植物生理学实验报告植物组织中可溶性蛋白和MDA的测定

实验19植物组织中可溶性蛋白质含量的测定Ⅰ 考马斯亮蓝 G – 250 染色法一、原理考马斯亮蓝 G – 250 （ Coomassie brilliant blue ， G-250 ）法是利用蛋白质–染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。

此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm ，通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约 2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定 1 h ，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。

此法灵敏度高（比 Lowry 法灵敏 4 倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。

其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料植物材料。

（二）试剂1. 标准蛋白质溶液（ 100 μg ／ mL 牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白 25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液 40 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL 即可。

2. 考马斯亮蓝试剂：称取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250 ，溶于 50 mL 90 ％乙醇中，加入 100 mL 85 ％（ W ／ V ）的磷酸，再用蒸馏水定容到 1000 mL ，贮于棕色瓶中。

常温下可保存一个月。

（三）仪器设备分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。

三、实验步骤1. 标准曲线的绘制取 6 支试管，按表 26–1 加入试剂，摇匀，向各管中加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置 5 min 左右，以 0 号试管为空白对照，在 595 nm 下比色测定吸光度。

一、实验目的和要求：（1）了解掌握可MDA测定的原理和方法。

（2）掌握用离心机、分光光度计、恒温水浴箱的基本方法和步骤。

二、实验内容和原理：内容：植物组织MDA的测定原理：植物叶片衰老过程中，自由基代谢失调并在体内积累（MDA:膜脂过氧化的产物之一）。

MDA测定：MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物，该复合物最大吸收峰在532nm处;最小吸收峰600nm处，消光系数为155 (mM)-1 cm-1MDA含量计算公式MDA（mM）=(A532-A600)/(155*L) L为比色杯厚度（cm）蔗糖对MBA-TBA反应有干扰，可用下式消除：MDA(µM)=6.45(A532-A600)-0.56A450三、主要仪器设备和材料试剂：材料：可溶性蛋白测定时的上清液（新叶、老叶）各1mL仪器：离心机、分光光度计、恒温水浴箱器材：试管架、离心管、移液管、洗耳球、托盘天平试剂：磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8）、TBA与TCA混合液四、操作方法与实验步骤：取出上清液，各加入TBA与TCA混合液4.0mL，92ºC水浴保温30min，空白管： 1mL Pi-buffer +TBA与TCA混合液 4.0ml （ 92ºC水浴30min）冷却后，平衡，离心5min;10000rpm，测定A532, A450和A600五、实验数据记录和处理：新叶A532：0.201、A450：0.714、A600：0.033，老叶A532：0.309、A450：1.523、A600：0.060，六、实验结果与分析：实验结果：新叶：MDA（mM）=(A532-A600)/(155*L)=（0.1843-0.0227）/（155*1）=0.00108 mMMDA(µM)=6.45(A532-A600)-0.56A450=6.45（0.1843-0.0227）-0.56*0.699=0.684µM老叶：MDA（mM）=(A532-A600)/(155*L)=（0.4403-0.0967）/（155*1）=0.00161mMMDA(µM)=6.45(A532-A600)-0.56A450=6.45（0.4403-0.0967）-0.56*1.187=0.753µM实验分析：1、从实验结果上来看，新叶的MDA含量明显低于老叶MDA含量，这是自由基代谢失调并在体内积累造成的。

一、实验目的和要求：（1）了解掌握可溶性蛋白测定的方法。

（2）掌握用离心机、分光光度计的基本方法和步骤。

二、实验内容和原理：内容：植物组织中可溶性蛋白的测定原理：植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。

可溶性蛋白测定：缓冲液提取后可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。

在595nm 处有最大吸收峰。

02468100.000.050.100.150.200.250.300.35Protein content ( g)A b s o r b a n c e 三、主要仪器设备和材料试剂：材料：叶龄差异明显的叶片（新叶、老叶）仪器：离心机、分光光度计器材：试管架、离心管、移液管、洗耳球、研钵、电子天平、托盘天平试剂：磷酸缓冲液（50mmol ，pH 值为7.8）、考马斯亮蓝四、操作方法与实验步骤：称叶龄差异明显的叶片各1.00g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol ，pH 值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10 000g 离心力作用下（4度）离心15min ，取上清液1.0ml 于7ml 离心管中，冰箱保存。

