (5)界面张力小(10-7～ 10-4mN／m)， (1010-4mN／m)， 有助于两相之间的质量传递； 有助于两相之间的质量传递； 不存在有机溶剂残留问题， (6)不存在有机溶剂残留问题，高 聚物一般是不挥发物质， 聚物一般是不挥发物质，对人体 无害； 无害；

第五章 双水相萃取

第五章 双水相萃取

• 盐离子 • pH值 • 温度
五、双水相萃取工艺流程
六、双水相萃取应用
1）蛋白酶的提取、纯化 2）核酸的提取、纯化 3）细胞调节生长因子的提取：β—干扰素、EPO等 4）病毒的提取、纯化 5）生物活性物质的分析检测
七、双水相萃取的研究进展
1. 2. 廉价双水相体系的研究开发 双水相萃取与其它分离技术的结合
5.Βιβλιοθήκη 6.第五章 双水相萃取
（Aqueous Two-phase Extraction）
一、概述
1、定义——利用生物物质在
互不相溶的两水相间分配系数的 差异进行分离的过程
PEG——聚乙二醇 Dextran(DEX)——葡聚糖
图1 PEG/DEX形成的双水相的组成
2、双水相体系
1) 双水相体系的形成——高聚物分子间的作用力
思考题
1. 2. 3. 4. 何谓双水相萃取？ 双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那两 种？ 为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分 离？ 影响双水相萃取的因素有那些？当电解质存在，pH 是如何影响双水相萃取的？ 用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目 标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分 布在下相，为什么？ 何谓双水相亲和萃取？
• 作用力为斥力：形成双水相体系 • 作用力为引力：形成两相，其中一相为两高聚物相，一相 为水相 • 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形成均一相
2)双水相体系的种类
–
–
两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）
其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）
–
–
两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）

双水相萃取

双水相萃取

各种双水相系统
聚合物1 聚合物1 聚丙二醇 聚合物2 聚合物2或盐 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚 糖 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 聚乙烯醇，葡聚糖， 羟甲基葡聚糖，葡聚糖 羟甲基葡聚糖， 葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠， 石酸钾钠， 石酸钾钠，磷酸钾
4、电化学分配 、 i、盐的种类及浓度 、
pH 升高, H2PO4- HPO42- PO43在PEG / K2HPO4 系统使带负电蛋白 蛋白有较高的K。 蛋白
ii、 pH 值的影响 改变两相的电位差 如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大， 则蛋白质在两相中分配越不均匀。 pH 值的变化也会导致组成体系的物质电 性发生变化，也会使被分离物质的电荷发 生改变，从而影响分配的进行。
6、双水相萃取的工艺流程 、 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取; 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取 PEG的循 的循 无机盐的循环。 环; 无机盐的循环。
一、目的产物的萃取： 目的产物的萃取： 第一步，匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进 和无机盐在萃取器中混合， 第一步，匀浆液与 和无机盐在萃取器中混合 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（ 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（PEG相）， 相 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（ 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（富盐 相） 。 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系， 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系，将目标蛋白 质转入富盐相，从而将蛋白质与PEG分离，以利于使用超 分离， 质转入富盐相，从而将蛋白质与 分离 滤或透析将PEG回收利用。 回收利用。 滤或透析将 回收利用 的回收循环： 二、PEG的回收循环： 的回收循环 加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收PEG; ①加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 相通过离子交换树脂， ②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 相通过离子交换树脂 用洗脱剂先洗去PEG，再 ， 洗出蛋白质。 洗出蛋白质。 无机盐的循环： 三、无机盐的循环： 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。 相的盐。 膜分离法回收盐类或除去 相的盐

