附植前胚胎发育的影响

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WY14643对附植前小鼠胚胎体外发育及活性氧的影响

WY14643对附植前小鼠胚胎体外发育及活性氧的影响胡德宝;庄利利;张日欣;张也;李钟淑;方南洙【摘要】为研究人工合成的过氧化物酶体增值物激活受体α特异性受体激活剂(WY14643)对附植前小鼠胚胎体外发育的影响,以及WY14643对附植前小鼠胚胎内部活性氧的影响,通过H2O2诱导建立胚胎氧化损伤模型,添加不同浓度WY14643对胚胎进行体外培养,利用2'7’二氯荧光素二乙酸盐(DCHFDA)测定胚胎内部H2O2含量.结果表明:不同浓度WY14643处理2h后,0.1μmol/LWY14643处理组4-细胞发育率、囊胚率显著高于其他各组(P＜0.05)；经0.1μmol/L WY14643和H2O2联合处理后,其胚胎发育率显著高于单独H2O2处理组和对照组(P＜0.05)；DCHFDA荧光检测发现,WY14643添加组胚胎内部各时期H2O2水平显著低于其他各组(P＜0.05),并且胚胎内部H2O2呈一定的变化规律.说明适宜浓度的WY14643能够增加体外发育胚胎的发育率,减少胚胎内部活性氧水平,并且胚胎内部H2O2水平在4-细胞时期达到最高,囊胚时期显著下降.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2014(030)001【总页数】5页(P167-171)【关键词】WY14643;H2O2;早期胚胎;发育能力【作者】胡德宝;庄利利;张日欣;张也;李钟淑;方南洙【作者单位】延边大学农学院,动物遗传育种与繁殖实验室,吉林延吉133002;延边大学农学院,动物遗传育种与繁殖实验室,吉林延吉133002;延边大学农学院,动物遗传育种与繁殖实验室,吉林延吉133002;延边大学农学院,动物遗传育种与繁殖实验室,吉林延吉133002;延边大学农学院,动物遗传育种与繁殖实验室,吉林延吉133002;延边大学农学院,动物遗传育种与繁殖实验室,吉林延吉133002【正文语种】中文【中图分类】S634.3随着体细胞克隆以及转基因技术等生物工程的不断发展，对体外发育的卵母细胞以及早期胚胎的需求逐渐增多。

氨基酸对哺乳动物胚胎体外发育的影响

的研究结果显示，牛胚胎发育早期（裂４）露于分８暴ｈ
氨环境下可抑制其发育，在桑椹胚阶段有促进作用，而
如果持续处于高浓度氨环境中则对胚胎发育不利。其
具有维持胚胎发育中细胞间渗透压的作用。尽管附植前胚胎能在无氨基酸条件下培养，但是在受精卵的培养液中添加氨基酸可提高胚胎发育率，增加小鼠、、和鼠等囊胚的细胞数。氨基酸的生理作用牛人
氨基酸是胚胎培养液的重要成分，在培养液中添
及造血过程中具有重要作用，但其浓度超过４ｍＩｍ／时可使胚胎致畸、育迟缓。发
在胚胎培养液中添加混合氨基酸可减少培养导致
加氨基酸可促进胚胎发育，高囊胚率、化率和胚提孵
正负效应与环境氨浓度、胚胎发育阶段和持续时间有
关。
２生殖道及胚胎氨基酸含量兔生殖道及胚胎中各种氨基酸成分及浓度随发育阶段不同而不同。卵母细胞、桑椹胚、囊胚腔总氨基酸存在差异，其中甘氨酸在生殖道和胚胎氨基酸中占有重要地位，除卵母细胞外，子宫液、椹胚和囊胚腔在桑中甘氨酸的含量都是最高的，其次是谷氨酸和丙氨酸
啮齿类动物胚胎发育早期的物质转运、消化吸收合成
收稿日期：０５１－７２０ — ０２