剩余上清液取20-50ul 加入5ml 考马斯亮蓝，595nm 比色。

五、实验数据记录和处理：取595nm的OD值平均后可得，新叶1.125，老叶0.423上清液总体积：新叶5.0ml，老叶5.0ml将595nmOD值带入标准曲线Y=-0.00381+0.032029*X得到新叶蛋白质质量=(1.125+0.00381)/0.032029=35.24μg老叶蛋白质质量=(0.423+0.00381)/0.032029=13.32μg可溶性蛋白含量(μg/g.FW)=(m*v/v’)/W新叶可溶性蛋白含量=(35.24*5/0.05)/1.00=3524.00μg/g.FW老叶可溶性蛋白含量=(13.32*5/0.05)/1.00=1332.00μg/g.FW六、实验结果与分析：实验分析：新老叶可溶性蛋白含量有明显的差异，新叶的可溶性蛋白含量明显高于老叶可溶性蛋白含量，由此可知：植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少。

一.实验内容实验1 MDA(丙二醛)含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯） 0.25%硫代巴妥酸 (纯)实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-250 95%乙醇 85%磷酸实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0） 30% H2O2实验五：Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：ASA（分子量167.12） (乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2 PBS (pH7.0) 30%H2O实验6： ASA(维生素C)含量测定偏磷酸 95%乙醇磷酸 4% 2,2-二联吡啶 FeCl3（或FeCl3·6H2O）实验7：GSH(谷胱甘肽, 媚力肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：NaH2PO4·2H2O DTNB（二硫代硝基苯甲酸） PBS (PH6.8)实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸 85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。

80%丙酮试验9：GR活性测定试验10：过氧化氢含量测定。

三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二．酶液和母液提取1. 酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1% (m/v) 聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/L EDTANa2或EDTA)，也可为（内含2% (m/v)PVP），0.2mmol/L EDTA Na2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）2. ASA . GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）↓4℃冷冻15000g离心20分钟↓上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存）2．ASA . GSH母液提取：0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液↓4℃冷冻14000g离心10分钟↓上清液即为母液（5℃下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）酶液提取所需试剂：PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBSEDTA-Na 2 : 0.1mmol/L (37.2mg EDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBSPBS（缓冲液）配制方法：① Na2HPO4·12H2O ② NaH2PO4·2H2O取① 71.64g，蒸馏水定容至1L，取② 31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用PH=7.8 取① 91.5ml+② 8.5ml=100ml (浓度0.2mol/L)需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml （0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100 ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）三．实验步骤实验1：MDA含量测定1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）称10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸 (纯) 称0.25g用10%TCA定容至100ml（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，加入 4ml 0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液↓摇匀95℃加热15分钟↓快速冷却3000g离心15分钟↓取上清测定 OD532，OD600，OD450值↓按公式求 MDA浓度=6.45×（OD532-OD600）-0.56OD450 (μmol/L)可溶性糖浓度=11.71×OD450 (mmol/L)最后计算 MDA含量（μmol/g FW）= [4×（MDA浓度x）×10-3/0.1]同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW）= 4×（可溶性糖浓度χ）×10-3/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MDA含量测定的改进1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。

一.实验内容实验1 MDA(丙二醛)含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯） 0.25%硫代巴妥酸 (纯)实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-250 95%乙醇 85%磷酸实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0） 30% H2O2实验五：Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：ASA（分子量167.12） (乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2 PBS (pH7.0) 30%H2O实验6： ASA(维生素C)含量测定偏磷酸 95%乙醇磷酸 4% 2,2-二联吡啶 FeCl3（或FeCl3·6H2O）实验7：GSH(谷胱甘肽, 媚力肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：NaH2PO4·2H2O DTNB（二硫代硝基苯甲酸） PBS (PH6.8)实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸 85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。

80%丙酮试验9：GR活性测定试验10：过氧化氢含量测定。

三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二．酶液和母液提取1. 酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1% (m/v) 聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/L EDTANa2或EDTA)，也可为（内含2% (m/v)PVP），0.2mmol/L EDTA Na2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）2. ASA . GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）↓4℃冷冻15000g离心20分钟↓上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存）2．ASA . GSH母液提取：0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液↓4℃冷冻14000g离心10分钟↓上清液即为母液（5℃下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）酶液提取所需试剂：PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBSEDTA-Na 2 : 0.1mmol/L (37.2mg EDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBSPBS（缓冲液）配制方法：① Na2HPO4·12H2O ② NaH2PO4·2H2O取① 71.64g，蒸馏水定容至1L，取② 31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用PH=7.8 取① 91.5ml+② 8.5ml=100ml (浓度0.2mol/L)需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml （0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100 ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）三．实验步骤实验1：MDA含量测定1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）称10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸 (纯) 称0.25g用10%TCA定容至100ml（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，加入 4ml 0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液↓摇匀95℃加热15分钟↓快速冷却3000g离心15分钟↓取上清测定 OD532，OD600，OD450值↓按公式求 MDA浓度=6.45×（OD532-OD600）-0.56OD450 (μmol/L)可溶性糖浓度=11.71×OD450 (mmol/L)最后计算 MDA含量（μmol/g FW）= [4×（MDA浓度x）×10-3/0.1]同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW）= 4×（可溶性糖浓度χ）×10-3/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MDA含量测定的改进1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。

