【CN109929780A】一种猪源化脓隐秘杆菌及其应用【专利】

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化脓隐秘杆菌毒力因子的研究进展

化脓隐秘杆菌毒力因子的研究进展郭文洁,赵敬翠,刘耀川,朱竟赫,刘明春(沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳110161)中图分类号:S852.61 文献标识码:A 文章编号:052926005(2010)0120052202 化脓隐秘杆菌(A rcanobacterium pyogenes)又名化脓放线菌或化脓棒状杆菌,为革兰染色阳性的短棒状杆菌,普遍存在于牛、羊、猪和其他重要经济动物的黏膜上[1],是一种条件性致病菌。

化脓隐秘杆菌可在家畜间广泛传播,导致广泛多样的皮肤、内脏器官和关节的非特异性化脓性感染,如急性化脓性乳房炎、慢性脓肿性乳房炎、关节炎、心内膜炎、肝脓肿、子宫炎以及流产和不孕等,给养殖业带来较大的经济损失。

目前已发现的化脓隐秘杆菌毒力因子有4类,分别为化脓隐秘杆菌溶血素(PLO)、胶原结合蛋白(CbpA)、神经氨酸酶(Nan)及菌毛合成蛋白(Fim)。

以下分别对各类毒力因子的研究现状做一综述,期望对化脓隐秘杆菌引起的感染性疾病的防治有所帮助。

1　化脓隐秘杆菌的毒力因子1.1　溶血素　化脓隐秘杆菌能产生一种溶血素(Pyol ysi n)即PLO,分子量为57.9kDa,由plo基因编码。

plo基因含1605个碱基。

若plo基因发生插入失活,将导致PLO的溶血活性丧失。

化脓隐秘杆菌溶血素是一种外毒素,能够溶解多种动物的红细胞、免疫细胞,并引起试验动物的皮肤坏死以及动物的死亡。

PLO还呈现出对牛多形核粒细胞和袋鼠肾细胞的细胞毒性效应。

PLO被认为具有氧化稳定性,并且具有胆固醇依赖性。

由于在自然感染和人工感染动物的血浆中都发现了抗溶血素抗体,说明它能够在活体内表达并具有免疫原性。

Billington S J等[2]于1997年研究发现,假设组织产生单独的溶血素,重组PLO的未纯化特异性抗体能完全中和化脓隐秘杆菌的溶血活性;此外,这些抗体还能够被动地保护小鼠防御化脓隐秘杆菌的致命性攻击。

Jo st B H等[3]于1999年应用经甲醛灭活的重组体PLO对小鼠进行预防接种,发现其可保护小鼠免受腹膜内化脓隐秘杆菌的攻击;并于2003年发现了3种类毒素即H IS2PLO.F(497)、收稿日期:2009201212基金项目:国家自然科学基金(30972214);辽宁省自然科学基金(20082126);辽宁省教育厅科学研究计划(2008641)作者简介:郭文洁(19832),女,硕士生,研究方向为兽医药理学与毒理学,E2mail:gwj0825@通讯作者:刘明春,E2mail:liumingchun@ HIS2PLO.Delta P(499)和HIS2PLO.A(522),均可用于小鼠的被动免疫,且这3种物质不具有溶血活性,因此无需灭活,进而实现了对化脓隐秘杆菌病的免疫预防[4]。

猪化脓隐秘杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立

猪化脓隐秘杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立田佳琪;姚亚辉;赵化丹;李敏;朱茗莉;马红霞;高云航【摘要】为建立检测化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)血清抗体的间接ELISA方法,本研究以超声破碎处理T.pyo-genes分离株TP-2849(NZ_CP029004)的全菌蛋白作为包被抗原,经反应条件优化建立了T.pyogenes抗体间接ELISA检测方法.该方法与7种常见病原阳性血清均无交叉反应,特异性较强;敏感性试验显示阳性血清的检测下限为1:128,敏感性较高;组内、组间变异系数均小于9.5％,重复性较好.对吉林省某养殖场100份猪血清检测结果显示,该方法与PCR检测方法总符合率为94％.本研究建立的间接ELISA方法为T.pyogenes抗体检测提供了一种新手段.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2019(041)004【总页数】4页(P376-379)【关键词】化脓隐秘杆菌;间接ELISA;抗体检测【作者】田佳琪;姚亚辉;赵化丹;李敏;朱茗莉;马红霞;高云航【作者单位】吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;辽源市东丰县东丰广播电视台,吉林辽源136300;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118【正文语种】中文【中图分类】S852.4化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)属隐秘杆菌属，作为一种条件致病菌可以在猪、鹿、羊、牛等多种哺乳动物中广泛传播，造成重大损失。

