小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告 山东大学

山东大学实验报告2011年3月30日姓名张行润系年级 2009级生科4班学号 200900140177 同组者张少华科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号 105一、实验目的了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。

学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。

二、实验原理(一)细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。

要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。

二是严格控制无菌条件。

(二)细胞死活鉴定死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。

染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。

不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。

染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。

死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。

常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。

台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。

所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。

甲基蓝有类似的染色机理。

植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。

死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。

美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。

细胞的原代培养实验报告一、实验目的细胞原代培养是指从机体取出细胞、组织或器官后，通过机械或酶学方法分散成单个细胞，在体外进行培养的过程。

本次实验的目的是掌握细胞原代培养的基本技术和方法，观察细胞在体外的生长和形态变化，为进一步的细胞生物学研究奠定基础。

二、实验原理细胞原代培养的关键在于保持细胞的活性和完整性，同时提供适宜的生长环境。

通常采用酶消化法或组织块培养法来获取单细胞或细胞团。

在培养过程中，细胞需要充足的营养物质、适宜的温度、pH 值和气体环境，以促进细胞的生长和分裂。

三、实验材料1、实验动物：新生小鼠2、试剂和培养基：DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA、青霉素链霉素溶液、PBS 缓冲液等3、实验器材：超净工作台、CO₂培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器、培养瓶、培养皿、手术器械等四、实验步骤1、取材处死新生小鼠，用 75%酒精消毒其腹部皮肤。

用手术剪剪开腹部皮肤和肌肉，取出肝脏组织，置于预冷的 PBS缓冲液中。

2、组织处理将肝脏组织转移至培养皿中，用 PBS 缓冲液冲洗 2-3 次，去除血液和杂质。

用眼科剪将组织剪成 1-2mm³的小块。

3、酶消化将组织小块转移至离心管中，加入适量的胰蛋白酶EDTA 溶液，置于 37℃水浴中消化 15-20 分钟，期间每隔 5 分钟轻轻振荡一次。

消化结束后，加入等量的含血清的培养基终止消化，用移液器轻轻吹打制成细胞悬液。

4、细胞过滤将细胞悬液通过 200 目滤网过滤，去除未消化的组织块和细胞团。

5、细胞计数和接种吸取少量细胞悬液，加入台盼蓝染液，在显微镜下计数活细胞数。

根据细胞计数结果，将细胞以适当的密度接种于培养瓶或培养皿中，置于 CO₂培养箱中培养。

6、培养和观察培养 24 小时后，在倒置显微镜下观察细胞的贴壁情况。

每隔 2-3 天更换一次培养基，观察细胞的生长和形态变化。

五、实验结果1、细胞贴壁情况培养 24 小时后，大部分细胞已贴壁，呈圆形或多边形，贴壁细胞周围有光晕。

⼩⿏脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-⼭东⼤学⼩⿏脾脏细胞原代培养及观察计数【实验⽬的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体⽅法，并对⼩⿏脾细胞进⾏原代培养；2.掌握⽆菌操作的具体过程及⽆菌操作台的使⽤；3.学习掌握染⾊法鉴别细胞的⽣死状态的原理及⽅法；4.学习使⽤⾎球计数板对细胞总数及活细胞数进⾏计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在⽆菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体的⽣理环境，使离体的细胞在体外⽣长和繁殖，并且维持其结构和功能的⼀种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在⽆菌条件下，⽤胰蛋⽩酶消化或机械分散等⽅法，将动物组织分散成单个细胞开始⾸次培养长出单层细胞的⽅法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞⽣长增殖达到⼀定密度，形成致密的单层细胞时，⽤胰蛋⽩酶将细胞消化分散成单细胞，从⼀个容器中以1：2或其他⽐例转移到另⼀个容器中扩⼤培养的⽅法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

⾼等⽣物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某⼀群细胞在体的功能活动是⼗分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进⾏观察和研究，则要⽅便和简单得多。

被培养的动物细胞是⾮常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进⾏研究可以帮助⼈类揭开⽣、⽼、病、死的规律，探索优⽣、抗衰⽼和防治各种疾病的途径和机制，也可以⼈为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于⼈类健康长寿的⽅向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分⼦机制⾮常重要的实验⼿段，被⼴泛应⽤于医学、⽣物技术、基因⼯程等研究领域。

细胞培养的意义:具有其他⽣物技术⽆可⽐拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因⼦分析；便于⼈们直接对细胞结构、细胞⽣长及发育等过程的观察；在⽣物学的各个领域（如分⼦⽣物学、细胞⽣物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被⼴泛应⽤。

