有关物质测定HPLC方法的建立

HPLC-ELSD法测定新霉素的有关物质摘要】目的建立HPLC-ELSD法测定新霉素的有关物质的方法。

方法流动相：0.2mol?L-1三氟乙酸溶液-甲醇（98：2）；色谱柱：ODS－HYPERSIL（5μ）125mm×4.6mm，Kromasil-100-5C18：150mm×4.6mm；流速：0.4ml?min-1；雾化管温度：30 ℃；漂移管温度：70 ℃；压力：0.4MPa；进样量：20μL。

结论新霉胺在0.02～0.1mg?mL-1范围内线性良好，线性方程为：y= 1.513x+7.629，r=0.9996 (n = 6)。

HPLC-ELSD法法能够快速、准确测定新霉素的有关物质。

【关键词】新霉素 HPLC-ELSD 有关物质1 溶液的配制供试品溶液的制备精密称取硫酸新霉素样品50.17mg，加水溶解并稀释至50ml，作为供试品溶液。

对照溶液浓度的制备精密称取新霉胺对照品适量，加水溶解依次稀释至浓度为0.04 mg?mL-1，0.05 mg?mL-1，0.06 mg?mL-1，0.07 mg?mL-1，0.08 mg?mL-1的系列对照溶液。

系统适用性溶液的制备分别精密称取新霉胺、巴龙霉素、新霉素B和新霉素C对照品，加水制成约各含0.3mg?mL-1的溶液，摇匀，作为系统适用性试验用溶液。

2 系统适用性试验精密量取系统适用性溶液20μL，在上述色谱条件下分析，各杂质峰的分离度不小于1.5，理论塔板数均大于3000，对称因子均小于1.5。

见图1，2。

3 有关物质测定精密量取标准溶液与供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，按上述方法测定并绘制标准曲线，计算新霉胺的含量为0.1%。

见图3。

4 线性范围的考察精密称取新霉胺对照品适量，分别加水制成含新霉胺0.0201、0.0301、0.0401、0.0502、0.0702、0.1003 mg?mL-1的溶液，精密量取20 μL注入液相色谱仪，以上述测定方法绘制随行标准曲线，得线性方程为：y= 1.513x+7.629，r=0.9996 (n = 6) 。