简述胚胎附植过程

简述胚胎附植过程胚胎附植是指在体外受精后，将受精卵（胚胎）植入到子宫内壁的过程。

这是人类繁衍的关键步骤之一，也是辅助生殖技术中的重要环节。

胚胎附植过程涉及到胚胎的发育、子宫内膜的准备和植入操作等多个方面。

胚胎附植的第一步是胚胎发育。

在受精卵形成后，经过数天的发育，胚胎逐渐分化成不同的细胞群，形成胚胎球。

胚胎球的外层细胞形成胎盘，并与母体形成连接。

内层细胞则发育为胚胎的各个器官和组织。

胚胎球发育到适当的阶段后，即可进行附植。

胚胎附植的第二步是子宫内膜的准备。

子宫内膜是子宫腔内的一层组织，它在月经周期中会经历不同的变化。

在受精卵附植前，子宫内膜需要达到一定的发育程度，以提供适宜的环境来支持胚胎的生长。

在月经周期的第一阶段，子宫内膜会逐渐增厚，细胞会分泌黏液，为胚胎提供滋养物质。

在受精卵附植前的几天，子宫内膜会变得更加丰富血液供应，形成紧密的连接结构，以便胚胎可以牢固地附着在上面。

胚胎附植的第三步是植入操作。

植入操作通常在医院或诊所进行，由专业的医生或护士完成。

在操作前，医生会使用超声波等技术来确认子宫的位置和形态。

然后，医生会使用一根细长的导管，将胚胎轻轻地植入子宫内膜中。

这是一个微创的过程，通常不需要麻醉。

植入后，胚胎会自行附着在子宫内膜上，并继续发育。

胚胎附植后，医生会对患者进行一段时间的观察和护理。

在这段时间内，医生可能会建议患者避免剧烈运动和性生活，以减少对胚胎的干扰。

同时，医生也会监测胚胎的发育情况，以确保胚胎正常生长。

在一定的时间后，医生会进行妊娠检测，确认是否成功孕育。

总结起来，胚胎附植是一项复杂而精细的过程，需要胚胎的发育、子宫内膜的准备和植入操作的配合。

这个过程在辅助生殖技术中起着重要作用，为那些不能自然怀孕的夫妇提供了一种希望。

胚胎附植的成功与否取决于多种因素，包括胚胎的质量、子宫内膜的状态以及患者的个人因素。

通过科学的操作和医学监测，胚胎附植可以为许多夫妇带来幸福和喜悦。

氧分压_培养基及生长因子对猪体细胞克隆胚胎体外发育的影响

关键词：猪；体细胞核移植；氧分压；生长因子；培养基
Effect of Oxygen Tension, Culture Media and Growth Factors on in vitro Development of Porcine Somatic Cloned Embryos
PAN Deng-ke, LIU Ji, FENG Shu-tang, MU Yu-lian, ZHANG Li
Key words: Pig; Somatic cell nuclear transfer; Oxygen tension; Growth factor; Culture medium
收稿日期：2006-11-22；接受日期：2007-02-14 基金项目：国家“十五”科技攻关项目（2004BA717B）作者简介：潘登科（1972-），男，吉林九台人，博士，研究方向为猪转基因克隆和干细胞。Tel：010-62815893；Fax：010-62899982；E-mail：pand@
。通讯作者冯书堂（1945-），男，河北大名人，研究员，研究方向为小型猪培育和生物技术。E-mail：fst508@
4期
பைடு நூலகம்
潘登科等：氧分压、培养基及生长因子对猪体细胞克隆胚胎体外发育的影响
1187
0 引言
【研究意义】目前，体细胞克隆猪效率较低，克隆胚胎的囊胚发育率在 10%左右，囊胚细胞数约 25～ 35，而体内囊胚的细胞数约为 200。Machaty 等[1]研究发现体外培养的囊胚总细胞数低于体内胚，Koo 等[2] 发现猪的体细胞克隆胚胎（NTEs）以及体外受精胚胎（IVFEs）的细胞数，均明显低于体内胚胎，这反映了猪的体外培养体系还不理想。因此，胚胎体外培养体系的改进将推动猪胚胎体外生产技术的发展，提高体细胞克隆猪的效率。【前人研究进展】近年来猪孤雌激活以及体细胞核移植胚胎的培养方面已经取得了较大进展，但与体内生产的胚胎相比，体外培养胚胎的早期发育率还很低，发育环境不理想[3]。胚胎培养基是影响胚胎发育的一个重要因素。目前，用于猪早期胚胎体外培养比较成功的培养基有 NCSU-23、 PZM-3 和 G2[4]等，其中 NCSU-23 是最常用的[5]。然而该培养基尚有不足，如胚胎发育延迟，细胞数较少。用 Yoshioka 研究出的 PZM-3 培养猪的体内受精胚，囊胚率和细胞数都得到了提高[6]。氧浓度影响胚胎体外培养是近期研究的一个热点[7~11]。胚胎体外培养通常采用 5% CO2，95%空气（20% O2）的气相环境；另一种培养气相是 5% CO2﹕5%～7% O2﹕88%～90% N2，接近生殖道的氧浓度[12]。理论上，低氧可减少培养中自由基和活性氧（ROS）的形成，而活性氧对细胞有毒害作用，易造成 DNA 损伤和脂质过氧化反应[13]。由于猪的卵黄富含脂滴，猪胚胎对脂质过氧化反应特别敏感，因此低氧可能有利于胚胎的发育。目前，两种气相究竟哪种更好还有争议，研究表明有的培养基在低氧环境下更有利于胚胎发育，而有些培养基在普通气相较好。胚胎在体内发育过程中，母畜生殖道分泌的生长因子对附植前的胚胎发育起着重要的作用[14]，如胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子（EGF）以及碱性成纤维因子（bFGF）等。在体外培养胚胎过程中，向培养液内添加生长因子是否对胚胎的发育具有促进作用，研究表明各种类型胚胎在不同阶段的添加效果并不统一[15~17]，对胚胎囊胚发育率和总细胞数的影响也不一致。【本研究切入点】目前，猪的胚胎体外培养的系统仍还不够理想，胚胎体外发育能力较差。【拟解决的关键问题】研究对不同氧分压、几种培养基及添加生长因子（EGF 和 bFGF）对体细胞核移植克隆胚胎的囊胚发育率及囊胚细胞数的影响，优化猪体细胞克隆胚胎体外培养条件，提高克隆胚胎的