双水相萃取技术

双水相萃取技术

新型功能双水相系统
温度敏感型双水 相体系
聚合物浓度的影响
聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的 长度为零，此时分配系数为1，即组分均 匀的分配于上下相. 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合 物的总浓度增大，系统远离临界点，系线 长度增加，两相性质的差别(疏水性等)增 大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点 处的值(K=1)，即大于1或小于1。因此,成 相物质的总浓度越高，系线越长，蛋白质 越容易分配于其中的某一相。
盐的种类影响
在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数， 不同电解质的正负离子的分配系数不同，从而产生不 同的相间电位。由于各相要保持电中性，使得带电生 物大分子，如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。
盐浓度的影响
盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰 乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相 体积比。 例如，PEG/磷酸盐体系中上下相的PEG和磷酸 盐浓度及Cl-在上下相中的分配平衡随添加NaCl 浓度的增大而改变，这种相组成即相性质的改变 直接影响蛋白质的分配系数，如图。 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这 一特点，通过调节双水相系统的盐浓度，可有效 地萃取分离不同的蛋白质。
lnK=lnK0+lnKe+lnKh+lnKb+lnKs+lnKc
式中，下标e、h、b、s、c分别表示静电作用、疏水作用、生 物专一性、分子大小、形态结构对分配系数的贡献。lnK0是 包括其他因素（盐的水合作用、配体相互作用）在内的分配 系数。
静电作用
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影 响，利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表 达式： lnK=Mλ/RT M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数;R-玻尔兹曼常数；T-绝对温度。 生物大分子物质的M值一般很大，λ的微小变化 会引起分配系数很大的变化。因此利用不同的表面 性质，可以达到快速分离非电介质型的大分子溶质 的目的。

5.3 双水相萃取

5.3 双水相萃取

5.3.5 双水相萃取体系的影响因素
8
盐类的影响
7 6 5 4 3 2 1 0 0 0.1 0.2 ×Ë Á á ¼ Ø £ ¨ 0.3
µ KÖ
盐浓度对K值的影响
○普鲁兰酶，9%PEG4000 /1.25%DexT500 ,pH7.8 □富马酸脱氢酶，9%PEG4000 /2%DexT500 , pH7.5 ●甲醛脱氢酶，9%PEG4000 /2%DexT500 , pH7.5 ▣1,4-葡萄糖磷酸化酶，7.2%PEG4000 /6.7%DexT500 , pH7.5
5.3.5 双水相萃取体系的影响因素
聚合物分 子量的影响
1.9
ý K µ Ê ä Ï ·Å Ö
1.4 0.9 0.4 0 0.5 1 1.5 2
Ͼ Æ ÛÌ Ç· Ö× ÓÁ ¿× 100000
葡聚糖平均分子量对酶的分配系数的影响
■ 异亮氨酰基-tRNA 合成酶，9.3%PEG/6.2%Dex,73mM 磷酸钾，pH7.0 ▤ α -糖苷酶，10%PEG/5%Dex,100mM 磷酸钾，pH6.3
• 酶的双水相萃取可以在室温下进行.
• 使用 PEG/(NH4)2SO4 相系统从细菌中萃取荧光素酶时， 温度对分配系数的影响不明显。
5.3.5 双水相萃取体系的影响因素
双水相体系的性质
• 黏度：
• 两相密度差：
• 表面张力：
不仅影响相分离速度 和流动特性，而且影 主要决定于体系的组成 响物质的传递和颗粒 和两相间组成的差别， 在两相中的分配； 在相图上体现在与结线 的长度成线性关系； 一般加入不同比例 的磷酸盐和氯化钠 来控制相间电势
1）定义： •将对目的酶具有离子交换、疏水作用或适当亲和力的亲和

双水相萃取技术

双水相萃取技术

一般来说，双水相萃取时，如果相系统组成位于临界
点附近，则蛋白质等大分子的分配系数接近于1。高
聚物浓度增加，系统组成偏离临界点，蛋白质的分配
系数也偏离1，即K＞1或K＜1 。
盐对带电大分子的分配影响很大。各种盐的分
配系数存在着微小的差异，产生了相间电位。由 于蛋白质等大分子在水溶液中常带有电荷，相间 电位造成的静电力能影响所有带电大分子和带电 细胞粒子在两相中的分配。例如，DNA萃取时，
高聚物（P） 聚丙二醇 聚乙二醇 甲基纤维素 乙基羟乙基纤维素 羟丙基葡聚糖 聚蔗糖 聚乙二醇
高聚物或低聚物（Q） 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 羟甲基葡聚糖，葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石 酸钾钠

温度的影响是间接的，它主要影响相的高 聚物组成，只有当相系统组成位于临界点
附近时，温度对分配系数才具有较明显的
作用。

对酶的分配系数也有很大关系，特别是在系
统中含有磷酸盐时，由于pH的变化会影响
磷酸盐是一氢化物还是二氢化物磷酸盐的存
在，而一氢化物磷酸盐对界面电位有明显的
影响。

Dextran、FiColl、淀粉、纤维素等高聚物具有光学 活性,它们应该可以辨别分子的D、L型。因此，对
从10ml直接放大到1m3规模（105倍）,而各种试验参
数均可按比例放大，产物收率并不降低。
生物化学
细胞生物学 生物化工
食品化工


