基因工程制取干扰素共47页文档

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干扰素生产工艺(共45张PPT)

第二十八页，共45页。
3.4．菌体收集
连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min离心收集。菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体枯燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。
第二十九页，共45页。
4 干扰素的别离纯化工艺过程
4.1、干扰素别离工艺过程 4.2、干扰素的纯化工艺过程
第十页，共45页。
免疫调节活性机制
对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞外表MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞外表表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后参加干扰素那么能产生免疫增强的效果。在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。
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〔4〕初级别离
盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。离心：连续流离心机，16000 r/min保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。
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4.2、干扰素纯化工艺过程
溶解粗干扰素沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装
第十二页，共45页。
1.5.干扰素生产工艺路线〔1〕

基因工程干扰素制备流程

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干扰素制备的工艺流程PPT课件

2020/2/21
14
质粒DNA的纯化②
6)吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽l次。
7)将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积(约lml)乙醇，于室温放置10分钟，于4 ℃以 12000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。
3 破碎细胞,提取细胞总mRNA.
4
用逆转录试剂盒逆转录,把总mRNA逆转录成cDNA
5
以cDNA为模板、干扰素引物为引物,PCR,得到完全的干扰素基因的PCR产物
2020/2/21
6
目的基因与克隆载体进行体外重组
1.提取载体(连接
2020/2/21
,现在来进行生
2
基因工程菌的制备
目的基因的分离
目的基因与克隆
克隆载体
载体的体外重组
重组导入大肠杆菌K12
受体菌的培养及筛选
从受体菌中获取目的基因重组质粒
表达载体
导入大肠杆菌
受体菌的筛选（表达性、稳定性等检测）
工程菌
2020/2/21
3
2020/2/21
4
工艺流程
目的基因的分离与获得
2、细菌的收获和裂解
1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全
部流尽。
2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。
STE 0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(Ph8.0)
1mmol/L EDTA(Ph8.0)
按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。
级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%,培养4小时。然后控制培养温度20℃ ，pH6.0, 溶解氧60%,继续培养5-6.5小吋。同时进行发酵液杂菌检查，当0D值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10℃以下。

基因工程重组人干扰素共14页word资料

根据来源、基因序列和氨基酸组成分类I 型干扰素：IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等功能：抗病毒感染、抗肿瘤生长免疫调节(较弱）其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型。

II 型干扰素：干扰素γ（IFNg)来源：活化的T细胞和NK细胞产生功能：免疫调节➢提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力➢增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性➢抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答➢趋化作用➢抗病毒和抗肿瘤作用（次要）2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。

免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。

●对巨噬细胞的作用：IFNγ可使巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。

●对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应。

在抗原致敏之前使用大剂量干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫抑制作用；而低剂量干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫增强的效果。

在适宜的条件下，IFNγ对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。

IFNγ能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。

IFNγ不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。

●对其它细胞的作用：IFNγ对其他细胞也有广泛影响：①刺激中性粒细胞，增强其吞噬能力；②活化NK细胞，增强其细胞毒作用；③使某些正常不表达MHCⅡ类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHCⅡ类分子，发挥抗原递呈作用；④使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞。

干扰素的工艺制备流程

取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人
每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存
活，说明成品合格。
4 国内基因工程药物产业发展状况
我国的生物技术药物却一直苦于缺乏自主创新的产品，绝大多数上市药物为仿制药，创新药物的开发一直未能打开局面。
一种新药从研发到投放市场，投入大约为30亿~60亿美元。
基因工程菌的制备
❖ 目的基因的分离克隆载体
→ 目的基因与克隆
载体的体外重组
重组体导入大肠杆菌K12
→
→
受体菌的培养及筛选从受体菌中获取目的基因
表达载体
重组质粒
导入大肠杆菌
→
受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测
工程菌
一、目的基因的分离与扩增
❖ 1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA ❖ 2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶
存在的问题：
（1）同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞争，严重影响产业的健康发展。
（2）融资渠道单一、产业发展资金不足。（3）医药市场竞争无序，行业不正之风严重。（4）企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮乏。
后面附件PPT常用图标，方便大家提高工作效率
140 BUSINESS & FINANCE ICONS
源性DNA应低于100pg。
❖ （7）残余血清IgG含量测定
❖
在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项
检定。
❖ （8）残余抗生素活性测定
❖
半成品中不应有抗生素活性存在。
❖ （9）紫外光谱扫描
❖
检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳
米。

