用Image-Pro Plus分析免疫组化(IHC)染色强度的方法

使用imagepro-plus测量荧光强度如今，使用荧光染料进行免疫组化染色的实验非常普遍，荧光染料染色细胞的荧光强度也能反映细胞中相关蛋白的表达强度，自然而然的，大家会想到是否可以通过IPP分析细胞或组织切片的荧光照片来分析其荧光强度，并以此来表示相应蛋白的表达强度。

非常令人沮丧的是，这个想法是很难实现的。

这个网页详细说明了理由。

/answers/showquestion.asp?faq=36&fldAuto=325里面的结论是：You DON'T! Image Pro Plus can provide Intensity or Density measurements for any image. However, unless the image acquisitions system is properly calibrated, those numbers may not have any useful relationship with the real world.IPP的分析结果与实际情况是有很大误差的，这个误差不是IPP的错，而是在制作样品及拍摄照片的过程中引入的。

所以在介绍使用IPP分析荧光照片的方法之前，首先得说说如何拍摄荧光显微镜照片。

这可能比IPP 的操作还要重要。

荧光显微镜拍摄的样品，是使用荧光染料染色的，使用荧光显微镜时最重要的，是选择合适的激发光滤光片与荧光滤光片。

正确选用滤光片能得到足够强的荧光，但一般情况下，显微镜不可能配齐所有的滤光片，更何况现在的显微镜滤光片价格都很贵，只能求其次，使用波段相近的滤光片，荧光强度稍低一些。

粗略的选择是：红色荧光染料，使用红色截止滤光片与绿色激发滤光片。

绿色荧光染料，使用绿色截止滤光片与蓝色激发滤光片。

蓝色荧光染料，使用蓝色截止滤光片与紫激发滤光片。

更精细的滤光片选择，可以参照下表：/jcyxy/zxlab/document/FluoDATA.xls在拍摄荧光照片时，如果要分析荧光强度，与免疫组化照片一样，要确保每张照片的拍摄条件完全一致。

ImageJ实⽤技巧之免疫组化与特殊染⾊众所周知，对于科研狗来说，实验并不是拍出那么⼏张靓丽图⽚就能万事⼤吉，不拿出对应的统计图来说明问题，定会被⽼板骂的体⽆完肤。

今天为⼤家带来⼩弟平时分析数据⽤的最多最常⽤，堪称神器的软件ImageJ。

这是⼀张肝脏的天狼猩红染⾊图，其中红⾊代表的是I与III型胶原阳性染⾊，统计这张图中红⾊部分占整张图⽚的⾯积百分⽐。

1.在电脑上打开这个神器ImageJ，会出现如图显⽰的⼯具栏2. 将需要统计的图⽚在imageJ中打开3.在图3显⽰的⼯具栏中选择image按钮，然后选择Type，再选择RGBStack按钮。

4.此时再将图⽚下⽅的调节滑轮拉到中间或是最右边，以获得最佳的对⽐度。

5.再选择image按钮，然后点击Adjust，再Threshold按钮6.出现threshold窗⼝7.此时只需调节上下两个滑轮即可对图⽚阳性染⾊⾯积进⾏标记（⼀般免疫组化或特殊染⾊只需调节下⾯这个滑轮，免疫荧光则相反）8.此时的红⾊部分就是你的阳性染⾊部分，然后进⼊统计阶段，先点击Analyze按钮，然后Set Measurements按钮，出现弹窗后再点击Area fraction按钮（⼀般这⼀步第⼀次设置后，以后都不⽤设置了）9.计算出阳性染⾊⾯积的百分⽐，点击Analyze按钮，然后点measure按钮即可，图中6.164即为阳性染⾊⾯积百分⽐.....华丽丽的分隔线.....这是⼀张免疫荧光图，我需要统计其中红⾊部分的阳性染⾊⾯积说完了免疫组化与特殊染⾊的部分，其实免疫荧光的统计和上⾯⼀样，只是在threshold这⼀步有点差别1．1---6步骤都是⼀样，按照处理变成了下图2.按图下⽅的滑轮保持在左边不变，然后在threshold窗⼝将下⽅滑轮滑到最右边，上⽅滑轮左右调节3.计算出阳性染⾊⾯积的百分⽐，点击Analyze按钮，然后点measure按钮即可总结：今天主要是给⼤家演⽰了imageJ最常⽤的两个功能，不过这种统计也有局限性，如果碰见Ki67这种需要计算增殖细胞个数的免疫组化，则推荐⼤家⽤IPP进⾏统计。

Imagepro plus免疫组化图像处理及基本功能
免疫组化图片分析
免疫组化的基本原理：
区域越黑光密度越大，蛋白表达越强。

一般可以由灰度值转换为光密度值计算，用平均光密度值计算（一块区域的光密度总和/区域面积）。

操作步骤：
1、光密度校正
将灰度值转为光密度
2、设置测量参数
参数包括面积、IOD等
设置标记的操作，填充，平滑，是否包括边缘的保存测量环境文件等
3、选择测量区域
图形选中测量区域
3、设置色彩选择
4、
选择区域的HIS设置，
保存选色文件
5、测量区域面积，在测量积分光密度
6、批量操作等
一组免疫组化图片包括几组样本，而每个样本需要测量多次去平均，因此需要保存操作标准，以进行批量操作。

备注：拍摄条件要一致，相同显微镜条件，同一放大倍数，手动相机
基本功能
校正显微镜图片背景不均匀
操作步骤：
获得空白的背景图片
打开样本图片
单击背景校正功能选项
分色选择工具
HIS和rgb调整图像颜色
调整图片亮度
包括调整亮度和对比度
调整图片伽马
滤镜Filter
对灰度和二值图像处理效果较好
图象增强，平滑，去噪，边缘处理，形态学处理等
数据收集
包括对目标的计数，目标参数例如面积，长宽等计算。

Image pro-Plus6.0 使用教程目录一、入门 (2)二、AOI技巧（1） (9)三、AOI技巧（2） (14)补充：不规则区域计数 (20)四、编制宏 (23)五、计数 (27)六、校正标尺 (33)七、几何测量 (41)八、图象分析策略 (43)九、其他有趣功能 (45)十、光密度 (51)十一、免疫组化光密度测量 (56)十二、macro (58)十三、荧光强度测量 (64)感谢丁香园战友:hbchendl 提供教程畅想先锋-整理2010.07.01一、入门既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛。

在你开始学习使用IPP 之前，我假定你是会初步使用office 及photoshop 等常用程序的。

如果一点电脑常识也没有，那还是先学点简单的程序再回来玩IPP。

因此我跳过了打开图片，copy 、paste、象素的概念之类最基础的知识与操作。

这些用不着我来讲。

这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。

处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的"量"。

对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。

所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，然后才是测量这些挑出来的区域的各种测量参数，如面积、平均半径、周长、光密度等等。

这部分需要挑出来进行测量的区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI(area of interest)。

AOI 是IPP 中最有用最重要的概念。

如何能够准确地选取AOI 就是使用IPP 的关键操作。

一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。

在其他的测量软件中，选择这种不规则的区域一般只能用手拖着鼠标来画，而在IPP 程序里，可以通过设置颜色范围让电脑来帮助你选择这些不规则区域，这样的选择就准确多了。

可以说，使用IPP 的要点就是灵活地使用各种AOI 工具准确地把那些需要测量的区域给挑选出来。

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