主要是分离蛋白质 ，酶，病毒，脊髓病毒和线病 毒的纯化，核酸，DNA的分离，干扰素，细胞组 织，抗生素，多糖，色素，抗体等。 目前，用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过 程也达到相当规模，I-Horng Pan等人利用 PEG1500/ NaH2PO4体系从Trichoderma koningii发酵液中分离纯化β-木糖苷酶，该酶主 要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，纯化倍 数33。

双水相萃取

双水相萃取

操作步骤
一、重点 双水相萃取放大容易：一般10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模。具体实验步骤： 1、配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相，每个双水相改变一个参数。 2、加入料液，再加水使整个系统质量达到5~10g。离心管封口后充分混合。 3、1800－2000g下离心3－5min，使两相完全分离。 4、用吸管或移液管将上相和下相分别吸出，测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性，计算分配系数。 5、上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比，以检验是否存在沉淀或界面吸附现象，并可确认浓度或活 性测定中产生的系统误差。 6、分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水相系统。 二、特点： 1、含水量高（70%～90%），适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活。 2、不存在有机溶剂残留问题。3、易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。
可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/ 葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。另外，聚合物与 无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃 取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。
原理
某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成 双水相系统（aqueous two-phase system,ATPS）。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质， Albertsson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又称双水相分配法。 20世纪70年代,科学家又发展了双水相萃取在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离和纯化 开辟了新的途径。

双水相萃取技术

双水相萃取技术

三、双水相萃取3.1 双水相萃取的原理及特点3.1.1 双水相萃取的原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。

当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。

分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。

3.1.2 双水相萃取的特点双水相体系萃取具有如下特点：(1)含水量高(70%~90%)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)分相时间短，自然分相时间一般为5~15min；(3)界面张力小(10-7~10-4mN/m)，有助于强化相际间的质量传递；(4)不存在有机溶剂残留问题；(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于工程放大和连续操作。

由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。

3.2 双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。

在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。

在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%)，PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。

萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。

用PEG/(NH4)2SO4双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)，pH=8，α-淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。

07双水相萃取法

07双水相萃取法
但一般来说，当双水相系统离双节 线足够远时，1～2℃的温度改变不 影响目标产物的萃取分离。
29
由于高聚物对生物活性物质有稳 定作用，在大规模生产中多采用常 温操作，从而节省冷冻费用。但适 当提高操作温度，体系黏度较低， 有利于分离。
30
2.2 双水相萃取过程
双水相萃取过程包括以下几个步 骤：
双水相的形成； 溶质在双水相中的分配； 双水相的分离。
31
2.2 双水相萃取过程
在实际操作中，经常将固状(或浓 缩的)聚合物和盐直接加入到细胞匀 浆液中，同时进行机械搅拌使成相 物质溶解，形成双水相。
溶质在两相中发生物质传递，达 到分配平衡。
32
聚合物和盐的溶解多为萃取过程 的速率控制步骤。达到分配平衡后 的两相分离可采用重力沉降(静置分 层)或离心沉降法。
易定量控制； 水溶性的高聚物难以挥发，使反萃
必不可少发展
1．双水相萃取与细胞破碎过程相结合 2．亲和双水相萃取 3．双水相萃取与膜分离相结合 4．使用带配基的吸附剂微粒特异性地吸附待
分离的生物大分子，利用微粒与杂蛋白分配系 数的差别，分离某些难以分离的生物大分子。 5．双水相萃取与生物转化过程结合
40
8
1.2 相图
把双水相体系中的组成成分，分 别以不同的浓度相混，然后观察其 成相过程，把此过程以图的形式描 绘下来，即称为此种双水相体系的 相图。
不同的双水相体系，其成相条件 是不同的，相图常被用于研究不同 双水相体系中的成相现象。
9
10
用A点代表体系总组成，B点和C点分别代 表互相平衡的上相和下相组成，称为节点。
33
2.3 双水相萃取的优点▲
双水相萃取对于生物物质的分离和 纯化表现出特有的优点和独有的技 术优势，具体表现在以下方面： ①易于放大。各种参数可以按比 例放大而产物收率并不降低。