实验七植物组织中可溶性蛋白质、可溶性糖含量的测定I、植物组织中可溶性蛋白质的测定一、原理由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm 波长处。

在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm 与其浓度呈正比关系，可作定量测定。

二、材料、仪器设备及试剂（一）材料植物叶片（二）仪器设备紫外分光光度计、分析天平、离心机、恒温水浴锅、研钵、移液管等（三）试剂 0.1 mol/L pH7.0 磷酸液三、实验步骤1．样品中蛋白质的提取称取植物叶片0.5~1.0 g放入研钵中，加入2mL 0.1 mol/L的磷酸缓冲液，研磨成匀浆，转移至15mL 离心管中，再用6mL磷酸缓冲液分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在室温（20~25℃）下放置05~1.0h,以充分提取，然后在4000 r/min离心10 min，将上清液转入25 mL容量瓶中，并以磷酸缓冲液定容至刻度，即得待测样品提取液。

2．样品中蛋白质含量的测定取适量稀释后的蛋白质提取液，在紫外分光光度计上，分别于280 nm和260 nm波长条件下（以磷酸缓冲液为空白对照），测定提取液的吸收值，代入公式即可计算出样品中蛋白质的含量。

四、结果计算样品中蛋白质的浓度（mg/mL）=（1.45A280—0.74A260）×稀释倍数式中： 1.45 和 0.74 ——校正值。

A 280 ——蛋白质溶液在 280 nm 处的吸光度。

A 260 ——蛋白质溶液在 260 nm 处的吸光度Ⅱ、植物组织中可溶性糖的测定--蒽酮法一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。

该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。

植物组织中SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定1. CAT反应液的配制：O.1M H2O2溶液: 0.568ml 30%H2O2定容至100ml。

0.1M PH7.0磷酸缓冲液：97.5毫升A液+152.5毫升B液。

定容至500毫升。

0.1M的H2O2 5毫升+0.1M的pH7.0的磷酸缓冲液20毫升(即按1:4的比例)混勺，即为CAT反应液。

2. CAT的测定:0.1毫升（或50微升）酶液+2.5毫升反应液，240nm下比色，每隔1分钟读数1次，共读数3次。

3. 结果计算:CAT( 240*/0.05/0.5=1. MDA反应液的配置:0.6克TBA(硫代巴比妥酸)，先用少量1M NaOH溶解，用10%TCA (三氯乙酸) 定容至100毫升。

2. MDA的测定:1毫升酶液+2毫升0.6%的TBA，封口沸水浴15分钟，迅速冷却后再离心，取上清液，在600、532、450nm 三个波长下比色。

3.结果计算:MDA(umol/gfw )=(6.45*(D532*D600)-0.56D450)*0.015/W或(6.45*(D532*D600)-0.56D450)*0.03/W七、可洛性蛋白的制定1. 反应液配制:0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，过滤。

2. 测定:20微升酶液+3毫升G-250放置2分钟，595纳米比色，同时做空白(20微升缓冲液+3毫升G-250)3. 结果计算:可溶性蛋白（mg/Gfw)=(C*V/Va）/W八、脯氨酸含量的测定1. 试剂配制:0.6克黄基水杨酸，定容至200毫升。

酸性茚三酮(现配)：3.75克茚三酮+90毫开冰醋酸+36毫升蒸馆水2. 测定:0.3克叶片，加入5毫升磺基水杨酸，加盖，沸水浴10分钟，过滤，吸取滤液2豪升（同时作空白，吸取2毫升蒸馏水），2毫升冰醋酸和3毫升酸性茚三酮，沸水浴40分钟，冷却，加入5毫升甲苯，充分振荡，静置分层，取上层甲苯溶液于比色皿中，520纳米下比色。