小鼠的生殖生理学特点

小鼠的生殖生理学特点(一)性成熟和体成熟动物生长发育到一定程度，即达到性成熟期。

性成熟的表现是生殖器官发育完全，出现第二性征。

这时雄性动物有产生精子、雌性动物有产生卵子的能力，并出现性的要求。

小鼠性成熟时期的标志是：雌性小鼠阴道口张开，出现求偶周期，有交配的欲望，愿意接近公鼠；公鼠睾丸下降，精子生成。

雌鼠一般在20日龄以前阴道口由皮肤闭合，之后阴道口皮肤逐渐变薄，阴道开口，其开口与卵巢机能活动相一致，所以阴道开口是雌鼠性成熟的主要标志。

雄鼠在25日龄左右，睾丸自腹腔落入阴囊，35日龄后睾丸形成精子，40日龄后的精子可受精，同时体重增加较快。

小鼠性成熟日龄因品系及饲养管理条件的不同而有所差异，一般雌性小鼠为35～50日龄，雄性小鼠为45～60日龄。

小鼠的体成熟一般在60～90日龄，此时小鼠体重增长较缓慢，是小鼠的适宜配种年龄。

(二)性周期小鼠为多周期发情动物。

雌性小鼠除妊娠期，通常进行周期性排卵。

性周期为4～5天，一般在发情后2～3小时即可排卵，其性活动一般可分为发情前期、发情期、发情后期和休情期。

产后12～14小时内有一次产后性周期。

自此以后，由于给仔鼠哺乳，性周期暂时停止。

离公鼠独居生产的母鼠，在仔鼠断乳2～6天后可出现下一个性周期。

(三)排卵和交配雌性小鼠排卵期为3～4天，但在排卵期仅有数小时允许公鼠交配。

小鼠属于自发排卵的动物，排卵一般发生在发情期末的半夜至凌晨4:30左右，交配一般发生在排卵前的22:00至次日凌晨1:00，即交配早于排卵2小时左右。

交配后精子到达输卵管受精部位的时间为20～60分钟，等待新鲜的卵子。

小鼠的排卵数因品系、个体及饲养管理等环境因素的不同而有所差异，我们在实验中常选用的昆白系小鼠排卵较多，但个体差异较大。

小鼠自然繁殖交配或超排发情交配后，如要知道是否已经交配以及体内的卵母细胞是否受精，一般是在交配的次日晨8:00时以前检查雌鼠的阴门，如见有阴门栓(小块稠桨糊样物质)，则认为已经交配，并表明卵母细胞可能受精。