现今，对T.pyogenes 的临床检测手段仅为PCR 检测。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是临床检测抗体的可靠手段，其主要原理是将抗原包被液结合固相载体表面，利用抗原与抗体之间的特异性结合对免疫反应定性和定量检测[1]。

生猪脓包化脓隐秘杆菌的分离鉴定与防控分析

题。
福百而
口
ＨｕｎａｎＡｎｉｍａｌｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｏ．２，２０１５．（ＴｏｔｌａＮｏ．１８６）
皮肤软组织化脓性感染是由于细菌侵入皮肤而发生的炎症反应，局部可出现红、肿、热、痛和功能障碍，严重时细菌及毒素进入血液循环可引起毒
※通讯作者：李润成。
血症或败血症，伤口感染是细菌在体内大量繁殖的结果，脓是机体组织炎症过程中形成的浓稠或稀薄的渗出物，其中包含变性、坏死的白细胞、细菌、坏
的排污。几年的生产对周边环境产生了一定的污
２．１排放污水时，先将最后一级沉淀池的净水排出
染，下游居民对此反应日趋强烈。为此猪场下决心进行改造，在２０１３年项目实施并完工。如今生物降解池下方出口的４０亩鱼池能正常生产，没有任何死鱼现象发生，还能生产商品鱼近１万千克。１改造程序１．１雨污分离加干法清粪。本场将原老猪舍雨水屋檐接长，另开雨水沟。场内雨水全部贯通排出场外，洗栏污水单独排进地下化粪池。栏内严禁水冲栏，先行人工拣拾干粪。１．２栏舍地下建８００ｍｚ的化粪池，将全场污水集中于此，本场化粪池２个月排放一次，秋冬季一个季度排放一次。１．３沉淀池加生物降解池，本场在下游租有２０多亩荒地，将其改造成四个沉淀池，也就是４级沉淀降解池。沉淀池除利用自然氧化降解外，还在水面放养水生植物水葫芦进行生物降解。１．４配套４０亩水面养鱼，本场沉淀降解池最后的一级排出口下游是鱼池，经降解后的净水排人鱼池进行养鱼。１．５配套建设了２０ｍ。的地下化尸井；４０ｍ。的集粪池，并加盖防雨棚；在沉淀池周边建了８００ｍ长的撇水沟。

猪肺源致病性大肠杆菌和化脓隐秘杆菌混合感染病原的分离鉴定及主

猪肺源致病性大肠杆菌和化脓隐秘杆菌混合感染病原的分离鉴定及主要毒力因子的检测作者：蔡瑶周雪珂江朝源曾喻兵徐志文朱玲来源：《江苏农业学报》2020年第01期关键词：猪;肠外致病性大肠杆菌;化脓隐秘杆菌;分离鉴定;混合感染;毒力基因中图分类号：S852.61+2文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）01-0254-03Key words：pig;extraintestinal pathogenic Escherichia coli;Trueperella pyogenes;isolation and identification;mixed infection;virulence gene大肠杆菌是一种重要人畜共患病病原体，可感染人和多种动物，根据其对宿主寄生部位不同，划分为肠内致病性大肠杆菌和肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）[1]。