一、实验目的和要求：（1）了解掌握可溶性蛋白测定的方法。

（2）掌握用离心机、分光光度计的基本方法和步骤。

二、实验内容和原理：内容：植物组织中可溶性蛋白的测定原理：植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。

可溶性蛋白测定：缓冲液提取后可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。

在595nm 处有最大吸收峰。

02468100.000.050.100.150.200.250.300.35Protein content ( g)A b s o r b a n c e 三、主要仪器设备和材料试剂：材料：叶龄差异明显的叶片（新叶、老叶）仪器：离心机、分光光度计器材：试管架、离心管、移液管、洗耳球、研钵、电子天平、托盘天平试剂：磷酸缓冲液（50mmol ，pH 值为7.8）、考马斯亮蓝四、操作方法与实验步骤：称叶龄差异明显的叶片各1.00g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol ，pH 值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10 000g 离心力作用下（4度）离心15min ，取上清液1.0ml 于7ml 离心管中，冰箱保存。

剩余上清液取20-50ul 加入5ml 考马斯亮蓝，595nm 比色。

五、实验数据记录和处理：取595nm的OD值平均后可得，新叶1.125，老叶0.423上清液总体积：新叶5.0ml，老叶5.0ml将595nmOD值带入标准曲线Y=-0.00381+0.032029*X得到新叶蛋白质质量=(1.125+0.00381)/0.032029=35.24μg老叶蛋白质质量=(0.423+0.00381)/0.032029=13.32μg可溶性蛋白含量(μg/g.FW)=(m*v/v’)/W新叶可溶性蛋白含量=(35.24*5/0.05)/1.00=3524.00μg/g.FW老叶可溶性蛋白含量=(13.32*5/0.05)/1.00=1332.00μg/g.FW六、实验结果与分析：实验分析：新老叶可溶性蛋白含量有明显的差异，新叶的可溶性蛋白含量明显高于老叶可溶性蛋白含量，由此可知：植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少。

实验报告课程名称： 植物生理学及实验（甲） 实验类型： 实验名称： 植物衰老生理姓名： 专业： 学号： 同组学生姓名： 指导老师： 实验地点： 实验日期：一、实验目的和要求二、实验内容和原理三、主要仪器设备 四、操作方法与实验步骤五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析七、讨论、心得一、实验目的和要求1、熟悉提取植物组织中蛋白质的一般办法2、掌握MDA 、SOD 测定的原理及方法3、掌握离心机、分光光度计等仪器的使用方法4、了解植物衰老过程中，物质含量的变化二、实验内容和原理材料：新老青菜叶片内容：植物组织蛋白质、丙二醛含量测定 原理： 1、蛋白质测定考马斯亮蓝 G--250 ( Coomassie brilliant blue ，G-250 )法是利用蛋白质--染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，装 订 线在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。

此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm ，通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约 2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定 1 h，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。

此法灵敏度高(比 Lowry 法灵敏 4 倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。

其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

2、丙二醛含量测定MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物。

该复合物最大吸收峰在532nm处;最小吸收峰600nm处，消光系数为155 (mM)-1 cm-13、SOD活性测定SOD是含金属辅基的酶，它催化以下反应：02 - +02 - + 2H+ H2 02 +02四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法：核黄素受光照产生的能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最大吸收，而SOD能清除, 抑制甲腙的产生使吸收减小。

MDA 含量测定硫代巴比妥酸(TBA)法(候福林．植物生理学实验教程[M]．北京：科学出版社．2004．91)(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．261-263)一、原理植物器官衰老时，或在逆境条件下，往往发生膜质过氧化作用，丙二醛(malondialdehyde ，MDA)是其产物之一，通常用它作为膜质过氧化指标，表示细胞膜质过氧化程度和植物逆境条件反应的强弱。

在酸性和高温条件下，丙二醛和硫代巴比妥酸反应生成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm 处有最大吸收峰。

但该反应受到可溶性糖和蛋白的极大干扰，可溶性糖和蛋白的吸收波长分别在450nm 和600nm 处。

植物组织器官的衰老总是伴随着细胞内膜的破坏，表现为细胞内的电解质大量渗漏出来，研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞中(特别是线粒体和叶绿体)产生的生物自由基(如O 2.-、OH .、1O 2等)使膜脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用而造成的。

膜脂过氧化作用产生的自由基，它不仅能够连续诱发膜脂过氧化作用，而且还可以使蛋白质脱H +而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合。

