成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养

原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热3min，适当振荡；[循环1]5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。

一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法真皮成纤维细胞是一种重要的细胞类型，其在生物医学研究、组织工程和再生医学等领域具有广泛的应用前景。

以下是一种常用的小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法：1. 实验前准备：- 小鼠或大鼠- 麻醉剂，如异氟醚等- 消毒剂- 必需的培养基和培养液2. 小鼠/大鼠的取材：- 麻醉小鼠或大鼠，确保其在实验过程中不会感到疼痛或不适。

- 消毒动物的表面，以减少细菌或其他微生物的污染。

- 取下小鼠/大鼠的皮肤。

使用消毒剪刀和镊子将皮肤切割成小块，以便后续的分离过程。

3. 细胞的分离和培养：- 将皮肤块转移到含有酶解消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，并在37°C的恒温搅拌器上进行酶解（通常为1-2小时）。

- 将酶解后的皮肤块过滤，移至新的培养皿中，加入培养基和培养液，如DMEM/F12或RPMI-1640，并添加10%胎牛血清。

- 将培养皿放在37°C的细胞培养箱中，保持适当的温度、湿度和CO2浓度。

- 培养皿中的细胞会开始生长和扩增。

定期更换培养基，并进行细胞的孵育以保持其正常生长。

4. 细胞的传代：- 当细胞密度达到80-90%时，使用胰蛋白酶或胰蛋白酶-EDTA溶液将培养皿中的细胞与培养皿底部松散的连接断开。

- 将细胞计数，并根据需要的细胞数量进行传代。

一般情况下，将细胞按照1:3或1:4的比例重新分装到新的培养皿中。

- 重复上述步骤，直到获得足够数量且健康的细胞。

这种方法能够有效地分离和培养小鼠或大鼠真皮成纤维细胞，为相关研究提供了重要的细胞资源。

通过优化培养条件和细胞的传代方法，可以获得高质量和稳定的细胞群体，以支持各种实验或应用的需要。

小鼠心脏成纤维细胞说明书
1、组织来源：小鼠乳鼠
2、产品规格：25cm2培养瓶
3、细胞简介：
小鼠心脏成纤维细胞分离自正常大鼠心脏组织，细胞呈梭型、多边形等不规则形状。

体外培养的小鼠心脏成纤维细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。

本公司生产的小鼠心脏成纤维细胞采用酶解法制备而来，细胞总量约为1×106个/瓶，细胞纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

二、使用方法
客户收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

1、取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态；
2、待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养；
3、细胞传代
（1）吸出25cm2培养瓶中的培养基,用PBS清洗细胞一次；
（2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，37℃温浴1-2min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；
（3）用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5ml，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
（4）待细胞完全贴壁后，培养观察。

之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

（备注：由于实验所用试剂与操作环境的不同，以上方法供各实验室参考。

）
三、注意事项
1、培养基于4℃条件下可保存3-6个月；
2、在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作；
3、传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态；
4、该细胞只可用于科研。

