免疫组化(IHC)实验具体步骤及说明

免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明

一、试剂和溶液

乙醇: 无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇抗原修复液: 0.01M 的柠檬酸钠缓冲液：58.82g 柠檬酸三钠及7.56g 柠檬酸溶于200ml 纯水，调pH 至6.0，纯水1:100 稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9 稀释10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液: 1×PBS：纯水稀释10× PBS；

1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 二抗，酶标亲和素UltraTek HRP，DAB 显色试剂盒：Cat. KT1002a 抗体稀释液：3%BSA-PBS 0.5%盐酸-乙醇：0.5～1%盐酸，95.0-95.5%乙醇苏木素：苏木精2g 溶于250ml 无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml 纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠0.2g 和冰醋酸20ml

二、实验步骤

1.组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min 或者65℃过夜；

2.脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10 分钟；

3.水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；

4.洗涤：自来水冲洗1 次，PBS 浸泡3min；

5.抗原修复：放入稀释100 倍的柠檬酸盐缓冲液(pH

6.0) 中，高压锅煮沸

10min，常温冷却30min；

6.洗涤：纯水浸泡2 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；

7.灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；

8.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；

9.封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；

10.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；

11.一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。

12.洗涤：PBST 浸泡3 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；

13.加入适当体积生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 的二抗（KT1002a

Reagent B），37℃湿盒孵育10min；

14.洗涤：PBST 浸泡3 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；

15.加入适当体积酶标亲和素UltraTek HRP（KT1002a Reagent C）, 37℃湿盒孵

育10min；

16.洗涤：PBST 浸泡3 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；

17.显色：滴加适量DAB 显色液(KT1003a)至切片上，室温显色1~5min，自来

水冲洗；

18.复染：苏木素染色5min，蒸馏水冲洗5min；

19.分化：0.5%盐酸乙醇混合液中分化，自来水冲洗3-4 次，PBS 中浸泡10-

20 秒返蓝，自来水冲洗2 次。

20.脱水：经过70%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，无水乙醇浸泡，每次5min；

21.透明：二甲苯浸泡2 次，每次10-15min；

22.封片：晾干后加中性树胶，盖玻片封片；

23.结果：显微镜观察，记录结果