从而使细胞膜变性，最终导致细胞损伤、衰老或死亡。

膜脂过氧化作用可能以下列进行：O OH O O H H OO H丙二醛 H H O O HN N H O O S HNN H HO N H NO HS O S OH+2100℃硫代巴比妥酸(TBA) 丙二醛 5,5’-亚丙烯苯-双硫代巴比妥酸(双TBA)(三甲川) MDA 在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成532nm 波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物，该复合物的吸光系数为155[mmol/(L·cm)]，并在600nm 波长处有最小光吸收。

可按公式：A532-A600=155000*C*L(1)算出MDA浓度C(µmol/L)，进一步算出单位重量鲜重组织中MDA含量C(µmol/g)。

叶绿素，SOD,MDA,POD,硝酸还原酶等测定方法1 叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。

称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml 浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36）也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.88D649Cb=24.96D649-7.32D665Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/2452 抗氧化酶活性的定：（2.5g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。

取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。

2.1丙二醛（MDA）的测定：20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）；0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。

植物组织MDA 含量测定一、目的要求1．掌握植物组织MDA 含量测定的原理及具体测量步骤；2．深化理解MDA 与逆境和衰老的关系，理解植物组织MDA 含量测定的意义； 3．了解膜脂过氧化、氧自由基和MDA 形成的关系；4．能够根据待测材料的具体情况设计实验步骤测定MDA 含量； 5．学习分光光度计，低温离心机等仪器的使用方法。

二、实验原理植物遭受逆境胁迫或衰老时，体内会发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低，活性氧平衡失调及内源激素平衡失调等。

活性氧代谢失调直接导致植物体内活性氧的大量积累，从而引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。

膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。

其中丙二醛（Malondialdehyde ，MDA ）是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。

因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA 含量是一个常用指标，可通过测定MDA 了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。

MDA 在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA ）反应，产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（Trimet —nine ），又名三甲川，该物质在532nm 处有最大光吸收，在600nm 处有最小光吸收。

由于TBA 也可与其它物质反应，并在532nm 处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，同时测定600nm 下的吸光度，利用532nm 与600nm 下的吸光度的差值计算MDA 的浓度。

即：A 532－A 600＝ε·C ·L式中，A 532和A 600分别表示532nm 和600nm 处的吸光度值，C 是MDA 浓度，L 为比色杯厚度，ε=155L·mmol -1·cm -1。

+100 COH N SN HOO OHHH NH SNHO OH OOHNN HS2OTBA MDA 3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮需要指出的是，植物组织中糖类物质可能对MDA-TBA 反应有干扰作用。

MDA 含量测定硫代巴比妥酸(TBA)法(候福林．植物生理学实验教程[M]．北京：科学出版社．2004．91)(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．261-263)一、原理植物器官衰老时，或在逆境条件下，往往发生膜质过氧化作用，丙二醛(malondialdehyde ，MDA)是其产物之一，通常用它作为膜质过氧化指标，表示细胞膜质过氧化程度和植物逆境条件反应的强弱。

在酸性和高温条件下，丙二醛和硫代巴比妥酸反应生成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm 处有最大吸收峰。

但该反应受到可溶性糖和蛋白的极大干扰，可溶性糖和蛋白的吸收波长分别在450nm 和600nm 处。

植物组织器官的衰老总是伴随着细胞内膜的破坏，表现为细胞内的电解质大量渗漏出来，研究结果表明，细胞衰老过程中膜的破坏是由细胞中(特别是线粒体和叶绿体)产生的生物自由基(如O 2.-、OH .、1O 2等)使膜脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用而造成的。

膜脂过氧化作用产生的自由基，它不仅能够连续诱发膜脂过氧化作用，而且还可以使蛋白质脱H +而产生蛋白质自由基，使蛋白质分子发生链式聚合。

从而使细胞膜变性，最终导致细胞损伤、衰老或死亡。

膜脂过氧化作用可能以下列进行：O OH O O H H OO H丙二醛 H H O O HN N H O O S HNN H HO N H NO HS O S OH+2100℃硫代巴比妥酸(TBA) 丙二醛 5,5’-亚丙烯苯-双硫代巴比妥酸(双TBA)(三甲川) MDA 在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成532nm 波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物，该复合物的吸光系数为155[mmol/(L·cm)]，并在600nm 波长处有最小光吸收。

可按公式：A532-A600=155000*C*L(1)算出MDA浓度C(µmol/L)，进一步算出单位重量鲜重组织中MDA含量C(µmol/g)。