成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定王丽娟;贾大林;齐国先【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2007(015)003【摘要】目的探讨成年小鼠心肌细胞分离培养的方法,评价心肌细胞的存活状况.方法应用改良Langendorff方法进行成年小鼠心脏灌流,分离并培养心肌细胞, 评价杆状心肌细胞的比例变化.台盼蓝染色判定心肌细胞活力,应用毒胡萝卜素(thapsigargin) 治疗心肌细胞24 h后,WST方法测定细胞生存率.结果在每个成年小鼠心脏分离了40～60万的心肌细胞,台盼蓝染色结果68%为存活心肌细胞.心肌细胞培养1 h、24 h及48 h后,杆状心肌细胞的比例分别为70%、50%及30%.心肌细胞生存率随着毒胡萝卜素浓度的增加逐渐减低,其中1、5及10 μmol/L毒胡萝卜素的生存率明显低于对照组 (P＜0.05,P＜0.01).结论应用改良Langendorff 方法及严格控制心脏灌流培养的条件,可以成功地分离培养成年小鼠心肌细胞,有助于进行细胞分子水平的研究.【总页数】4页(P175-178)【作者】王丽娟;贾大林;齐国先【作者单位】中国医科大学第一临床学院循环内科,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学第一临床学院循环内科,辽宁,沈阳,110001;中国医科大学第一临床学院循环内科,辽宁,沈阳,110001【正文语种】中文【中图分类】R332【相关文献】1.原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定 [J], 程阔菊;黄河;杜智勇;李洪;杨天德2.乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定 [J], 辛毅;许秀芳;黄益民;张颖;李温斌3.成年C57BL/6小鼠空肠Cajal间质细胞的分离、培养及鉴定 [J], 刘登群;龙爽;王军平;史春梦;冉新泽;粟永萍4.C57胎鼠、乳鼠及成年小鼠心室肌细胞分离、培养及鉴定 [J], 张玲;段明军;魏琴;陈华;时利;侯月梅5.新生小鼠心肌细胞分离培养的改良及其鉴定 [J], 夏机良;朱泽安;张湘涛;王跃群;吴秀山因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

㈠、概述 整体动物⼼肌细胞的增殖能⼒在出⽣后仅能维持⼀个短时期，⼩⿏在出⽣3周后DNA合成所需的酶的活性及⼼肌细胞的增殖能⼒就明显降低⾄成年⿏⽔平。

⼩⿏⼼肌细胞的原代培养，⼀般选⽤⽣后1-10d的乳⿏⼼脏，尤以出⽣1-4d的较好，此时⼼肌细胞已分化充分，适于作各种研究，⽽出⽣4d以后的乳⿏⼼脏中分离出来的⼼肌细胞较慢发育成为有⾃律性搏动的⼼肌细胞。

㈡、[试剂] 1、培养液：1：1 混合的DMEM / F12 培养液，添加终浓度为10%⼩⽜⾎清（FCS）、100IU/ml 青霉素、100µg/ml 链霉素。

2、消化液：胰酶（效价为1：250） 0.08%、胶原酶II（活⼒为150U/mg） 0.05% ，⽤pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制，-20 ℃保存。

3、 D-Hanks溶液（pH 7.2-7.8）：KCl 0.4 g ， KH2PO4 0.06 g ， NaCl 8.00g ， NaHCO3 0.35 g ， Na 2HPO4？7H2O 0.09 g ，酚红 0.01 g 1L ㈢、[实验步骤] 1、取⽣后1-4d的乳⿏，⽤75%⼄醇消毒⽪肤，再⽤⼤头针固定乳⿏的头及四肢，剪开胸部⽪肤，⽤75%⼄醇消毒⽪下组织，更换镊⼦及剪⼑，开胸取出⼼脏，将⼼脏放⼊盛有D-Hanks溶液的平⽫（或青霉素瓶）中，剪去⼼房，剪开⼼室，⽤D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积⾎后，将⼼脏剪成1mm3 ⼤⼩的碎⽚，再将⼼脏碎⽚转移⾄离⼼管中，加5ml左右消化液，37℃消化5 min，⾃然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振摇⼏下），⽤吸管吹打1min 后，将未消化完全的⼼脏碎⽚吸出⾄另⼀离⼼管中，加⼊2ml冷的培养液终⽌消化，1000 rpm 5min ，弃上清，沉淀中加⼊D-Hanks溶液2ml， 1500 rpm 10min ，弃上清，沉淀中加⼊培养液2ml，⽤吸管吹打制成细胞悬液。

