第十章酶的作用机制
P384
（一）酶的活性部位
（1）酶活性部位：酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域，活性部位又称活性中心。
酶分子中与酶活力直接相关的区域称为活性中心，分为：
①结合部位：负责与底物结合，决定酶的专一性。
②催化部位：负责催化底物键的断裂或形成，决定酶的催化能力。
对需要辅酶的酶，辅酶分子或辅酶分子某一部分结构往往是酶活性部位组成部分。
（2）酶活性部位特点：
1. 活性部位只占酶分子中相当小的部分，通常1~2%。
P384 表10-1列举一些酶活性部位的氨基酸残基。
如溶菌酶一共129个氨基酸残基，活性部位为Asp52和Glu35；胰凝乳蛋白酶241个残基，活性部位为His57，Asp102，Ser 195。
2. 活性部位为三维实体。
活性部位氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远，甚至不在一条肽链上，但在空间结构上相互靠近。
因此空间结构破坏酶即失活。
活性中心以外部分可为酶活性中心提供三维结构。
3. 酶与底物的结构互补是指在酶和底物结合过程中，相互构象发生一定变化后才互补。
如P385 图10-1。
4. 活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内。
裂缝中为一个疏水微环境，也含有某些极性氨基酸残基有利于催化，底物在此裂缝内有效浓度很高。
5. 酶与底物结合形成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。
6. 酶活性部位具有柔性和可运动性。
（二）研究酶活性部位的方法
（1）酶侧链基团化学修饰法：
1.特异性共价修饰：如二异丙基磷酰氟（DFP）专一地与酶活性部位Ser-OH的羟基共价结合，使酶失活。
如胰凝乳蛋白酶共28个Ser，但DFP只与活性中心的Ser反应，见P386。
反应后，用HCl将酶部分水解，得含二异丙基磷酸酯（DIP）基团的肽的片断，序列分析定出DIP-Ser为Ser195。
2.亲和标记：用与底物结构相似的修饰剂，对酶活性部位进行专一性共价修饰。
如TPCK（结构式见P387），结构与胰凝乳蛋白酶的底物对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸乙酯（TPE）类似，TPCK只与胰凝乳蛋白酶中His57结合，说明His57为该酶活性部位的一个氨基酸残基。
（2）X-射线晶体结构分析：
可提供酶分子三维结构，了解酶活性部位氨基酸残基所处相对位置与状态，与底物结合后酶分子在底物周围氨基酸残基排列状况，被作用键周围残基状况等。
由此提出活性中心处氨基酸残基组成及催化作用形式。
如溶菌酶：对它水解的糖苷键周围氨基酸残基分析后确定酶的催化基团为Glu35和Asp52。
又如胰凝乳蛋白酶经X-射线晶体结构分析，表明活性部位由Ser195、His57和Asp102组成，并提出这三个氨基酸残基联在一起形成一个“电荷中继网”，如P409 图10-40所示：①没有底物时，His57未质子化，三联体排列为A；②在加上底物后，Ser195转移一个质子给His57，带正电荷的咪唑环通过带负电荷的Asp102静电相互作用被稳定，成为B。
详细酶作用机制见P410 图10-42。
（三）影响酶催化效率的有关因素：
（1）底物和酶的邻近效应与定向效应。
酶催化反应高效率一重要原因是将分子间反应变为分子内反应。
邻近效应：底物与酶先形成中间体络合物，两分子成一个分子，分子内反应速度比分子间反应速度提高。
P388 图10-2 所示：用咪唑催化乙酸对硝基苯酯水解来证实：咪唑可催化乙酸对硝基苯酯的酯键水解成乙酸和对硝基苯酚；若将咪唑分子先共价连接在底物上，在分子内催化酯键
水解，可增速24倍。
定向效应：底物反应基团和酶催化基团正确取位会大大加速反应。