双水相萃取全解

双水相萃取全解

双水相体系的双结线模型
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
双节线 均相区
两相区 系线
临界点
二、双水相萃取工艺流程操作
工艺流程主要由三部分组成：
• 目标产物的萃取 • 聚合物（PEG)的循环 • 无机盐的循环
双水相萃取工艺流程图
萃取液 相似相溶原理
上相
PEG
ATPE
无机盐
相体系回收示意图
PEG的循环
2）聚合物及其相对分子质量
不同聚合物的水相系统，疏水性不同； 同一聚合物，疏水性随分子量增加而增加， 其大小的选择取决于萃取过程的目的和方 法，在PEG/Dex体系中，PEG分子量的 减少，会使萃取液在两相中的分配系数增 大，当PEG的分子量增加时，在质量浓度 不变的情况下，亲水性蛋白质不再向富含 PEG相中聚集而转向另一相。
R=Vt／Vb，K=Ct／Cb，G=1/RK， Y=（1+1／RK）-1 ×100％
式中：R－相比；Vb－下相体积，mL；
Vt－上相体积，mL； K－分配系数； Cb－下相溶质的质量浓度，g／mL； Ct －上相溶质的质量浓度，g／mL； G－上、下相溶质的质量比； Y－萃取率，％。
(3) 双水相相图制作
综合利用以上因素，可通过实验确定最佳双 水相萃取系统。以PEG/硫酸铵双水相体系萃取 一种蛋白质为例： （1）固定硫酸铵为某一浓度，用梯度浓度的 聚乙二椁与其形成一系列双水相体系，萃取分 离蛋白质，分别测量上、下相蛋白质的含量， 确定PEG的最佳浓度。 （2）选取（1）中的最佳PEG浓度，在此浓度 下与梯度浓度的硫酸铵形成双水相体系，进行 蛋白质的萃取分离，测定上、下相中蛋白质的 含量，确定出最佳的硫酸铵浓度。
双水相体系的双结线模型

双水相萃取法

双水相萃取法
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响，利用相平衡 热力学理论可推导下述分配系数表达式：
lnm=-Mλ/RT
m-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数; R-气体常数，J/(mo1．K)；T-绝对温度， K。
因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之 间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ>0，不 同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同 一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是 因为式中的λ随双水相系统而异。
图a和b分别为PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图 a
系线 两相区 双节线 双节线
b
两相区 系线
均相区
均相区
均相区
临界点
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而 体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
上下相组成分别为T和B,
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长， 两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的 分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。

在生物分子回收和纯化以后，怎样从含有目标产物残余物的 水溶液中回收聚合物或盐就成为一个重要的问题。例如从 1000kg面包酵母中萃取反丁烯二酸酶需要用680kgPEG-1550和 533kgK3PO4，若不回收利用，化学品的消耗会使生产成本大幅 度上升。如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在 错流过程操作方法下，用超滤或渗析膜过滤回收。如果蛋白 质积聚在聚乙二酵中，可以通过加入盐来精制，加入的盐导 致蛋白质在盐相中重新分配。PEG的分离同样可以用膜分离来 实现，即用选择性孔径大小的半透膜来截留蛋白质，同时排 除PEG进行回收。 另一种力法是通过盐析或使用水-可混溶性 的溶剂来沉淀蛋白质，但是固体(产物)的去除被存在的PEG阻 碍。也可使用离子交换和吸附，它们是通过蛋白质与基质的 选择性相互作用进行的。然而，当黏性聚合物溶液通过柱被 处理的时候，会出现高的压力降。在上述的三种方法中，膜 分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物的最佳 方法。