环境热休克对附植前早期牛胚胎发育的影响

物遗传育种软件因此．国内从事动物遗传育种的教学、科研、产和管理人员利用ＳＳ的机会很多，大生Ａ绝多数仅用于资料的统计分析．用于亲缘性资料ＢＵＬＰ育种值估计的却末见报道现实中．些从事遗传育种有
… 张沅主编．畜育种学『１北京：国农业ｍ版社，０家Ｍ，中２１０
Ｉ１ｏｅＲＡ．Ｌｎａｄｌｆｒｔｅｐｅｉｔｎｏｒｅｉｇｖｌｅ２Ｍｒｄｉｅｒｍｏｅｓｏｈｒｄｃｉｆｂｅｄｎａｕｓｏ
维普资讯
中国奶牛・０６年第５期２０
・３－２ ຫໍສະໝຸດ 环境热休克对附植前早期牛胚胎发育的影响
杜立银田文儒，
（．１内蒙古民族大学动物科技学院，通辽０８４；．２０２２莱阳农学院动物科技学院，岛２６０）青６１９
中图分类号：８３２．６文献标识码：文章编号：０４４６（０６０ — ０３０￥２．１＋３Ｂ１０ — ２４２０）５０２ — １
母体内发育的胚胎，其存活能力在很大程度上依
赖于母体环境。在输卵管和子宫功能的生理调节受到破坏的情况下，就可能发牛胚胎的丢失或死亡。所谓的
破坏因素，丁日能是母体生理方面的内在错误，或是强加
１输卵管内产生了胚胎有害因子．２热休克会使母体生理机能发生改变，同时产生各种有害因子。其中，输卵管内产生的诸如一氧化氮自『｝ｊ基、自由基等吲它可通过脂质氧化对生物膜的液态氧，性、流动Ｉ和通透性产牛影响，并与细胞内各种分子生（质脂、白质或核酸等）蛋发生作用引起细胞损伤。研究表明，期卵裂阶段的胚胎对氧化应激非常敏感，易引起胚胎发育抑制、细胞破碎和恶化。

妊娠母猪的生产管理

妊娠母猪的生产管理一、猪胚胎生长发育规律及影响因素：1、猪胚胎生长发育规律:精子与卵子在输卵管上1/3壶腹部完成受精后形成合子。

一般情况下，猪胚胎在输卵管内停留2d左右，然后移行到子宫角内，此时猪胚胎已发育到4细胞阶段，在子宫角内游离生活5~6 d ，胚胎已达到16~32细胞（桑葚胚），受精后第10天，胚胎直径可达2~6 mm 。

第13~14天胚胎开始与子宫壁疏松附着（着床），第18天左右着床完成。

着床以前胚胎营养来源是在输卵管内靠卵子本身，在子宫角内靠子宫乳供养。

第4周左右胚胎具备与母体胎盘进行物质交换的能力，而胚胎在没有利用胎盘与母体建立交换物质的联系之前是很危险的时期，此时胚胎死亡率占受精合子的30%~40%。

胚胎前40 d 主要是组织器官的形成和发育，生长速度很慢，此时胚胎重量只有初生重的1％左右。

妊娠41~90 d ，胚胎生长速度比前40d要快一些，90 d 时胚胎重量可达550 g 左右，91 d 到出生，生长速度达到高峰。

仔猪初生重的60%~70％在此期间内生长完成。

可见妊娠后期是个关键时期，母猪的饲养管理将直接影响仔猪初生重见表3-4。

胚胎所处的时期不同，其化学成分也有所不同。

42日龄胚胎与112日龄胚胎比较，干物质增长2.1倍，粗蛋白质1.6倍，脂肪1.8倍，矿物质2.8倍，钙6.2倍，磷3.8倍，铁12.9倍。

详细资料见表3-5。

表3-4不同日龄胚胎的生长情况（李立山，2006．养猪与猪病防治）表3-5不同日龄胚胎体内化学成分（李立山，2006．养猪与猪病防治）2、影响猪胚胎生长发育因素：母猪每次发情排卵为20~30枚，而完成受精形成合子，乃至成为胚胎的仅有17~18个，但真正形成胎儿出生的却仅有10~15头。