㊃388 ㊃J o u r n a l o f H e n a n U n i v e r s i t y(M e d i c a l S c i e n c e )2020,39(6)文章编号:1672-7606(2020)06-0388-03H P L C 法测定琥珀酸美托洛尔的有关物质许笑笑1,孙 琳21.邓州市中心医院药械科,河南邓州474150;2.郑州大学第三附属医院,郑州450000摘 要: 目的 建立琥珀酸美托洛尔有关物质的H P L C 测定方法㊂ 方法 色谱柱为C 18(150mmˑ4.6mm ,5μm );流动相:醋酸铵3.9g ,用810m L 水溶解,加三乙胺2m L ㊁冰醋酸10m L ㊁磷酸3m L 和乙腈146m L ,混合均匀;流速:1.0m L ㊃m i n -1;柱温:25ħ;检测波长:280n m ;进样量:20μL ㊂结果 琥珀酸美托洛尔主峰与杂质A 分离度大于8,与其他杂质分离度符合规定;精密度试验结果R S D 为1.35%;最低检出浓度为0.2μg㊃m L -1(供试品溶液浓度的0.01%);供试品溶液在24h 内稳定㊂结论 该方法简便㊁准确㊁可靠,能满足琥珀酸美托洛尔有关物质的限度检测要求㊂关键词:琥珀酸美托洛尔;有关物质;H P L C中图分类号:R 927.2 文献标志码:A收稿日期:2020-06-11作者简介:许笑笑(1989-),女,硕士,主治医师㊂研究方向:天然活性成分研究及药物开发㊂D e t e r m i n a t i o n o f t h e r e l a t e d s u b s t a n c e s o f M e t o p r o l o l S u c c i n a t e b y HP L C X U X i a o x i a o 1 S U N L i n21 D e n g z h o u C e n t r a l H o s p i t a l D e n g z h o u 474150 C h i n a2 T h e T h i r d A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Z h e n g z h o u U n i v e r s i t y Z h e n gz h o u 45000 C h i n a A b s t r a c t O b je c t i v e T o e s t a b l i s h H P L C m e t h o d t o d e t e r m i n e t h e r e l a t e d s u b s t a n c e s of M e t o p r o l o l S u c c i n a t e M e t h o d s C 18c o l u m n 150mmˑ4 6mm 5μma mm o n i u m a c e t a t eb u f f e r s o l u t i o n 3 9g ac e t i c a mm o n i ad i s s o l ve d i n 810m L w a t e r w i t h a n a d d i t i o n of 2 0m L t r i e t h y l a m i n e 10 0m L a c e t i c a c i d 3 0m L p h o s ph o r i c a c i d a d d e d 146m L a c e t o n i t r i l e a s m o b i l e p h a s e T h e f l o w r a t e w a s 1 0m L m i n -1T h e c o l u m n t e m p e r a t u r e w a s k e pt a t 25ħa n d t h e d e t e c t i o n w a v e l e n g t h w a s 280n m T h e s a m p l e s i z e w a s 20μL R e s u l t s T h e d e g r e e o f s e p a r a t i o n o f M e t o p r o l o l S u c c i n a t e a n d i m p u r i t y A p e a k s w a s g r e a t e r t h a n 8 t h e d e g r e e o f s e p a r a t i o n o f M e t o p r o l o l S u c c i n a t e a n d o t h e r i m p u r i t yp e a k s m e t t h e r e q u i r e m e n t s T h e p r e c i s i o n r e s u l t s R S D w a s 1 35% T h e d e t e c t i o n l i m i t w a s 0 2μgm L -1T h e s o l u t i o n w a s s t a b l e i n 24h C o n c l u s i o n T h e m e t h o d i s s i m pl e a c c u r a t e a n d r e l i a b l e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f r e l a t e d s u b s t a n c e s o f M e t o pr o l o l S u c c i n a t e K e y wo r d s m e t o p r o l o l s u c c i n a t e r e l a t e d s u b s t a n c e s H P L C 琥珀酸美托洛尔为选择性β1受体阻滞剂,用于治疗高血压㊁冠心病㊁慢性心力衰竭和心律失常[1]㊂琥珀酸美托洛尔及其制剂在美国药典(U S P 34)和英国药典(E P 2011)[2-3]均有收载,我国药典暂未收载㊂我们参照英国药典(E P 2011)琥珀酸美托洛尔有关物质H P L C项下的方法,建立琥珀酸美托洛尔有关物质的H P L C 检测方法,并参照中国药典‘药品标准分析方法验证指导原则“[4]对本方法进行了验证㊂1 仪器与试剂A gi l e n t 1260高效液相色谱仪,A L 204电子分析天平㊂琥珀酸美托洛尔原料(自制),琥珀酸美托洛尔2020,39(6)河南大学学报(医学版)㊃389㊃杂质A(008E15)㊂乙腈㊁三乙胺为色谱纯;水为超纯水;其他试剂均为分析纯㊂2方法与结果2.1色谱条件色谱柱:Z O R B O X-C18,150mmˑ4.6mm,5μm;流动相:醋酸铵3.9g,用810m L水溶解,加三乙胺2m L㊁冰醋酸10m L㊁磷酸3m L和乙腈146m L,混合均匀;流速:1.0m L㊃m i n-1;柱温:25ħ;检测波长:280n m;进样量:20μL㊂2.2溶液的制备2.2.1供试品溶液的制备取琥珀酸美托洛尔20m g,置10m L量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液,即得㊂2.2.2对照溶液a的制备取琥珀酸美托洛尔5m