细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有⼀定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体的状况；细胞培养得到的产物少。

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。

被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。

细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。

细胞生物学实验报告题目：小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科三班时间：2011/5/26一、【实验目的】1、了解原代细胞培养的基本方法及操作过程，初步掌握无菌操作的方法。

2、学习细胞计数的方法。

3、学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。

二、【实验材料】1．实验仪器：解剖刀、解剖镊、解剖盘、无菌培养皿、滴管、“L”形针头、Eppendorf 管、塑料培养皿、移液枪、离心机、试管及试管架、血球计数板、显微镜、标记笔、超净工作台、CO2培养箱等2．实验试剂：PBS液、台盼蓝染液，75%酒精、生理盐水3．材料：小白鼠三、【实验原理】1．细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获首取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长和繁殖。

细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。

二是严格控制无菌条件。

细胞培养技术目前已经被广泛地应用于生物学各个领域。

如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学以及病毒学等。

2．细胞死活鉴定。

常用细胞死活鉴定方法有台盼蓝法：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色呈蓝色。

而活细胞能阻止染料进入细胞内，呈无色。

故可以鉴别死细胞与活细胞。

本次实验即采用此方法。

伊红Y 法：细胞悬液与3倍量的0.15%伊红染液混合，2min后制片镜检，死细胞被染成红色而活细胞呈无色。

3．细胞计数：血球计数板（如图1所示）是一块特制的厚载玻片，载玻片上由4条槽而构成3个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网，每个方格网共分9大格，其中的一大格即为计数室。

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数崔文强201300140012 2015.4.7 【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。

被培养的动物胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞培养的意义具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验背景：一、细胞培养的基本条件：1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器4.细胞保存条件：液氮罐1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。

净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

3.CO2培养箱：CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。

使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

②保持培养箱内空气干净。

定期消毒（90 ℃，14 h)。

③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。

三、细胞培养用液的配制：1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4 0.20加水至1000 ml3.消化液：①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。

③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。

用滤器过滤除菌。

④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。

⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用4.培养基：培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。

①天然培养基：天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。

小鼠脾细胞原代培养,死活细胞鉴定山东大学实验报告山东大学实验报告 2013年6月8日姓名陈少坤系年级 2011级生科2班同组者张劲松王洪善科目细胞实验题目小鼠脾细胞原代培养，死活细胞鉴定一、前言细胞培养的概念:多细胞生物的细胞可以被分离出来，然后在体外特殊培养环境中继续存活，并保持其生理、生化特性直接从生物体分离出来，在体外培养过程中尚未分裂、增殖的细胞，称为原代培养细胞。

原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，这时就成为继代培养细胞。

细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括 pH、渗透压、营养和生长因子等，已保证细胞的增殖。

细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。

细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。

它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。

二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。

超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。

细胞培养特点:大量实验材料单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基易于观察易于操作，改造活细胞必需通过控制物质进出细胞膜来保持内部生理环境的稳定性。

细胞死后，细胞膜通透性发生改变，原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。

台盘蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞膜受损或者细胞死亡后，才能进入细胞。

因此，活细胞一般不能被台盘蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。

伊红和苏木精是最常用的细胞染色剂。

山东大学实验报告山东大学实验报告二、实验目的回顾细胞培养的有关学习分离小鼠脾细胞的技术学习悬浮细胞的计数学习简单的细胞培养技术学习实验过程的详细描述及实验记录三、实验用品试剂:小鼠，70%酒精，蒸馏水， PBS, 细胞培养液，台盘蓝，伊红溶液仪器解剖盘，镊子，剪子，盖玻片，载玻片，显微镜，吸管，血细胞计数器四、实验步骤一、原代培养1.采用颈椎脱臼的方法牺牲小鼠。

2.将小鼠浸泡在 70%酒精中几分钟。

小鼠脾细胞的制备实验报告一、实验目的本实验旨在掌握从小鼠体内分离和制备脾细胞的方法，为后续的免疫学实验和细胞生物学研究提供材料。

二、实验原理脾脏是机体重要的免疫器官，富含各类免疫细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞等。