造成这种情况的原因，主要是胚胎各时期的死亡。

统计资料表明，胚胎死亡在胎盘形成以前占受精合子的25％左右，胎盘形成以后胚胎死亡数占受精合子的12%~15%，见表3-6。

妊娠36d以内死亡的胚胎被子宫吸收了，因此见不到任何痕迹。

动物繁殖学名词解释2016最全版

A安静发情：又称隐形发情、安静排卵，是指发情时缺乏发情的外表征象，但卵巢上有卵泡的发育、成熟并排卵。

B白体：随着微血管退化，供血减少，黄体体积逐渐变小，黄体细胞的数量也显著减少，颗粒层细胞逐渐被纤维细胞所代替，黄体细胞间结缔组织侵入、增殖，最后整个黄体细胞被结缔组织所代替，形成一个斑痂，颜色变白，残留在卵巢上不返情率(non-return rate)：指配种后一定时间内,不再表现发情的母畜头数占配种母畜总头数的百分比，反映配种质量和母畜数生殖能力哺乳动物胚胎干细胞(mammalian embryonic stem cell)：又称ES细胞或EK细胞，它是从早期胚胎或胎儿中分离出来的具有发育全能性的细胞系不孕：是指母畜没有先天性的生殖机能异常而在应当生殖的时间内未能产出活的后代。

（不孕的发生原因可能来自雌雄性任何一方。

不孕可能是暂时的，经过正确地治疗可以恢复生育力）不育：泛指公母畜繁殖能力的永久性丧失【不育是无法治愈的】C次要生殖激素：与生殖活动无直接关系，但可影响机体的生长和发育及代谢机能而间接影响生殖机能，如生长激素GH、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、甲状腺激素、皮质醇、醛固酮、胰岛素、甲状旁腺激素等持久黄体：妊娠或周期黄体超过正常时限而继续保持功能（分泌孕酮）初乳:母畜分娩后最初几天（4-7天内）的乳汁，以后分泌的为常乳初情期(puberty)：公畜初次释放有受精能力的精子，并表现出完整性行为序列的年龄，即为公畜初情期；母畜初次发情和排卵的时期采精频率：是指每周内对公畜的采精次数成活率(survival rate)：一般指断奶成活率，即断奶时成活仔猪数占出生时活仔畜总数的百分率，反映母畜的泌乳力和护仔性及饲养管理成绩超数排卵（MOET）：在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有更多个卵泡同时发育，并且能够同时或准同时排出多个具有受精能力的卵子的技术，筒称“超排”山羊和牛常用促性腺激素：FSH产力:将胎儿从子宫中排出的力量，是由子宫肌和腹肌有节律的收缩共同形成的产道：包括硬产道和软产道，是分娩时胎儿由子宫内排出所经过的通道产后发情(estrus after parturition)：是指母畜分娩后出现的第一次发情产后期:胎衣排出到母体生殖器官恢复原状的持续时间产仔窝数(littles per year)：一般指猪、兔等多胎动物在一年之内产仔的窝数产羔率(lambing rate)：主要用于评定羊的繁殖力，即产活羔羊总数与分娩母羊数之比产仔间隔：母畜两次产仔间隔的平均天数。

兽医产科学-妊娠-胚胎发育及胚泡附植

一、受精卵的发育
（四）胚胎定位及间距
二、胚胎附植(1,2)
（一）概念
胚胎进入子宫，在子宫的一定位置固定，并于子宫形成组织上和机能上联系的过程。
（二）意义
胚胎附植过程是胎盘形成过程，在附植之前，胚胎所需要的营养物质来源于卵细胞质及输卵管和子宫腺体的分泌物，但是这样营养不能够支持胚胎的完全发育，如果胚泡没有及时附植，就会很快死亡。
1、胚胎前期
从合子到囊胚期-细胞团的总体积增大并不明显；
2、胚胎期（器官形成期）
从分化成三个胚层开始进入胚胎期外胚层：分化成表皮和毛发；
中胚层：分化成骨骼、肌肉、呼吸系统、血液系统、泌尿生殖系统等；
内胚层：分化成消化系统；
三、胚胎生长发育
3、胎儿期
从胚胎附植到子宫内膜上开始进入胎儿期，直到分娩排出（形成胎盘后就称为胎儿期）
兽医产科学
教学课件
妊娠
胚胎发育及胚泡附植
一、受精卵的发育
（一）卵裂（二）囊胚形成（三）胚胎从透明带中孵出（四）胚胎定位及间距
一、受卵的发育
（一）卵裂
卵裂概念
受精后单细胞合子的分裂；
桑葚胚概念
受精卵不断分裂形成一个实体的细胞团（16-32个），呈游离状态，浸泡在子宫腺分泌的子宫乳而漂浮在子宫腔内。
二、胚胎附植
（二）意义
附植后，就能形成胎盘，胚胎就能从母体血液中获得生长发育所需要的各种足够的营养物质，建立胎盘血液循环，并且使代谢产物通过母体排出体外。
二、胚胎附植
（三）附植时间
胚胎附植的完成时间在动物间差异较大，而且大多数与怀孕的长短无关；
牛-30天；马-100天；羊-40天；
三、胚胎生长发育