双水相萃取专业知识

双水相萃取专业知识

两相物性旳差别，使双水相萃取具有本身旳特征。
特征：
操作条件温和 表面张力大大低于有机溶剂相与水相间旳表面张力； 两相分散旳耗能低，分散程度高，传质面积大，传质速率快； 在温和旳萃取条件下，到达较高旳萃取效率。
安全性能高 药物生产，双水相萃取质量和安全性好； 高聚物一般为不易挥发物质，操作环境对人体无害。
这种易于放大旳优点对于新药研制 中生产工艺旳开发极为有利
双水相萃取技术旳进展
用变性淀粉PPT替代昂贵旳Dextran。PPT-PEG体系 已被用于从发酵液中分离过氧化氢、β-半乳糖甘 酶等。PPT-PEG体系比PEG-盐体系稳定，和PEGDextran体系相图非常相同，并具有下列优点：
伴随生物技术旳发展,必将增进双水 相萃取体系旳完善,从而更显示出双水 相体系萃取分离技术在生物物质分离 中旳独特优点.
在双水相系统中旳被分离物传质速度快，因而到达 分配旳时间短，但因两相密度相差小，分配困难， 是其主要矛盾。
利用离心沉淀可加紧相分离速度
体系旳选择和优化
1）、体系选择旳原则： 根据目旳pro和共存杂质旳HFS\M\pI\Z等旳差别, 综合利用静电、 疏水和添加合适种类和浓度旳盐，可选择性萃取目旳产物。
双水相旳类型： 离子型高聚物－非离子型高聚物 PEG－DEXTRAN 高聚物－相对低分子量化合物 PEG－硫酸铵
当两种高聚物水溶液混合物混合后旳总构成点 落在两相区（如：点M）可形成互不相溶旳两 相T和B。两相旳构成和密度均不同。一般，T 相为上层，高聚物PEG含量较高；B相为下层， 高聚物KPI含量较高。
双水萃相取旳理论基础
表面电荷
当盐旳正、负离子对上下相有不同旳亲和力，即 正负离子旳分配系数不同步，就会产生电位。

双水相萃取

双水相萃取

（2）双水相体系形成的原因：
聚合物的不相溶性（空间位阻）

聚合物的不相溶性：各个聚合物分子，都倾向于在其
周围有形状、大小和极性相同的分子，同时，由于不同
类型分子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相互吸引 力，因此聚合物发生分离，形成两个不同的相。

对于某些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混时，只要
浓度达到一定范围时，体系形成双水相的机理尚不清楚。

这种影响与蛋白质相对分子质量也存在关系，相对分子质量越
大，影响也随之增大。
（2）高聚物的浓度：

成相物质的总浓度越高，蛋白质越容易分配于其中的某一相；
而对于细胞等颗粒来说，在临界点附近细胞大多分配于其中的
某一相。
（3）盐的种类和浓度：

盐的种类和浓度对分配系数的影响，主要反映在相间电位和
蛋白质的疏水性差异上，这是由于当双水相系统中存在这些
加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 PEG；B)将 PEG
相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 PEG，再洗出蛋 白质。 无机盐的循环：将含无机盐相冷却，结晶，然后用离 心机分离收集。除此之外还可用电渗析法、膜分离法回
收盐类或除去 PEG相的盐。
（3）双水相萃取在药物分离中的应用
①细胞匀浆液中 蛋白质的纯化
液膜萃取
反胶团萃取
内容提纲：
1.双水相体系 2.双水相萃取的基本原理 3.影响双水相分配的主要因素
4.双水相萃取技术的发展
5.双水相萃取操作及应用
1.双水相体系
（1）双水相系统：一定浓度的两种水溶性高聚物或一
种高聚物与盐类在水中能形成两层互不相溶的匀相水溶液， 这样的水相系统称为双水相系统。
5%PEG6000 上层组成：2%Dextran500 93%水 3%PEG6000 下层组成：7%Dextran500 90%水