近几年来，国内外众多学者陆续报道了关于ExPEC的感染案例，指出其可特异性定殖于宿主肠道外，使感染宿主发生不同程度的脑膜炎、败血症、泌尿道及呼吸道感染[2]。

目前在ExPEC中发现了多种毒力因子，包括与其致病性相关的毒力岛（PAI）、黏附素、侵袭素、毒素、表面抗原、铁摄取系统和分泌系统等[3]。

化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes，原名Arcanobacterium pyogenes）又名化脓放线菌或化脓棒状杆菌，为隐秘杆菌属（Trueperella）细菌。

可以感染牛、羊、猪、林麝等重要经济动物，也可以感染人，是一种机会致病菌[4]。

化脓隐秘杆菌可在家畜间广泛传播，常引起感染动物化脓性肺炎及乳房炎、心内膜炎、关节炎、多发性淋巴结炎，甚至会造成宿主流产和不孕等，最严重时可引发脓毒败血症导致家畜死亡[5]。

目前已发现的化脓隐秘杆菌毒力因子有 4 类，分别为化脓隐秘杆菌溶血素（PLO）、胶原结合蛋白质（CbpA）、神经氨酸酶（Nan）及菌毛合成蛋白质（Fim）[6]。

浅谈化脓隐秘杆菌的研究进展

3诊断技术
目前，对于化脓隐秘杆菌的诊断方法为微生物学诊断法和分子生物学诊断法,而对于血清学诊断的方法还没有有展。传统的微生物学诊断方法是通过细菌分离培养后再进行革兰氏染色镜检观察细菌形态,通过其生理生化特性鉴定,这样比较耗时耗力。分子生物学方法比较简单、省时，可以通过扩增16S rRNA、测序鉴定。Hasan等[13]、刘明春等[14]用PLO作为靶基因进行特异性扩增鉴定该菌，也得到很好的效果-
5结语
化脓隐秘杆菌是危害养殖业的重要病原之一, 其危害之大，不容忽视。虽然化脓隐秘杆菌的一些毒性决定因素已被很好地认识,但对感染的传播知之甚少。因此,了解这种细菌的致病性机制及其传播途径对制定有效的预防策略至关重要。目前, DNA疫苗具有易于制造、稳定和潜在的安全性等优点,其DNA疫苗将会是研究的重点-
1危害和流行状况
化脓隐秘杆菌在1893年从牛脓汁中分离到，现欧洲、日本、巴西、美国、中国等地均有报道，该菌已呈全球分布。化脓隐秘杆菌可感染家畜和野生动物，其流行状况因宿主种类和地理环境而有所差异。在特定的情况下,化脓隐秘杆菌可引起动物皮肤、关节和内脏器官的化脓性感染，常表现为子宫内膜炎、关节炎、乳房炎、肾脓肿等疾病，尤其对奶牛和肉牛产业造成严重的经济损失。据报道,27% -69%的牛子宫炎与化脓隐秘杆菌有关，且40% 左右的牛发生肾脓肿也与该菌有关［1］。该菌引起的奶牛乳房炎，造成英国近10万美元的年度净亏损。赵敬翠等［3］报道该菌可与坏死梭形杆菌交叉感染引起严重的肝脓肿，致使动物体重下降。此外，化脓隐秘杆菌还可以引起公猪睾丸炎、仔猪关节炎、母猪子宫内膜炎、羊肺炎等。由此可见，动物感染化脓隐秘杆菌后,给养殖业带来经济损失是非
广畜牧兽医医
2021 年 Vol.37(4)