基因工程药物-干扰素的制备

基因工程药物-干扰素的制备
基因工程技术为干扰素的制备带来了革命性的突破。本节将介绍干扰素的概述以及基因工程在干扰素制备中的应用。
基因工程技术在干扰素制备中的应用
1
基因克隆
通过克隆干扰素基因，实现大规模制备。
2
表达与纯化
将干扰素基因导入宿主细胞，并优化表达和纯化工艺。
3
转化与改性
通过转化和改性技术，提高干扰素的稳定性和疗效。
市场增长潜力
随着生命科学技术的发展，干扰素药物市场有望持续增长。
疗效和安全性
干扰素在疾病治疗中的广泛应用为其市场发展提供了机遇。
竞争格局
多家制药公司已进入干扰素药物市场，竞争激烈。
பைடு நூலகம்
干扰素的生产工艺
步骤1
干扰素基因的克隆和构建。
步骤2
干扰素基因的表达与纯化。
步骤3
干扰素的转化和改性。
常见干扰素药物的种类和特点
α-干扰素
广谱抗病毒活性，治疗病毒感染和肿瘤。
β-干扰素
用于多发性硬化症等自身免疫性疾病的治疗。
γ-干扰素
具有免疫调节和抗肿瘤活性。
干扰素药物的临床应用
抗病毒治疗
干扰素可用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等病毒感染。
自身免疫疾病
用于多发性硬化症等自身免疫性疾病的治疗。
抗肿瘤治疗
干扰素可用于肝癌、黑色素瘤等肿瘤的辅助治疗。
干扰素药物的不良反应与副作用
1 注射部位反应
2 全身反应
局部疼痛、红肿等不良反应常见。
发热、乏力、恶心等全身不适感可能发生。
3 免疫反应
干扰素可引起免疫相关不良反应，如抑制造血功能等。
干扰素药物市场前景分析

(完整word版)基因工程制备干扰素

(完整word版)基因工程制备干扰素毕业论文(设计)题目浅谈基因工程生产人干扰素姓名乔雪姣学号11111807专业微生物技术及应用指导教师鞠守勇职称讲师中国·武汉二○一二年十一月目录摘要........................................................................................................... 错误!未定义书签。

关键词......................................................................................................... 错误!未定义书签。

Abstract .. (4)Key words ................................................................................................. 错误!未定义书签。

前言. (5)1、干扰素作用及其机理详述 (6)1.1干扰素的种类 (6)1.2干扰素的性质 (7)1.3干扰素的作用.............................................................................. 错误!未定义书签。

1.3．1 干扰素的作用...................................................................... 错误!未定义书签。

1.3.2 干扰素的作用示意图............................................................. 错误!未定义书签。

1.4 干扰素的作用机理 .................................................................... 错误!未定义书签。

干扰素的制备

得的质粒进行双酶切，获得目的基因与PBR322 质粒片段，通过琼脂糖凝胶电泳，由于目的基因与 PBR322质粒片段相对分子量不同，在电泳过程中产生不同的条带，通过与已知基因长度的对比，我们可以选出相应的目的基因，接着利用Qiagen纯化柱回收纯化DNA。具体：用3倍体积的特殊高盐溶液于 55°融化带有目的基因的DNA片段的琼脂糖凝胶块，将DNA释放到水溶液中。然后将其通过Qiagen纯化柱，经过如图结合—洗涤—洗脱步骤，直接得到纯化的DNA样品。 • 利用核酸探针杂交法鉴定目的基因
将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。
图为：质粒pBR322
四、从大肠杆菌k12获取目的基因
由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况 • 流程：步骤一：将细菌涂布到含氨苄青霉素的培养基上培养，就可得到质粒PBR322或重组质粒的细菌单菌落。 • 步骤二：步骤一获得的每一个细菌单菌落标记为a、b、c、d等，在每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素的培养基上，不能生长的是绝大部分含有重组质粒的细菌及少量可能发生突变的非重组质粒的细菌单菌落。原因：因为PBR322含有抗四环素基因，重组质粒中目的基因插在抗四环素基因中，使其结构破坏，失去抗四环素作用。
启开种子粗提精提分装冻干制备种子液发酵培养
半成品制备
半成品检定
成品检定
成品包装
• 1．菌种制备取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30℃， pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。 • 2．种子罐培养将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌

基因工程制取干扰素

（2）质粒与目的基因的连接
1、取2μl（50 -400ng）载体和7倍摩尔量的插入片段混合好以后置于 45度水浴5min马上置于冰上冷却（插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45度处理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。）。 2、加入2 μl 10×Ligation Buffer（连接缓冲液，内含ATP），用双蒸水调整总体积为20 ul，混匀。然后加入T4连接酶1ul，轻柔充分混匀（切勿剧烈震荡，可能导致酶部分失活）。16℃连接2小时
6、人工加尾形成 “粘性末端” 、粘性末端”
同聚物加尾法 1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。年斯坦福大学的提出。和提出
①原理：原理： DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。末端转移酶能在没有模板的情况下给末端转移酶能在没有模板的情况下给的端加上脱氧核苷酸。 ②加尾—碱基互补加尾— 分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。互补的核苷酸
• 2、细菌的收获和裂解
１）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。 STE 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。
提取重组质粒
• 1、对上一步获得含目的基因的大肠杆菌在含有氯霉素的培养基中扩大培养 15h。培养时间：前人实验证实大肠杆菌K12生长前6h为迟缓期, 6~15. 5h 为对数增时期, 15. 5~ 19. 5h为稳定期, 19. 5h后为衰亡期。氯霉素：氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制。

基因工程药物——干扰素的制备PPT课件

干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。。

上海生物制品研究所北京三元基因工程有限公司长春海伯尔生物技术有限责任公司深圳科兴生物工程有限公司哈药集团生物工程有限公司天津华立达生物工程有限公司沈阳三生制药有限责任公司安徽安科生物工程(集团)股份有限公司 ……

干扰素在病毒细胞表面与特殊膜受体结合发挥抗DNA和RNA作用，包括对某些酶的诱导作用，阻止受病毒感染细胞中病毒的复制，抑制这些细胞的繁殖。本品具有免疫调节作用，可增强巨噬细胞的吞噬作用，增强淋巴细胞对靶细胞的特殊细胞毒性。 1.抗病毒作用：其抗病毒活性不是杀灭而是抑制病毒，它一般为广谱病毒抑制剂，对RNA和DNA病毒都有抑制作用。当病毒感染的恢复期可见干扰素的存在，另一方面用外源性干扰素亦可缓解感染。 2.抑制细胞增殖：干扰素抑制细胞分裂的活性有明显的选择性，对肿瘤细胞的活性比正常细胞大500～1000倍。干扰素抗肿瘤效果可以是直接抑制肿瘤细胞增殖，或通过宿主机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。 3.干扰素对体液免疫、细胞免疫均有免疫调节作用，对巨噬细胞及NK细胞也有一定的免疫增强作用。
药浓度波动，浓度过高时会导致较为严重的不良反应，但浓度过低又会导致病毒重新复制和反弹；此外，一旦注射了普通干扰素，它广泛期只有2至5小时，必须频繁注射用药，因而干扰素的临床应用受到了很大限制。到1990年代末2000年代之初，聚乙二醇化(PEG)技术的出现使干扰素终于成为人类与乙肝斗争中的真正利器。2002年，罗氏研究生产的聚乙二醇化干扰素α-2a(派罗欣)正式上市，聚乙二醇与干扰素的结合，大大改善了干扰素的药物特性，使血药浓度变得更加稳定，同时聚乙二醇分子支链对干扰素有效成分的保护作用，大大降低了它的抗原性，高，副反应显著减少。

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