将细胞混悬液1 000 r/min离心10 min
去上层，收获细胞
实战程序 第四大步骤：清洗细胞，培养细胞
细胞沉淀用PBS溶液和DMEM清洗3次 弃上清液 加4ml含20%小牛血清的DMEM培养液制 成细胞悬液，置于培养瓶中 培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩
【注意事项】
组织块必须漂洗 2~3 次以除去组织的钙离 子、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑 制作用。 胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免 毒性产生，而且动作要轻，以避免蓬松的细 胞随漂洗而失去。
【实验结果与分析】
记录心肌细胞的培养及动态观察。
实验三 动物细胞的原代培养
【实验目的】
掌握实体组织材料的原代细胞培养的 基本思路。 掌握动物组织中细胞的分离和原代培 养的方法。
【实验原理】（参考教材P128）
原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外
进行的首次培养
是一项基本技术
是建立细胞系的第一步
【实验原理】
原代细胞的分离和制作常采用的方法
用镊子小心剥离心包膜
剪去心房（心脏上半部分）及主动脉
PBS溶液清洗心室组织3次（至没有血时）
将心室组织剪成1~3 mm3碎块后，转移至
离心管
用PBS清洗3遍
实战程序 第三大步骤：消化组织，获得细胞
加0.125%胰蛋白酶（2ml）
37℃水浴中旋摇消化10 min 吸上层（细胞在悬液中，未消化好的组织块在底层） 细胞悬液转至小烧杯 加等体积无血清培养基终止反应，反复3-5次
【实验材料与器材】
本实验用品
每组1个：乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞 培养瓶、移液枪（1ml）及枪头 每组2个：离心管、培养皿

乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养一、实验动物1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。

二、试剂及配制高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。

培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。

0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。

三、实验仪器超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……四、组织消化和分离细胞1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。

用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。

2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。

用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。

3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。

4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。

5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。

6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。

五、培养细胞1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。

小鼠原代成肌细胞分离、纯化及培养熊雷;何衍佶;戴威;赵圆;高彦飞;邓忠良;聂茂【期刊名称】《现代医药卫生》【年(卷),期】2017(33)3【摘要】Objective To establish the methods of isolation,purification and culture of primary mouse myoblast,then to induce its myogenic differentiation and to detect the expression of microRNA-1(miRNA-1) and miRNA-155 during this process. Methods The primary mouse myoblast was isolated and purified from the hind leg of neonatal mouse with collagenase digestion , and difference of cell adherence. Its myogenic differentiation was induced by the differentiation culture medium containing horse serum. The myogenic ability of primary myoblast was identified by myosin heavy chain antibody (MF20) immunofluorescence staining. The expression of miRNA-1 and miRNA-155 during the myogenic differentiation was detected by Taqman real time PCR. Result The primary mouse myoblast was successfully isolated and purified;the myogenic differentiation of primary myoblast was successfully induced and MF20 immunofluorescence staining was positive. The miRNA-1 expression was dramatically up-regulated, while the miRNA-155 expression was down-regulated during the myogenic differentiation of primary mouse myoblast ,the difference was statistically significant(P<0.05). Conculsion The isolation and purification method of primary mouse myoblast issuccessfully constructed by this study ,which provides a model in vitro for investigating the miRNA gene regulation during myo-genic differentiation process.%目的建立小鼠原代成肌细胞分离、纯化及培养方法，并诱导其成肌分化，检测成肌分化过程中微小RNA-1（miRNA-1）和miRNA-155表达情况。

小鼠心肌细胞的原代培养注意事项
一、实验前准备
1.1 材料准备
1.2 设备准备
1.3 环境要求
二、小鼠心肌细胞的原代培养操作步骤
2.1 小鼠心肌细胞的分离和培养基的配制
2.2 小鼠心肌细胞的原代培养
三、培养基的更换和维护
3.1 培养基的更换
3.2 细胞状态观察和维护
四、实验中常见问题及解决方法
4.1 细胞污染问题及解决方法
4.2 细胞生长不良问题及解决方法
4.3 细胞死亡问题及解决方法
五、实验安全注意事项
5.1 实验室安全措施要求
5.2 实验过程中个人防护措施要求
六、实验结果的分析和记录方式
6.1 实验结果的观察和记录方式
6.2 数据处理和结果分析方法
七、实验结束后处理方式
7.1 培养皿、试管等废弃物处理方式要求7.2 试剂废弃物处理方式要求。