猪源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及病理组织学观察

猪源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及病理组织学观察董文龙;王家祯;朱世馨;贾小营;孙健;马红霞;高云航【摘要】从吉林省某猪场1例病死猪肺脏内分离到1株革兰氏阳性杆菌,该菌接种于TSA(含5％胎牛血清)平板,培养18 h长出肉眼可见的菌落,而在巧克力平板上生长缓慢.对该菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增并进行序列测定,测序结果经Nast分析与化脓隐秘杆菌的核苷酸序列同源性为99％,经过进一步糖、醇发酵试验及触酶试验等一系列生化试验,结果与测序结果相符,将其命名为AP4.该菌对供试小鼠具有致病性.药敏试验结果显示,该菌对氯霉素、氟苯尼考、阿米卡星及庆大霉素敏感,对红霉素、阿奇霉素、环丙沙星、强力霉素、阿莫西林及磺胺间甲氧嘧啶耐药.【期刊名称】《上海交通大学学报（农业科学版）》【年(卷),期】2016(034)003【总页数】6页(P22-27)【关键词】化脓隐秘杆菌;分离鉴定;耐药性;病理组织学【作者】董文龙;王家祯;朱世馨;贾小营;孙健;马红霞;高云航【作者单位】吉林农业大学动物科学技术学院,长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,长春130118;吉林省畜牧兽医科学研究院,长春130062;吉林农业大学动物科学技术学院,长春130118;吉林农业大学动物科学技术学院,长春130118【正文语种】中文【中图分类】S858.286.614化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)属于隐秘杆菌属,原称化脓棒状杆菌(Corynebacterium pyogenes)、化脓放线菌(Actinomyces pyogenes),1997年定名为化脓隐秘杆菌[1]。

该菌为条件致病菌,常引起猪、牛、羊的非特异性化脓性感染,主要表现为心内膜炎、关节炎、肺炎、子宫炎、急性化脓性乳房炎、肝脓肿等[2]。

一株猪源化脓隐秘杆菌的分离与鉴定

２１０１第５期
养猪ＳＮＲＤＴＯＮＷＩＥＰＯＵＣＩ
一
株猪源化脓隐秘杆菌的分离与鉴定
陈蕾朱玲徐，，凯刘孟良，，代洪波
６１０）４００
文章编号：０２１５（０ｏ一１０１０ — ９７２１）５Ｏ１２１１－
１病原菌的分离与纯化．２
将无菌采集的病死猪肺脏划线接种ＴＡ平板，Ｓ３７℃需氧培养４８ｈ后挑取单菌落进行纯化培养，直
收稿日期：０１０ — ８２１－８２
作者简介：陈
蕾（９９）女，１８一，四川邛崃人，在读硕士研究生，研
１材料和方法１试验材料．１１．病料来源四川内江某猪场暴发一种以病死．１１
到菌落形态稳定一致，保存菌种。 ‘
１３染色镜检．
பைடு நூலகம்
挑取单菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌的形态特征。
１分离茵１ＳｒＮ的ＰＲ测序鉴定．４６ＤＡＣ
（．Ｉ１四川农业大学动物医学院，四川雅安
中图分类号：８８２２６＋￥５．８．１４
６５１；．２０４２四川省内江市畜牧食品局，四川内江
文献标志码：Ａ
摘要：四川内江某猪场发生疾病，病猪的肝、出现化脓性结节，出血性肿大，肺脾无菌采集病猪的病变组织进行细菌分离，到１革兰氏阳性菌，得株形态多样，呈球状、杆状或棒状，在或成丛排单列，该菌在ＴＡ平板上生长缓慢。经细菌分离培养、６ＮＳ１ＳｒＡ鉴定、Ｄ动物致病性试验等，结果显示该株分离菌为致病性化脓隐秘杆菌。药敏试验显示，该分离菌对头孢呋肟、氨苄西林、卡那霉素、四环素、氟苯尼考等药物有不同程度的敏感性，对于指导临床用药具有积极的意义。