植物胚胎培养的意义

植物胚胎培养的意义
植物胚胎培养是指在无菌条件下，将植物的胚胎（如幼胚、成熟胚、胚珠等）接种到培养基上，使其在人工控制的环境下生长和发育的技术。

植物胚胎培养具有以下重要意义：
1. 加快育种进程：通过植物胚胎培养，可以在较短的时间内获得大量的后代，从而加快育种进程。

2. 拯救珍稀濒危植物：对于一些珍稀濒危植物，可以通过胚胎培养来拯救和保护它们。

3. 提高育种效率：通过胚胎培养，可以在较小的空间内进行大量的育种试验，从而提高育种效率。

4. 研究植物发育机制：植物胚胎培养可以为研究植物发育机制提供重要的实验材料。

5. 生产无病毒植株：通过胚胎培养，可以获得无病毒植株，从而提高植株的品质和产量。

6. 保存种质资源：通过胚胎培养，可以保存植物的种质资源，以备将来使用。

植物胚胎培养是一种重要的植物生物技术，具有广泛的应用前景和重要的意义。

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融合条件进行探索 # 影响电融合的因素主要包括：融合液的成分，脉冲强度，脉冲时程 # 我们的实验比较了克隆牛过程中改变电融合条件对附植前胚胎
"$$&($%("" 收稿，"$$&(!!(") 收修改稿（批准号：&*%&$"%$）和新疆金牛生物股份有限公司资助项目 " 国家自然科学基金联系人，： +(,-./ 0123456 7-34-# .89# -0# 03 " "
第#期
表$
电融合液类型甘露醇山梨醇
$%%" 年 # 月
+10
不同融液对体细胞融合率及重组胚发育的影响
操作卵子数量 ")# 4B 融合数 , . >）（+4 ! 1） +B （6# ! )） 3B 死亡卵数量 , . @）（ + 1 ! +）（ + ") ! #）囊胚数量 #’细胞数量 , . @） , . @）（++ ! B） "" （"1 ! 6） 00 （6" ! #） 0) （ B "1 ! 0）
第 !" 卷于培养箱中培养 ! 使用前 "# $，将细胞培养液换成胚胎培养液 %&"’((，培养箱中平衡待用 ! ! "# " $ 重构胚的体外培养活化后的重构胚放入 %&"’(( 培养液中，") * "+ 枚 , "))! -，在 +. %/# ， 01 ! +2 ，饱和湿度的培养箱中培养 ! 31 $ 后，选择分裂的胚胎移入含贴壁 %+45- , 6 鼠胎儿成纤维细胞的液滴中共培养 ! 每隔 31 $ 将培养液更换一半 ! 体外培养第 + 天，培养液中加入葡萄糖，使其终浓度达到 " 78 , 7-! 培养第 4 和第 1 天分别记录囊胚的数量! ! ! # ! % 胚胎移植于重构胚发育的第4或第1天，将形态良好的囊胚装入胚胎移植管中，每管装入 " * # 枚胚胎 ! 选择自然发情第 4 天的荷斯坦奶牛和西门牛进行子宫移植 ! 塔尔（ 9:7;<=>?）
张利生! 毕春明! 李劲松! 吴昱琪! 寇朝辉! 姜岩! " 吕自力" 王小宁" 孙青原! 陈大元!"
! # 中国科学院动物学研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室，北京 !$$$%$； " # 新疆金牛生物股份有限公司，生物科学研究院，乌鲁木齐 %&$$"’
蒋满喜!
摘要
实验比较了克隆牛过程中电融合条件的改善对附植前胚胎发育的影响 # 电融合强度为
>）操作卵子总数的百分比， @）融合总数的百分比，同列中有不同字母上标者表示差异显著（ ! E ) ! )+） ! 9F99 软件进行统计分析