g㊁琥珀酸美托洛尔杂质A3m g,置100m L量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液,即得㊂2.2.3对照溶液b的制备精密量取供试品溶液1.0m L,置100m L量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀;精密量取1.0m L,置10m L量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液,即得㊂2.2.4对照溶液c的制备取琥珀酸美托洛尔10m g,置10m L量瓶中,用0.1m o l㊃L-1盐酸溶液溶解并稀释至刻度,摇匀;将该溶液放置254n m波长的紫外灯下照射6h;精密量取1.0m L,置50m L量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液,即得㊂如果供试品溶液中出现一个峰面积较对照溶液b峰面积大的且出峰时间为对照溶液b主峰0.3倍保留时间的峰,进样对照溶液c,该溶液仅用于鉴定杂质C的峰㊂2.2.5计算公式杂质C=供试品溶液中杂质C峰面积ˑ0.1对照溶液主峰面积ˑ1000ˑ100%,其他单杂=供试品溶液中单个杂质峰面积对照溶液主峰面积ˑ1000ˑ100%,总杂=供试品溶液中所有杂质含量的总和㊂2.3方法学考察2.3.1系统适用性按2.1项下色谱条件,量取对照溶液a20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍㊂杂质A与主峰分离度为8.85㊂2.3.2专属性1)空白试验㊂取流动相20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍㊂2)杂质C定位㊂量取对照溶液c20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍㊂3)降解试验㊂采用强酸(加6m o l㊃L-1盐酸0.5m L,60ħ水浴加热2h)㊁强碱(加6m o l㊃L-1氢氧化钠0.5m L,60ħ水浴加热2h)㊁强氧化(加体积分数为30%过氧化氢1.0m L,60ħ水浴加热1h)㊁高温(100ħ条件下加热1h)㊁强光(4500ʃ500)l x条件下照射24h方法对琥珀酸美托洛尔进行破坏,使其产生降解产物,同时制备空白降解溶液,按上述方法进行测定㊂本品在氧化降解杂质数量和杂质含量上增加明显,主峰与相邻杂质分离度分别为4.11和1.51㊂其他降解试验的降解产物较少,琥珀酸美托洛尔与相邻杂质的分离度均大于3㊂2.4最低检测限取对照溶液b20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍,量取琥珀酸美托洛尔峰高和基线噪音,计算琥珀酸美托洛尔的信噪比(S/N)为31.5㊂取琥珀酸美托洛尔对照溶液b用流动相稀释10倍,进样检测,记录色谱图,琥珀酸美托洛尔峰的信噪比为3.5,即最低检出浓度为0.2μg㊃m L-1(供试品溶液浓度的0.01%)㊂2.5精密度试验取琥珀酸美托洛尔对照溶液b20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图至琥珀酸美托洛尔主峰保留时间的3倍㊂连续进样6次,主峰峰面积的R S D为1.35%㊂2.6溶液稳定性取供试品溶液和对照品溶液b,室温条件下,分别于0㊁4㊁8㊁12㊁24h测定,杂质C㊁最大单杂和总杂含量的绝对偏差均不大于0.003%,说明琥珀酸美托洛尔供试品溶液在24h内稳定㊂2.7样品有关物质测定取琥珀酸美托洛尔样品3批,按前述方法检测,计算有关物质,结果见表1㊂㊃390㊃J o u r n a l o f H e n a n U n i v e r s i t y(M e d i c a l S c i e n c e)2020,39(6)表1样品含量测定结果批号最大单杂/%总杂/% 1205010.090.14 1205020.060.09 1205030.040.063讨论3.1方法的确定琥珀酸美托洛尔在美国药典(U S P34)中列出有琥珀酸美托洛尔杂质A㊁B㊁C㊁D四种杂质,英国药典(B P2011)中则列出有12种已知杂质;U S P采用分别用杂质对照品测定琥珀酸美托洛尔中杂质A㊁B㊁C㊁D的含量,对4种已知杂质测定结果准确,而其他杂质仍需用自身对照法测定㊂E P采用自身对照法结合杂质A和杂质C定位,加校正因子方法计算杂质C,不加校正因子计算杂质A和其他杂质,对杂质对照品要求相对较低㊂我们参照E P,经方法学验证,该方法简便㊁准确㊁可靠,能满足琥珀酸美托洛尔有关物质的限度检测要求㊂3.2耐用性将柱温分别设定为20㊁25㊁30ħ,其他按照前述色谱条件进行测定,琥珀酸美托洛尔和杂质A的分离度无显著差异,单杂和总杂的含量测定结果无显著变化㊂将流动相流速分别设定为0.9㊁1.0㊁1.1m L㊃m i n-1,其他按照前述色谱条件进行测定㊂琥珀酸美托洛尔和杂质A的分离度均大于8,单杂和总杂的含量测定结果无显著变化㊂配制流动相比例分别814ʒ156㊁824ʒ146㊁834ʒ136,其他按前述色谱条件进行测定,琥珀酸美托洛尔和杂质A的分离度分别为7.9㊁8.8㊁9.1,单杂和总杂的含量测定结果无显著变化㊂说明该方法耐用,色谱条件的轻微改变不影响该分析方法的测定结果㊂参考文献:[1]中华医学会心血管病学分会,中华心血管病杂志编辑委员会.β肾上腺素能受体阻滞剂在心血管疾病应用的专家共识[J].中华心血管病杂志,2009,37:195-209.[2]美国药典[S].2011:3508-3509.[3]英国药典[S].2011:1452-1454.[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部[S].中国医药科技出版社,2015:105-109[责任编辑段金卯](上接第387页)参考文献:[1]唐哲,西娜.我院辅助用药合理管控的探索与实践[J].中国药房,2016,27(31):4396.[2]茹爱忠,刘静,蔡瑞君,等.建立辅助用药预警监控干预体系对合理用药及新医改控费的作用[J].中国药事, 2018,32(1):97-103.[3]韩爽,钟敏涛,李锦,等.我国辅助用药应用现状及管理对策初探[J].中国药学杂志,2016,51(8):678-682.[4]路丹,卢成华.我院2013-2015年辅助用药应用分析[J].中国药房,2017,28(8):1030-1033.[5]王笑妍,付秀娟,黄玉鑫,等.我院重点监控药品的药事管理模式探索[J].中国药房,2018,29(7):882-885.[6]王丽,蔡德芳,陈勇,等.辅助用药分类方法探索[J].中国药师杂志,2015,18(12):2156-2159.[7]马洁,王南,张四喜,等.以P D C A循环理论为基础的临床药师工作模式探讨[J].中国医院药学杂志,2018,38 (5):555-557.[8]徐婷,张妍,李莉,等.基于信息化手段探索建立医院辅助用药廉政风险防控预警体系[J].江苏卫生事业管理,2019,30(5):655-658.[9]徐敢,王冲.药占比在医院管理评价工作中的管制价值和社会效果分析[J].中国药房,2015,26(34):4762-4765.[责任编辑段金卯]。