【CN109957514A】一种粗壮脉纹孢菌的新用途【专利】

发明内容 [0005] 本发明的目的是为提高粗壮脉纹孢菌在发酵食品和农副产品的综合开发的利用价值，提供了一种粗壮脉纹孢菌的新用途。 [0006] 为了实现上述目的，本发明的技术方案为： [0007] 粗壮脉纹孢菌的保藏号为CGMCC3088，用于产蛋白水解酶。 [0008] 本发明还提供了一种利用粗壮脉纹孢菌固态发酵豆渣产蛋白水解酶的方法，步骤如下： [0009] (1)将粗壮脉纹孢菌(CGMCC3088)菌株接种至活化培养基中培养活化；再将菌株接入马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基中培养，使菌株全部孢子化； [0010] (2)向PDA斜面培养基中加入吐温-80、无菌水，涡旋至菌液均匀，过滤，再加一定量灭菌水使孢子浓度为1～2×106个/mL，使固态发酵过程中菌体繁殖力和次级代谢产物的产量达到最大，制得孢子悬液。 [0011] (3)在豆渣中加入灭菌水，搅拌均匀，121℃灭菌20min，接种孢子悬液，用低浓度的盐酸和氢氧化钠调节豆渣初始pH至5 .0，置于发酵罐中30℃培养72h，10000rpm离心5min即
纹孢菌的新用途，用于产蛋白水解酶。还涉及利用粗壮脉纹孢菌发酵豆渣产蛋白水解酶的方法，其主要包括下列步骤为：( 1 )粗壮脉纹孢菌菌株的活化、孢子化；( 2 )加入吐温-80、无菌水制备孢子悬液；( 3 )固态发酵豆渣获得含蛋白水解酶的粗酶液。本发明涉及的粗壮脉纹孢菌是从我国传统发酵食品中提取并纯化得到的，安全无毒。因此，依据本发明获得的蛋白水解酶在食品和农产品加工中具有明显的优势。
代理人胡群
(51)Int .Cl . C12N 1/14(2006 .01) C12N 9/50(2006 .01) C12R 1/645(2006 .01)
(10)申请公布号 CN 109957514 A (43)申请公布日 2019.07.02

【CN109971667A】一株猪源植物乳杆菌及应用【专利】

( 57 )摘要本申请公开了一株猪源植物乳杆菌及应用，
该菌株命名为：植物乳杆菌R-21( Lactobacillus plantarum R-21 )；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2018009，保藏日期为 2018年1 月8日。本发明还公开了一种该菌株在制备饲料或者青贮饲料中的应用。本发明分离的植物乳杆菌生长迅速，产酸能力强，其发酵液对曲霉菌及常见肠道致病菌有明显的抑制效果，可用于饲料添加或制备发酵饲料。
(72)发明人夏品华曹海鹏严定波
(74)专利代理机构北京国昊天诚知识产权代理有限公司 11315
代理人吴家伟
(51)Int .Cl . C12N 1/20(2006 .01) A23K 10/12(2016 .01) C12R 1/25(2006 .01)
( 54 )发明名称一株猪源植物乳杆菌及应用
2
CN 109971667 A
说明书
1/7 页
一株猪源植物乳杆菌及应用
技术领域 [0001] 本申请属于微生物技术领域，具体地说，涉及一株猪源植物乳杆菌及应用。
背景技术 [0002] 随着养殖业的快速发展，对饲料的需求量越来越大，饲料的质量与成本决定养殖利润，更是困扰养殖业发展的关键因素之一。饲料在加工及贮存期间，因操作条件及环境等因素的影响，易污染大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及黄曲霉等杂菌，造成饲料品质下降，严重时会导致动物感染、腹泻、中毒，甚至死亡等。在动物饲粮中加入适量抗生素或非生物源的化学防腐剂可以延长饲料的保质期，降低疾病的发生，提高产量。但随着时间的推移，因抗生素滥用导致的细菌耐药性现象越来越严重，化学防腐剂的安全问题层出不穷，严重危害动物及人类健康。因此，寻求新的、安全的饲料添加及饲料生产方法势在必行。 [0003] 目前，研究比较多的绿色安全饲料添加剂主要是益生菌及其所产益生物质。其中，关注较多的是乳酸菌及其所产细菌素等活性肽物质。乳酸菌作为益生菌本身具有整合肠道菌群，抑制病原菌在肠道内定植、繁殖等功能，作为微生态制剂可用于预防、治疗细菌性感染，维护肠道健康。而在新型绿色饲料添加中真正起防腐功能的是益生菌所产生的有机酸、细菌素等活性物质。常用的细菌素等活性肽物质一般只对革兰氏阳性菌有抑制效果，对大肠杆菌和沙门氏菌等常见肠道致病菌及产生曲霉毒素的黄曲霉等作用较小，在生产中还不能完全取代抗生素和化学防腐剂等的作用。因此，在生产中仍需寻求安全、具有广谱抑菌功能、抑菌效果好的乳酸菌或生产成本低的抑菌活性物质。 [0004] 在饲料加工方面，以粉碎的青绿作物秸秆为原料，利用乳酸菌厌氧发酵技术制备的青贮饲料，具有酸香多汁、适口性强、营养丰富、利于贮存等优点，是反刍动物的优良低廉饲料来源。大力发展青贮饲料，有利于降低饲养成本，解决农业生产中面临的秸秆资源难以充分利用、污染环境等问题。 [0005] 传统的青贮饲料是在厌氧条件下的自然发酵而成，一般存在以下问题：乳酸菌生长缓慢，发酵周期延长；不能在短时间内形成优势菌群，发酵升酸慢，厌氧杂菌大量繁殖，造成营养流失；产生有害气体或物质，适口性差；腐败菌或霉菌大量生长，造成原料腐败或霉变，降低饲料品质。因此，在青贮期间人为加入适量的乳酸菌，迅速降低发酵原料的酸度，减少杂菌的生长，是提高青贮饲料品质的有效手段。目前，用于青贮饲料发酵的乳酸菌种类繁多，大多具有生长快、产酸多而迅速、发酵周期短等优点。但是这类乳酸菌大多来源植物表面，抑菌活性、肠道适应性及安全性不明确，一般对耐酸性杂菌和霉菌的抑制作用较小。