通过机械破碎和细胞筛过滤的方法，可以将脾组织分散成单细胞悬液，再经过离心、洗涤等步骤，去除杂质和红细胞，从而获得较为纯净的脾细胞。

三、实验材料与设备1、实验动物：健康成年小鼠2、主要试剂：无菌 PBS 缓冲液、红细胞裂解液、胎牛血清、培养基3、实验器材：手术器械（剪刀、镊子）、无菌培养皿、细胞筛、离心机、移液器、显微镜等四、实验步骤1、小鼠的处理提前将小鼠禁食不禁水 12 小时。

采用颈椎脱臼法处死小鼠，将其仰卧固定在解剖板上。

用 75%的酒精消毒小鼠腹部皮肤。

2、脾脏的获取在无菌条件下，沿腹部中线剪开皮肤和腹膜，暴露腹腔。

小心地分离出脾脏，避免损伤周围组织和血管。

将脾脏放入盛有少量无菌 PBS 缓冲液的培养皿中。

3、脾细胞的制备用镊子和剪刀将脾脏剪成小块，置于细胞筛上。

用注射器活塞轻轻研磨脾脏组织，使细胞通过筛网进入下方的离心管中。

加入适量 PBS 缓冲液冲洗细胞筛，收集全部细胞悬液。

4、离心和洗涤将细胞悬液离心（1500rpm，5 分钟），弃上清。

加入红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温静置 5 分钟，以裂解红细胞。

再次离心（1500rpm，5 分钟），弃上清。

用 PBS 缓冲液洗涤细胞 2-3 次，每次离心后弃上清。

5、细胞计数和培养用适量含血清的培养基重悬细胞。

取少量细胞悬液，加入台盼蓝染液，在显微镜下计数活细胞数量。

根据实验需要，将细胞调整至合适的浓度，接种于培养板或培养瓶中，置于培养箱中培养。

五、实验结果1、细胞形态观察在显微镜下观察制备的脾细胞，可见多数细胞呈圆形，大小不一，有细胞核。

细胞形态完整，无明显的破碎和损伤。

2、细胞计数结果经台盼蓝染色后，计数活细胞比例，通常应在 90%以上。

观察小鼠脾脏实验报告观察小鼠脾脏的形态和组织结构，了解其基本组织构成和功能。

实验步骤：1. 实验前准备：a. 所需实验器材：手套、手术刀、显微镜片等。

b. 所需实验物品：小鼠尸体、解剖盘、理化盐水等。

2. 实验过程：a. 将小鼠尸体放在解剖盘上，进行外部解剖。

观察小鼠的腹部，用手术刀轻轻切开腹部皮肤。

b. 将小鼠的内脏器官暴露出来，找到脾脏。

c. 将脾脏取出，放在显微镜片上，用理化盐水清洗，以去除血液和杂质。

d. 用显微镜观察脾脏的形态和组织结构，并进行描述。

实验结果：小鼠脾脏是一个椭圆形的器官，位于腹腔的左上前部，与胃相邻。

观察到脾脏表面光滑，颜色暗红，呈现出类似叶片的形态。

通过显微镜观察，可以看到脾脏由纤维结缔组织包膜包裹，包膜内有纵横交织的网状纤维和平滑肌纤维。

进一步观察脾脏切片，可以发现脾脏内部由红髓和白浆组成。

红髓部分是由红色血球聚集而成，呈现出深红色，主要负责产生和贮存红血球。

白浆部分呈现出浅红色，主要负责产生、贮存和分化白血球。

除了红髓和白浆，还可以观察到脾小体。

脾小体是脾脏的功能单位，由中央的细动脉和围绕其排列的淋巴组织组成。

细动脉在脾小体内分支，形成富集淋巴细胞的血窦，血窦内的小窦构成了纤维结缔组织和巨噬细胞，这些巨噬细胞负责清除衰老或异常的红血球和其他细胞碎片。

实验分析与结论：通过观察小鼠脾脏的形态和组织结构，可以得出以下结论：1. 小鼠脾脏是一个椭圆形的器官，位于腹腔的左上前部，与胃相邻。

2. 脾脏具有纤维结缔组织包膜，包膜内有纵横交织的网状纤维和平滑肌纤维。

3. 脾脏主要由红髓和白浆组成。

红髓部分负责产生和贮存红血球，白浆部分负责产生、贮存和分化白血球。

4. 脾小体是脾脏的功能单位，由细动脉和排列的淋巴组织构成。

血窦和小窦在脾小体中起到清除血液中异常细胞和细胞碎片的作用。

脾脏是小鼠免疫系统的重要组成部分，它在免疫应答中起到重要的作用，如清除病原体和损伤细胞，调节细胞免疫和体液免疫等。