１ ３ 实验 仪 器 超 净 工 作 台 （ 海 浦 东 物 理 光 学 ． 上
仪器 厂 ） Ｃ 培养 箱 （ 国 Ｓ Ｅ ＬＬ Ｂ公 司 ） 普 、Ｏ 美 Ｈ Ｌ Ａ 、
通光 学显微 镜 （ 日本 Ｏ ｙ ｕ ） 离心 机 （ 大利 Ａ Ｃ ｌ ｍｐ ｓ 、 意 Ｌ 公 司） 。 等
胎 牛血清 为接 种培养 液 ， 加入 １ ％新 生 牛 血清 为 交 ０
换 培养液 。酶 消化液 ： 将胰 蛋 白酶溶 于 Ｐ Ｓ缓 冲液 Ｂ （ Ｈ ７ ２～ ． ） ， ｐ ． ７ ４ 中 配成 ０ １ ． ％胰 蛋 白酶 消化 液 ； 将
Ｉ 型胶原 酶 溶 于 Ｐ Ｓ缓 冲 液 （ Ｈ ７２～７４ 中 ， Ｂ ｐ ． ． ） 配 成 ０ ０ ％ 的 胶 原 酶 消 化 液 。０ １ 胰 蛋 白 酶 及 ．８ ．％
１４ 方 法 ．
维细胞 培养 常存 在 污染 、 消化 不 全 和 纯度 不 够 等 现 象 。为此 ， 们 参 照 Ｓｍ ｓｎ等 的 培养 方 法 并 作 我 ｉｐｏ
了改进， 摸索 出一种简便 、 可靠 ， 且同时能培养出心 肌细 胞和心 脏成 纤维 细 胞 的方法 ， 心肌 细 胞 和 心 为 脏 成纤 维 细胞 的 体外 研究 提供 了 更 有 效Байду номын сангаас的技 术 手 段 ， 作报道 。 现
０ ０ ％ Ｉ型胶原 酶 以 ２ １ ．８ ： 混合 ， 配现用 。 现 １ ２ 实验 动物 １～ Ｆ龄 Ｓ ． ３ ｔ Ｄ大 鼠 １ ２ ０～ ５只 ， 由 本 院实验 动物 中心提 供 。
［ 收稿 日期 ］２ ０ －６３ ０９０ －０ ［ 作者单位 ］１蚌埠 医学院 药理学教 研室 ， ． 安徽 蚌埠 ２ ３ ３ ２ 蚌 ３０ ０；． 埠医学 院第一附属医院 心血管 内科 ， 安徽 蚌埠 ２ ３０ ３ ０４ ［ 作者简介 ］张乃菊 （９ １一） 女 ， 士研究生． １８ ， 硕 ［ 通讯作者 ］祝晓光 ， 研究生导师 ， 教授．

原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。

2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。

3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。

4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。

5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。

封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。

第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。

之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。

放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。

这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。

（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。

5只鼠铺一个培养瓶。

4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。

心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。

注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。

心包膜成纤维细胞的分离、培养和鉴定材料和试剂：来源：c57小鼠心脏手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）清洗液：PBS培养液：DMEM添加20%FBS 200IU双抗破红液：常规配方具体操作：1、将100uL的4％戊巴比妥注入C57小鼠体内，待小鼠麻醉至昏厥状态时，将小鼠转入75%的酒精最浸泡5min。