P389 表10-3 用二羧酸单苯酯水解相对速度和结构关系实验表明：分子内催化反应，当催化基团羧基与酯键愈邻近并有一定取向，反应速度愈大。
每移去一个旋转自由度，反应速度约增加200倍。
又如P389所示制备邻羟苯丙酸内酯的分子内酯化反应表明：当在分子中引入甲基使羧基和酚羟基定位，反应速率可提高2.5×1011倍。
（2）底物的形变和诱导契合：
酶使底物分子内敏感键中某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，底物扭曲而接近过渡态，使反应加速。
如具有五元环构象的乙烯环磷酸酯（P390），由于构象更接近磷酸酯水解时的过渡态，P-O 键有电子张力，因此水解速度是磷酸二甲酯的108倍。
溶菌酶作用细菌细胞壁，水解由N-乙酰基葡萄糖胺等构成的糖苷键。
溶菌酶与底物结合时会引起糖环构象由椅式变成半椅式，可加速水解。
（3）酸碱催化：
酶为广义酸碱催化。
咪唑基既是一个强亲核基团，又是一个有效的广义酸碱催化功能基团，因此蛋白质中His含量虽少，但却占有重要的地位。
此外酶蛋白中还有氨基、羧基、巯基、羟基等，都具有广义酸碱催化功能。
（4）共价催化：
有亲核催化或亲电催化。
酶在催化过程中形成中间物，P392 表10-5列出形成共价中间物的一些酶。
酶分子中氨基酸侧链上有许多亲核基团如羟基、巯基、咪唑基等，可进攻底物的酰基、磷酰基和糖基等。
（5）金属离子催化：
几乎三分之一的酶催化需要金属离子，金属离子可以与酶紧密结合，也可以是松散结合。
①金属作用与H+相似，但由于带正电荷更多而作用更强，且容易维持一定浓度。
②金属离子可通过电荷屏蔽作用而促进反应。
如Mg++屏蔽ATP中磷酸基负电荷，消除负电荷排斥作用而加速激酶的反应，此时激酶真正作用底物是Mg2+-A TP，而不是ATP，见P394。
③金属离子通过水的离子化，使水分子更具酸性，促进亲核催化。
④许多氧化还原酶都含有金属的辅基。
（6）多元催化和协同效应：
酶催化反应时常常是几个功能团适当排列共同作用。
如胰凝乳蛋白酶活性中心处三个氨基酸残基组成“电荷中继网”，催化肽键水解；核糖核酸酶催化水解时，His12起广义碱催化作用，接受一个质子，而His119起广义酸作用，和磷酸的氧原子形成氢键。
亚胺内酯水解：在咪唑缓冲液中得酰胺，而在磷酸缓冲液中，尽管pH相同产物却为胺和酯，其区别即为磷酸盐双功能催化。
（7）微环境影响：
酶促反应在酶表面的疏水裂缝（活性中心）中进行，如同反应在有机溶剂中进行，反应基团不为溶剂化，亲核亲电反应均可加速。
如溶菌酶Glu35的羧基在非极性区，催化功能增速3×106倍。
模拟酶由此设计胶束模拟酶和环糊精等。
（四）酶催化反应机制实例：
溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）是第一个用X-衍射阐明结构和功能的酶。
生物功能为催化某些细菌细胞壁多糖的水解，结构如P395图10-9所示。
细胞壁是由NAG（N-乙酰氨基葡萄糖）和NAM（N-乙酰氨基葡萄糖乳酸）通过β（1→4）糖蔗键交替排列而成的多糖。
溶菌酶底物为NAG-NAM交替的六糖，可表示为ABCDEF。
（1）在酶活性部位凹穴中，底物受酶影响D-环发生变形，糖环构象从椅式变成能量较高的半椅式或船式，接近过渡态构象。
（2）酶活性基团处于非极性区的Glu35的羧基不解离，提供一个H+到D环与E环间的糖苷键上氧原子上，D环上的C1与氧原子间的糖苷键断开，形成正碳离子（SP2）过渡态中间物，并
为处于极性区的活性基团Asp52上的羧基负离子所稳定。
六糖中的E及F两糖残基成HO-EF离开，如P398图10-16所示。
（3）正碳离子中间产物进一步与来自溶剂中的-OH反应，解除SP2张力，ABCD四糖残基离开酶分子，Glu35同时质子化恢复原状。
如P399图10-17所示。
（4）至次一次反应完成，细胞壁打开一个缺口。