有关物质测定hplc方法的建立一、开始之前必须明白：1、有关物质来源的两种途径：1）合成过程中的中间体和副产物；2）储存过程中产生的降解产物；2、分析你的样品结构，熟悉样品的基本性质；3、样品中可能含有的中间体；4、样品的基本稳定性和可能产生的降解产物；二、准备工作1、查阅文献，看看是否同行已经做过类似的工作，有的话就简单了，直接奔主题了。

2、没有文献（苦！），那就很是麻烦了。

1）分析结构，看看有无紫外吸收，有就比较简单，选用紫外检测器就行了，没有的话那就麻烦，可以选用蒸发光散射检测器等；2）分析结构，看看选用何种色谱方式进行分离（正相或者反相色谱）；3）分析结构，看看流动相该如何选择，要不要选用一些离子对试剂。

4）分析结构。

5）与同类产品进行比较；三、开工（以紫外检测为例）1、流动相的选择（采用粗品进行选择）1）、有文献，按文献进行优化。

不过我得提醒一下，文献的方法参考是可以的，要想完全按照他的条件做出来是很难的。

2）、没有文献。

a、紫外扫描一下，看看哪里有最大吸收。

将能得到的中间体、副产物、分解产物、样品配成相同浓度，在紫外扫描分光光度计上扫描一下，选择所有物质具有相同的最大吸收处的波长作为测定波长。

要是有pda检测器就不需要这一步了。

b、还是得找一些资料，看看类似的样品的流动相，以它为起始流动相进行选择，如果没有，那就找专业书吧，看看它是怎么教你选择流动相的。

2、最低检测限3、系统适应性试验重复进样5次，记录色谱图，给出系统评价报告4、考察中间体及副产物和样品的分离度。

同时定出中间体在色谱图中的出峰位置，为定质量标准提供依据。

5、考察降解产物和样品的分离情况。

这个一般是通过破坏性试验来考察。

常用的一般是高温、强光、氧化、强酸、强碱五个因素进行考察，通过考察，应该可以知道色谱图中那些峰是由于什么因素产生，这个也可为定质量标准提供依据。

6、根据上面的试验，应该可以知道样品的一些大概情况了，样品中有哪些杂质应该比较明确了。

环孢素A血药浓度的HPLC测定方法目的：建立环孢素A血药浓度的HPLC测定方法。

方法：采用反相HPLC 的方法，血样经乙醚萃取，正己烷洗脱等处理后测定。

采用DiamonsilTM C18色谱柱，流动相为乙腈-水（74：26，V/V），流速为1 ml/min，柱温为70 ℃，检测波长为210 nm。

结果：环孢素A血药浓度在50～1000 ng/ml范围内线性关系良好，R2=0.9997，低中高三种浓度的提取回收率为70.01%～75.00%，方法回收率为98.93%～103.08%，日内精密度RSD为0.84%～4.76%，日间精密度RSD 为5.38%～9.87%。