双水相萃取

双水相萃取
16
双水相系统的分类
按照物质在双水相系统的分配作用类型，可分为空 间排阻分配、电化学分配、构型相关性分配、亲和分配、 疏水分配和手性分配等类型。
分配类型 空间排阻分配 电化学分配 构型相关性 分配 亲和分配 典型相系统 PEG/EDX PEG/盐 影响因素 相系统因素 聚合物分子大小 相界面静电位 聚合物分子空间 构型 配基亲和性能 主要可调因素 溶质性质 表面积 表面电荷 空间构型 特异的亲和位 点 表面疏水性 聚合物分子量、浓度 pH、盐种类、聚合物 电荷性质 聚合物分子量、浓度、 pH、温度 配基种类、浓度、pH
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选择双水相的原则
• 能够获得高的产物回收和生物活性回收， 高的分离纯化倍数； • 系统的物理化学性质有利于大规模的应 用，有良好的工艺性能，系统黏度低， 相分离快，达到相平衡时间短，工艺参 数容易控制，工艺条件可调性范围大； • 系统经济，成本低，无毒，适合大规模 应用。
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双水相系统相图
PEG (%)
离子分配萃取
利用共价键将离子交换基团如 -NH2，-COOH， -PO43-， -SO42-结合在成相水溶性聚合物上，构成双 水相系统，与酶蛋白分子的相互作用进行分配的双 水相萃取，其分配行为在很大程度上与蛋白质的表 面电荷性质有关，也受到系统的各种因素，如pH、 盐浓度和种类、温度等条件的影响。由于这一类功 能团配基与酶的相互作用的选择性并不很高，萃取 效率和纯化倍数虽然比一般双水相萃取系统高，但 低于其他亲和萃取系统。 例如利用PEG-磷酸酯/磷酸盐系统进行β-干扰素 的提取，分配系数可达到630，杂蛋白几乎完全分配 在下相。 20
相图的双节点线的位置和形状与相系统组成及相系统组分的物理化 学性质有关，如聚合物的分子量和分子形状。在PEG/葡聚糖系统，如 果PEG分子量不变，增加葡聚糖的分子量，相分离所需的葡聚糖浓度 越低；两种聚合物分子量相差越大，双节点线的形状越不对称。 15 在PEG/盐系统中，PEG分子量越大，双节点线也越陡立。
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变性淀粉PPT代替昂贵得葡聚糖。 2. 双水相萃取技术同其他分离的结合，提高分离效率 与亲和层析相结合——亲和双水相
同生物转化相结合
习 题
凝聚： 絮凝： 分配系数（液液萃取）： 分离因数： 说明超临界流体萃取的优势有哪些？ 说明双水相萃取的优势有哪些？
H2O加量 次数 （g）
(NH4)2SO4溶液 加量 ml g
纯 溶液累计 PEG 400 (NH4)2SO4 总量（g） （%） 累计量
(NH4)2SO 4（%）
1 2
0.5 0.5
3
4 5 6 7 8
0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
根据聚合物的质量平衡 ： mO mB mT 式中mO , mT 和mB分别为聚合物的总质量 和在上相和下相中的质 量，它们分别为： mO （VB B VT T） cO mB VB B cB mT VT T cT 式中V , 和c分别为相体积、密度和 聚合物的浓度； 下标O、T则分别代表在有机混合 物（O）、下相（B）和上相（T）中。 V c c 可以得到：T T B O VB B cO cT cB cO MB 从相图可知： cO cT MT 综合方程式，得 VT MB B VB MT T
不相溶性是一普遍现象，其溶剂也不一定是水，也可 能是有机溶剂。 如果多种不相溶的聚合物混在一起，就可得到多相体 系，如硫酸葡聚糖、葡聚糖、羟丙基葡聚糖和聚乙二 醇相混时，可形成四相体系。
与溶剂萃取比较，双水相的两相性质差别小（密度和 折射率），有时难以看到界面。
生化工程中广泛应用的双 水相体系：聚乙二醇 (PEG)/葡聚糖(Dex)体系， PEG/盐等体系。 分离某一生物大分子，两 相系统的选择必须有利于 目的物的萃取和分离，同 时又要兼顾到聚合物的物 理性质。如甲基纤维素和 聚乙烯醇，因其粘度太高 而限制了它们的应用。
双水相萃取技术
萃取是最常用的一种液液分离方法，在制药和化 工行业应用极为普遍。但是普通的有机溶剂萃取法由 于以下原因难于应用于蛋白质分离： (1)许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶 剂；
(2)蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和可 溶 性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶 液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含有 大部分琼脂(或可溶性淀粉)。 60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A等人首先将双 水相系统应用于萃取技术。 70年代，德国将此技术应用于从细胞液中提取酶和蛋 白质，大大改善了酶的提取效果。 目前，仍然停留于实验室阶段，没有一套完善的理论 来解释生物大分子在体系中分配机理。工业化的例子 不多，原因在于成本过高，使技术上的优势被削弱。
pH微小的变化有时会使蛋白质的分 配系数改变2-3个数量级。
(4)体系温度的影响
温度影响相图，同时影响分配系数和蛋白质的生物活 性，它主要是影响相的高聚物组成。临界点附近，温度对 分配率的影响较大。远离临界点时，影响较小。 一般地，双水相萃取主要在室温附近操作。
(5)体系中微生物的影响
对于双水相体系，微生物 也会影响体系上下相的比例以 及胞内蛋白质在体系的分配系 数。 这种分配的差异主要是由 细胞破碎程度引起的，细胞壁 和细胞膜不同的化学结构也会 导致体系上下比例的改变。
PEG和Dex团其无毒性和 良好的可调性广泛应用。
二、相平衡和混溶性
T′
相 图
M′
A
B
B′
相图的制作
精确配制 43.00% （ g/ml ）左右的 (NH4)2SO4 溶液，并测其 密度。
精确称取PEG 400溶液0.700g 于试管中，按表格中所列第 一号数据，用吸管加入 0.5 mlH2O（ H2O的密度以1g/ml计） 缓慢滴入已配制好的 (NH4)2SO4 溶液，并不断在混合器上 混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现混 浊为止。记录 (NH4)2SO4 的加量（ ml ），根据密度值求出 重量（g），然后，按下表所列的第2号数据加入H2O，使 其澄清（加H2O量根据数据点的密集程度控制），继续向 试管中滴加 (NH4)2SO4 溶液，使其再次达到混浊，如此反 复操作，计算每次达到混浊时， PEG 和 (NH4)2SO4 在系统 总量中的重量百分比（%），将PEG的百分浓度为纵坐标， (NH4)2SO4 的百分浓度为横坐标作图，即得到一条双节线 的相图。
M′ T′
A
B B′
VT MB VB MT
CT
Co