一种蛋白在制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用[发明专利]

专利名称：一种蛋白在制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用
专利类型：发明专利
发明人：沈克飞,张素辉,闫志强,徐登峰,许国洋,付利芝
申请号：CN201910980728.8
申请日：20191016
公开号：CN110642927A
公开日：
20200103
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于兽用生物制品领域，公布了化脓隐秘杆菌的一种抗原蛋白及其制备、疫苗应用、抗体检测方法。

本发明将高度保守的化脓隐秘杆菌铁ABC转运体底物结合蛋白SBP的基因，克隆至pGEX‑4T‑1质粒，构建BL21（DE3）重组菌株，使用IPTG诱导表达重组蛋白SBP(GST‑SBP)，实现了目的蛋白的可溶性表达，采用Gluthathione‑Sepharose 4B层析法亲和纯化重组蛋白。

本发明提供的重组SBP(GST‑SBP)蛋白具有良好的反应原性和免疫原性，能够与化脓隐秘杆菌免疫或感染的动物（小鼠、山羊）的血清反应，能够刺激动物（小鼠、羊）产生高水平特异抗体，小鼠免疫保护率为90%。

本发明为制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物提供了新的抗原蛋白。

申请人：重庆市畜牧科学院
地址：402460 重庆市荣昌区昌州街道昌龙大道51号
国籍：CN
代理机构：重庆弘旭专利代理有限责任公司
代理人：文巍
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910227965.7
(22)申请日 2019.03.25
(83)生物保藏信息
CCTCC NO:M2019042 2019.01.14
(71)申请人江西省农业科学院畜牧兽医研究所
地址 330200 江西省南昌市南昌县莲塘横
岗
(72)发明人谭美芳　李海琴　曾艳兵　方绍培　
魏岳　
(74)专利代理机构北京金智普华知识产权代理
有限公司 11401
代理人杨采良
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C12N 1/02(2006.01)
C12Q 1/686(2018.01)C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/04(2006.01)A61K 35/74(2015.01)A61K 39/02(2006.01)A61P 31/04(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称
一种猪源化脓隐秘杆菌及其应用
(57)摘要
本发明属于微生物技术领域，
公开了一种猪源化脓隐秘杆菌及其应用，猪源化脓隐秘杆菌为
TPY JX18，保藏号为CCTCC NO：M2019042；猪源化
脓隐秘杆菌于2019年1月14日保藏于中国典型培
养物保藏中心；地址为湖北省武汉市洪山区八一
路武汉大学校内中国典型培养物保藏中心。