2、在无菌条件下，将小鼠放置于泡沫板上，四肢用针头固定。

3、用左手持直头眼科镊子夹住小鼠腹部最下方的皮毛，右手拿手术剪将小鼠的皮剪开，沿着腹部下方一直剪至小鼠下颚。

4、左手换一个无菌的弯头眼科镊子夹住最下方的腹腔，右手拿另一个无菌的手术剪将小鼠的腹腔剪开，剪开胸膜，找到心脏。

5、在无菌条件下，左手拿弯头眼科镊子将心脏轻轻固定，右手拿手术剪，剪去连在心脏上的结缔组织，取C57小鼠心脏，去除多余的组织，用预冷的PBS清洗3次。

6、左手拿直头眼科镊子，轻轻心脏固定，右手拿弯头眼科镊子撕取心脏的两层外包膜，尽量不带其他组织，若不小心带上其他组织，可用镊子轻轻的将其他组织捋去。

7、左手拿直头眼科镊子将分离的心包膜轻轻固定，右手用动脉剪剪成1mm³大小的组织块后，用破红液浸泡2分钟，去除血细胞，再用PBS清洗2-3次。

8、将组织块植入6孔板，组织块之间的间隙在3 mm³左右，用枪头吸取多余的液体，将6孔板倒扣在培养箱中2小时，加入培养液1mL静置培养7天，7天即可观察到心包膜成纤维细胞爬出，如图所示。

9、7天后移去组织块，待细胞长满6孔板后，用时差贴壁法纯化细胞，细胞纯度达90%以上后，可冻存保种。

结果展示：1.从细胞形态学：成纤维细胞为长梭形状，且从心包膜组织块中爬出，知道长满整瓶图1.成纤维细胞正从心包膜组织块中爬出2、荧光鉴定：使用波形蛋白Vimentin抗体进行荧光鉴定图2，用波形蛋白抗体对成纤维细胞进行免疫荧光鉴定结果图3，用波形蛋白抗体对成纤维细胞进行免疫荧光鉴定结果武汉云克隆诊断试剂研究所。

改良联合酶消化法提取成年小鼠原代心脏成纤维细胞陈洪群; 郑梅; 晏乘曦; 黄鹏; 赵兴山【期刊名称】《《山东医药》》【年(卷),期】2019(059)021【总页数】4页(P38-41)【关键词】组织细胞提取法; 改良联合酶消化法; 心脏成纤维细胞; 原代培养; 成年小鼠【作者】陈洪群; 郑梅; 晏乘曦; 黄鹏; 赵兴山【作者单位】民航总医院北京100123; 北京积水潭医院; 首都医科大学宣武医院【正文语种】中文【中图分类】R318随着现代动物实验技术的发展，原代细胞的分离提取已经广泛应用于各个领域的研究[1～4]。

成年小鼠的心脏成纤维细胞，在研究心脏纤维化[5～7]、心衰、心脏重构[8～10]等方面应用广泛。

目前大多数实验采用细胞系作为实验对象，但细胞系是永生化的细胞，其基因型、生理特性等都已发生变化，不能完全反映细胞真实状态[11]。

国内偶有原代小鼠心脏成纤维细胞的提取方法，但大多是乳鼠。

既往提取小鼠心脏成纤维细胞的方法多为联合酶室温下消化法[12]或利用提取心肌细胞后剩余残液培养成纤维细胞。

联合酶室温下消化法受室内温度影响较大，在不同季节、不同实验室难以重复；消化提取时间过长，大量成纤维细胞被消化酶损伤，导致成纤维细胞产量少，难以传代。

利用提取心肌细胞后剩余残液培养成纤维细胞法提取残液中混杂内皮细胞等导致成纤维细胞纯度低。

2017年12月～2018年4月，我们在联合酶消化法的基础上改进了消化温度、提取液储存方式(改良联合酶消化法)稳定地提取了成年小鼠原代心脏成纤维细胞。

1 材料与方法1.1 动物、试剂 C57BL/6 小鼠，雌雄不限，SPF 级，42～46日龄，体质量15～20 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0011。

主要试剂：HG/DMEM、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素均为美国Gibco公司产品，Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶均为美国Sigma公司产品。