结论：该方法快速灵敏准确，可用于环孢素A血药浓度的监测。

标签：环孢素A；高效液相色谱；血药浓度监测环孢素A（Cyclosporine A，CsA）是一种强效免疫抑制剂，目前广泛用于器官和组织移植术后的预防和治疗[1]。

然而CsA治疗的有效血药浓度范围为100～450 μg/L，600 μg/L以上即有中毒危险[2]，特别是肝肾毒性明显[3]。

CsA治疗窗窄，个体差异大，因此，临床应用必须监测其血药浓度。

本实验建立了一种简单准确的HPLC测定CsA血药浓度的方法，现报告如下。

1 材料与方法1.1 仪器与试剂CsA 标准品，乙醚，正己烷，甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），Agilent 1200型高效液相色谱仪，DiamonsilTM C18色谱柱，GENIUS 6K-D 离心机，XW-80A漩涡混合仪。

1.2 标准溶液的配制精密称取CsA标准品10.006 mg置于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，作为CsA标准品储备（100 μg/mL）。

用甲醇稀释，分别配成2.5、5、10、25、50 μg/ml的CsA标准品溶液。

1.3 样品的处理1.3.1 空白血样取人全血1～10 ml均塞离心管中，加入1 ml0.1 mol/L的NaOH溶液，涡旋2 min，加入5 ml乙醚，涡旋5 min，3500 r/min 离心10 min，取上清液4.5 ml，40 ℃水浴吹干，加入100 μl甲醇-0.05 mol/ml 盐酸（1：1，V：V）的混合液[4]，涡旋30 s，加入250 μl正己烷，涡旋2 min，3500 r/min离心5 min，弃去正己烷，取下层溶液进样。

有关物质方法学研究l 主要内容1、有关物质检查方法建立的研发思路2、有关物质方法的建立和方法学验证2.1、原料药和制剂的相关理化性质2.2、有关物质分析方法的选择2.3、有关物质分析方法的验证2.4、有关物质杂质的定量方法3、有关物质杂质的分析4、有关物质杂质限度的制订有关物质检查方法建立的研发思路研发思路：有关物质检测方法的建立重点是测定方法的先进性、准确性、可行性。

⑴首先有关物质的方法选择，对于仿制药有EP、BP、USP等质量标准的药品，首选以上的色谱条件进行筛选，尤其关注的离子对试剂的使用。

⑵选用不同色谱条件进行对比研究，如果方法一是等度测定的，方法二最好选用梯度色谱条件，比较两种方法测定结果的杂质个数及杂质含量等。

确证有关物质测定方法的准确性。

⑶对所筛选的方法进行系统的方法学研究，比较不同检测方法的优劣，选择较好的色谱条件作为本品有关物质检查的测定方法。

⑷对于仿制药同时要将自制样品与市售原研样品进行全面的质量比较，分析其杂质的种类和含量，确保自制样品与市售原研样品的杂质在同一水平。

原料药和制剂的相关理化性质在建立有关物质检查方法前，需首先了解原料药和制剂的相关理化性质。

⑴对于原料药，了解原料药的基本性质和结构特点。

了解原料药合成工艺过程中的起始原料、副产物、副产物产生的杂质、中间产物或可能产生的降解产物等。

结合相关已知的杂质来确定有关物质检测的条件。

⑵对于制剂，可能影响药物有关物质的重要因素有辅料、剂型、存储条件等，主要了解辅料对有关物质检测的干扰情况，不同剂型在不同存贮条件下可能产生的杂质等。

对于复方制剂，同时要考虑到复方中原料的相互作用可能产生的杂质等。

有关物质分析方法的选择有机杂质的检测方法包括化学法、光谱法、色谱法等，因药物结构及降解产物的不同采用不同的检测方法。

通过合适的分析技术将不同结构的杂质进行分离、检测，从而达到对杂质的有效控制。

目前普遍采用的杂质检测方法主要有：⑴高效液相色谱法（HPLC）目前采用的分析方法主要以高效液相色谱法为主，为常用的分析方法。