本发
明菌株TPY JX18含多重毒力因子，引起保育猪和
小鼠急性死亡，具有较强的致病力和免疫原性，
可用于研究毒力因子对宿主致病的分子机理，或
用于化脓隐秘杆菌亚单位疫苗的研制；本发明为
发现化脓隐秘杆菌新的致病性、致病机理和流行
病学提供研究材料。

权利要求书1页说明书7页附图3页CN 109929780 A 2019.06.25
C N 109929780
A
权　利　要　求　书1/1页CN 109929780 A
1.一种猪源化脓隐秘杆菌，其特征在于，所述猪源化脓隐秘杆菌为TPY JX18，保藏号为CCTCC NO：M2019042；猪源化脓隐秘杆菌于2019年1月14日保藏于中国典型培养物保藏中心；地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学校内中国典型培养物保藏中心。

2.如权利要求1所述的猪源化脓隐秘杆菌，其特征在于，所述猪源化脓隐秘杆菌细菌属于隐秘杆菌属，革兰氏阳性棒状短杆菌，不运动、不抗酸，无芽孢，好氧或兼性厌氧，生长温度为37℃。

3.一种如权利要求1所述猪源化脓隐秘杆菌的获取方法，其特征在于，所述猪源化脓隐秘杆菌的获取方法包括：
第一步，培养基的制备：
TSB液体培养基：将胰蛋白胨大豆肉汤(TSB，购自美国BD Difco公司))30g，溶于1000mL 超纯水中，121℃灭菌15min，加胎牛血清50mL，4℃保存备用；
TSA固体培养基：将胰蛋白胨大豆琼脂(TSA，购自BD Difco)40g，溶于1000mL超纯水中，121℃灭菌15min，加胎牛血清50mL，分装于无菌平皿中制成平板；
鲜血琼脂培养基：将胰蛋白胨大豆琼脂TSA 40g，溶于1000mL超纯水中，121℃灭菌15min，加无菌脱纤维绵羊血50mL，制成无菌平板；
第二步，菌株的分离培养：
无菌采集病猪肺脏组织，研磨后接种于TSA固体培养基上，37℃恒温培养24h，长出针尖状大小、透明、圆形、光滑和边缘整齐的单菌落；纯化接种后，进行革兰氏染色，该菌为革兰氏阳性短杆菌，单在或成丛；在添加5％鲜血的TSA培养基上培养48h，获得2-3倍菌落直径大小的β-溶血环。

4.如权利要求3所述猪源化脓隐秘杆菌的获取方法，其特征在于，猪源化脓隐秘杆菌的获取后，还需进行：
菌株的鉴定：
将传代培养的菌株提取基因组DNA，按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取；合成化脓隐杆菌检测通用引物，进行PCR反应后，进行鉴定。

5.如权利要求3所述猪源化脓隐秘杆菌的获取方法，其特征在于，猪源化脓隐秘杆菌的获取后，还需进行毒力因子的PCR鉴定。

利用合成化脓隐秘杆菌的毒力因子检测引物，检测化脓隐秘杆菌的毒力因子溶血素基因plo、胶原结合蛋白cbpA、神经氨酸酶基因nanP和nanH、菌毛基因fimA/fimC/fimE/fimG，进行PCR反应后，进行鉴定。

6.一种验证权利要求1所述猪源化脓隐秘杆菌毒力效果的动物模型构建方法，其特征在于，所述动物模型构建方法包括：
使用4～5周龄雌性昆明小鼠测定化脓隐秘杆菌TPY JX18的致病力，生理盐水作为阴性参照；接种剂量分别为8×108CFU/只、3×108CFU/只、1×108CFU/只、5×107CFU/只、3×107CFU/只，每个剂量组用8只小鼠腹腔接种，每只接种0.5mL菌悬液；7日后分析菌株对小鼠的致病性结果。

7.一种利用权利要求1所述猪源化脓隐秘杆菌制备的疫苗。

2。