成纤维细胞原代分离
成纤维细胞原代分离是指从组织中分离出成纤维细胞并进行初次培养的过程。

成纤维细胞广泛存在于各种组织中，如皮肤、肌肉、内脏器官等，它们在生理和病理过程中具有重要作用。

原代分离成纤维细胞有助于研究其生物学特性、功能及在疾病发生发展中的作用。

成纤维细胞原代分离的具体步骤如下：
1.选择实验动物或组织来源：根据研究需要，选择合适的实验动物或组织来源。

例如，研究心脏成纤维细胞，可以选择新生小鼠心脏作为组织来源。

2.取材：从实验动物或组织中获取成纤维细胞所在的部分，如心脏、皮肤等。

3.酶消化：使用适当的酶（如胶原酶、胰蛋白酶等）分解组织，以暴露成纤维细胞。

酶消化过程中，需要控制温度、时间和酶的浓度，以保证细胞充分分离。

4.分离细胞：将酶消化后的组织悬液通过离心、过滤等方法，分离出成纤维细胞。

此过程中，应注意保持细胞活力，避免过度剪切和机械损伤。

5.培养：将分离出的成纤维细胞接种到培养皿或培养瓶中，加入适当的培养基，置于适当的培养条件（如温度、湿度、气体环境等）下进行原代培养。

此时，成纤维细胞会开始生长、繁殖。

6.观察与检测：在培养过程中，通过倒置显微镜观察细胞形态、数量、生长速度等，以评估分离效果和细胞活力。

此外，还可以采用特定方法（如免疫细胞化学、细胞计数等）对细胞进行鉴定和功能研究。

成纤维细胞原代分离的成功与否取决于实验设计、操作技巧和细胞生物学知识。

为了获得高活力的成纤维细胞，需要在实验过程中严格控制条件，并熟练掌握相关技术。

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养一、实验材料1.主要仪器设备(1)倒置显微镜（Olympus，Japan）(2)CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司）(3)100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂）(4)6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm）(5)Eppendroff管(6)1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿(7)离心机(8)5ml冻存管(9)两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）2.主要试剂配制(1)MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液——低糖DMEM母液1)用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公司）；2)将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。

3)每升培养基中添加3.7gNaHCO3。

4)搅拌直至完全溶解。

5)用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。

6)立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。

——MEF培养液取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。

(2)PBS在500ml超纯水中依次溶入NaCl 4.0gKCl 0.1gNa2HPO4.12HO2 1.445gKH2PO40.1g于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。

实验—小鼠成纤维细胞得原代培养一、实验目得１.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中得取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。

2。

熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞得形态与生长状况得方法．3。

了解细胞原代培养与传代培养得原理与方法。

二、实验原理自１７世纪下半叶Robｅrt Hooｋｅ提出“细胞"概念直至2０世纪中叶，细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来.现代生命科学以及相关领域得研究前提就是细胞得维持与增殖，因此,细胞培养不仅就是细胞生物学得密不可分得组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学得重要内容。

细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科得一条主要途径。

如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用得基础技术之一。

细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题得研究。

细胞培养得直接目得就是维持或扩增细胞数量。

依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养．1.原代培养(pｒimary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前得培养。

但实际上通常把第一代至第十代以内得培养细胞统称为原代细胞培养.原代培养就是建立细胞系得第一步,其最基本得方法有两种：组织块培养法与消化培养法.组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用得原代培养方法，其将刚刚离体得、生长活力旺盛得组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁得组织块四周游出并生长。

组织块培养法操作过程简便、易行,培养得细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少得组织得原代培养。

消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂得情况下，直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养得方法。

专利名称：一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法专利类型：发明专利
发明人：王晓冰,杨国峰
申请号：CN201610218220.0
申请日：20160408
公开号：CN105907708A
公开日：
20160831
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，采用特制的复合酶进行长期消化，使得获得细胞总量大，分离度高，活率高；由于采集方式的不同，杜绝了心脏内残留血液的污染和影响，使得本发明的方法获得的心肌细胞细菌、真菌和其他细胞的污染概率极低，同时还能够进行传代培养，为以心肌培养为基础的相关研究提供了良好的细胞培养解决方案。

申请人：王晓冰,杨国峰
地址：200000 上海市松江区莘松路1288弄1251号1201室
国籍：CN
代理机构：上海申新律师事务所
代理人：竺路玲
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