物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分 配系数K 表示。
K ct cb
ct , cb分别为上相和下相中溶 质（分子或粒子）的浓 度。 当相系统固定时，分配 系数为常数。
K——与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关， 与溶质的浓度无关
匀浆液
PEG-Dextran系统 分离
下相（细胞粒子、杂蛋白、 核酸、多糖）
上相（产物） +盐
PEG-盐系统
分离
下相（产物）
上相（PEG、杂蛋白）
双水相萃取技术的发展
1. 廉价双水相体系的开发
两种双水相体系的比较
体系
PEG/DEX PEG/盐
优点
盐浓度低，活性损失小 成本低，粘度小
缺点
价格贵，粘度大，分相困难 盐浓度高，活性损失大
随着细胞浓度的增 加，细胞 破碎后释放的内含物的分配 系数迅速下降。
同时，PEG是一种常见的絮凝剂和沉淀剂，在该体系中， 细胞物质的絮凝和在不同相中的分配同时发生。所以PEG 的存在改变了物质的溶解曲线。
双 水 相 萃 取 技 术 的 应 用
要成功地运用双水相萃取方法，应满足下列条件：
(1)欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中； (2)酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时 一次萃取，就能得到较高的收率； (3)两相用离心机很容易分离。
一、双水相的形成
高聚物水溶液的混合
互不溶性，形成两个水 相，两种聚合物分别富 集于上下两相； 复合凝聚，也形成两个 水相，但两种高聚物主 要集中于一相。另一项 几乎为水； 完全互溶形成均相的高 聚物水溶液。
一、双水相的形成
双水相形成机理
双水相系统的形成在于聚合物的不相溶性产生的空间障碍 作用。 两个亲水成分的非互溶性，通常来源于各自分子结构上的 不同所产生的相互排斥作用。相反两种高聚物如果产生引 力则会形成互溶或者复合凝聚。 双水相系统也可由聚合物和无机盐之间。只要浓度达到一 定值，也 会形成两相，即聚合物-盐双水相体系，成相机理 尚不清楚，一 种解释为“盐析”作用。
双水相萃取法是利用物质 在互不相溶的两水相间分配系 数的差异来进行萃取的方法。 双水相系统可将水溶性的酶、 蛋白质等生物活性物质从一个 水相转移到另一水相中。
2.2％的葡聚糖水溶 液与等体积的0.72％ 甲基纤维素钠的水溶 液相混合并静置后， 可得到两个粘稠的液 层，下层含有大部分 葡聚糖．上层含有大 部分甲基纤维素纳， 两相中 98％以上的 成分是水。
pH=6.9 溶菌酶带正电， 卵蛋白带负电。
KCl K Na
此性质常被用于提高 物质在双水相系统的 分配系数。
(3)体系pH的影响
pH会影响蛋白质中可离解基团的离 解度，因而改变蛋白质所带电荷和 分配系数；另外，pH还影响系统缓 冲物质磷酸盐的离解程度，影响相 间电位差，从而影响分配系数。
影响分配平衡的参数
影响分配平衡的主要参数有成相聚合物的分子量和浓度、体 系的pH、体系中盐的种类和浓度、体系中菌体或细胞的种类 和浓度、体系温度等等。选择合适的条件，可以达到较高的 分配系数，较好地分离目的物。
(1)聚合物的影响
(2)体系中无机盐离子的影响 在PEG/DEX体系中，无机盐离子在两相中也有不同 的分配，因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中 性，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产 生很大的影响。