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重构胚的移植和出生情况
本实验共移植 "4# 头受体牛 ! 其中，荷斯坦奶牛 4B 头，西门塔尔牛 B0 头 ! 移植 3 个月后获得妊娠 #+ 头 ! 4 个月时，妊娠 "+ 头 ! 自 #))0 年 + 月份出生首只克隆母牛犊截止到发稿为止，共有 3 头存活!
! # & # ! 用于核移植的体细胞的培养所用供核细胞来源于新疆金牛生物股份有限公司的高产荷斯坦（/("5E.D）奶牛 $ 耳朵皮肤组织用无菌生理盐水洗 9 次后充分剪碎，用 ,$ #?< 胰蛋白酶 2@ 冷消化 3# A 后，［2］描述方法经原代、传 94@ 热消化 9, ’CD，根据文献代培养后，得到耳皮肤成纤维细胞，用于核移植 $ !#&#& 取出妊娠 32 F 的雌性 !?47* ) % 小鼠胎儿，用剪刀和镊子钝性分离胎鼠皮共培养细胞的准备
的 =# 操作液中 $ 用持卵针固定卵母细胞，使其第一极体位于时钟 3# 点的位置 $ 去核针插入透明带下，吸出第一极体及其下的部分胞质，然后用注射针吸取一体细胞注入透明带下 $ ! # " # " 融合完成核移植的卵在 9&$ ?@ 预热的 =3>> 中洗 # 遍，分别放入 9&$ ?@ 预热的 6J山梨醇电融合
上第一批克隆牛的制作过程中，体细胞的融合率接近 ’$> ，但是电刺激后保持形态完好从而能够进入培养液进行培养的只占到融合总数的 %$> 左右，相当一部分重构卵都在电融合后死掉或者发生形态异
［!］常，这和它的融合条件不无关系，所以有必要对
! # ! # ! 获取卵巢从屠宰场收集性成熟的新疆“土牛” （当地的一种乳肉兼用型牛）的卵巢，放入含 !> 青、链霉素的 &JK 生理盐水中，在 ) 1 内运至实验室 # 用同样生理盐水清洗 & L ) 次 # ! # ! # # 卵丘卵母细胞复合体的抽取用 !% 号注射针抽取直径为 " L !$ ,, 大的卵泡中的卵泡液，以获取卵丘卵母细胞复合体（ADA<） # 收集包裹 & 层以上卵丘细胞的卵母细胞，放入 MIN? （含有 !&’# *% ,,8/ ; C H-(
克隆效率的提高与多种因素有关 ! 电融合是体细胞核移植生产克隆动物中一个关键环节 ! 电融合是一个较为复杂的生物物理学变化过程，其原理是：细胞膜的通透性在外加直流电脉冲方波的作用下发生改变，形成许多小孔洞，这些孔洞保留一定时间融合成为大的穿孔 ! 如果两个紧密接触的细胞膜发生穿孔和融合，则导致细胞质交流，最终合为一体 ! 细胞核移植技术根据这一原理完成供受体细胞的重建过程 !
%
讨论
克隆效率一直是动物克隆中首先考虑的问题 !
$ 结果
$ "! 不同的电场强度及电脉冲时程对体细胞融合率及重组胚发育的影响表 " 示 3 种融合方案对融合率和囊胚发育率都无显著差异，但是囊胚发育率以方案 % 最高 ! 融合后重构胚的死亡率以方案 ( 最高，比较可见到显著差异 !
表!
融合方案 ( 5 % D
胰酶消化贴壁细胞，并将消化下来的细胞反复吹打成单个细胞的悬液，保存于 6=H= ) ;3# （ GI7!1）中待用 $ ［ 2］：将 ! #" # & 核的移植核移植的方法见文献（ !7） ="期卵母细胞置于含4 $ ?! : ) ’*细胞松弛素 7
!#$# !
!?47* ) % 鼠胎儿成纤维细胞消化下来，吹散成细胞悬液，在平皿中做成 3,,! * 的液滴，覆盖石蜡油，
!)$ : ; ,,， !$! < ; 次时的效率要较 !$$ : ; ,,，"$! < ; 次和 !%$ : ; ,,，!$! < ; 次时高，可以降低融合后重构胚死亡率，提高克隆牛囊胚发育率 # 施加直流电脉冲前先给予 = : 交流电场预处理数秒钟，然后在电极之间通以两个直流脉冲（!)$ : ; ,,，!$! 与不用交流电预处理对融合率和 < ; 次，间隔 $ # ! <）重构胚的发育率无显著差异 # 另外实验比较了甘露醇和山梨醇两种融合液对融合及重构胚发育的影响，结果表明囊胚发育率差异不显著，但山梨醇较甘露醇融合液更容易操作 # 实验生出的 ) 头克隆牛存活至今 # 关键词
第 !" 卷
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克隆牛过程中电融合条件对附植前胚胎发育的影响 !
肤，充分剪碎后按上述方法进行培养传代 $ !#" !#"#! 核移植程序供体细胞的准备培养 9 B 4 代的细胞作为
核移植的供体细胞 $ 细胞生长至 &,< B >,< 时，将培养液换成含 , $ ?< ;!8 的饥饿培养液，血清饥饿 #
［?］ B ? F，诱导细胞进入 G, 期 $ 核移植前，用, $ #?<
［%］液（6J山梨醇 ,$#? ’(" ) *，醋酸钙 ,$3 ’’(" ) *，醋酸镁, $ ? ’’(" ) *， /KLK5 , $ ? ’’(" ) *， 78M 3 ’: ) ’*）或［#］甘露醇融合液（甘露醇 , $ #4 ’(" ) *， /KLK5 , $ ? 中平 ’’(" ) *，!.!"# , $ ,? ’’(" ) *，=:812 , $ 3 ’’(" ) *）
克隆牛核移植电融合
自“多莉”羊诞生后，体细胞核移植技术成为了当前生命科学研究领域的一个热门话题 # 但是目前克隆技术的效率仍然很低 # 融合是由体细胞核移植生产克隆动物的一个关键步骤，对融合条件进行优化会提高成功生产克隆牛的效率，同时我们也对在体外成熟的卵母细胞因电刺激所发生的物理化学反应有进一步的了解 # 由于电融合对细胞的毒性小，
衡 3 B # ’CD，移入电融合槽中，拨动卵，使体细胞平行 $ 与卵母细胞的接触面与两电极（间距 3 ’’）融合的操作分为以下 2 种方案：（ 3&, N ) ’’， M：在电极之间通以两个直流脉冲； 3,! 5 ) 次，间隔 , $ 3 5）（ 3,, N ) ’’， 7：在电极之间通以两个直流脉冲； #,! 5 ) 次，间隔 , $ 3 5）（ 32, N ) ’’， !：在电极之间通以两个直流脉冲； 3,! 5 ) 次，间隔 , $ 3 5） 6：施加直流电脉冲前先给予 ? N 交流电场预处理数秒钟，然后在电极之间通以两个直流脉冲（32, N ) ’’，3,! 5 ) 次，间隔 , $ 3 5） $ 融合操作后的卵子移入 =3>> 中洗 9 遍，置于覆盖石蜡油的 =3>> 中，于 !1# 培养箱中培养 $ 9, ’CD后，体视显微镜下检查融合情况 $ ! # " # $ 重构胚的活化采用化学方法对融合后的重构胚进行活化 $ 重构胚在 =3>> 中培养 #2 （ A 从 !1!5 放入成熟培养液开始计时）后开始活化 $ 具体步骤是：重构胚在含 ?! ’(" ) * M#93&4 的 !O3JMM 培养液中作用 2 ’CD，用 !O3JMM 培养液洗 9 遍后，移入含（ !/P）Q 9 ! 3,! : ) ’* 放线菌酮 : ) ’* 细胞松弛素 6 （!6）的 !O3JMM 培养液中 3 A $ 然后用 !O3JMM 培养液洗 9 遍，移入含 3,! : ) ’* !/P 的 !O3JMM 培养液中作用 2 A，取出重构胚，用 !O3JMM 培养液充分清洗后，于 !O3JMM 培养液中进行体外培养 $ !#$ 重构胚的体外培养共培养液滴的准备共培养前一天，将