双孢蘑菇遗传育种研究进展

食用菌学报2007.14(1):62～66收稿日期:2006210227原稿;2006202214修改稿基金项目:国家“948”项目(200424228)的部分研究内容作者简介:李　琳(1982-),女,湖南中南林业科技大学在读硕士研究生,主要从事食用菌遗传育种方面的研究,发表主笔论文1篇。

3本文通讯作者文章编号:1005-9873(2007)01-0062-05双孢蘑菇遗传育种研究进展李　琳,周国英3,刘君昂,郝　艳(湖南中南林业科技大学资源与环境学院,长沙410004)摘　要:综述了人工选择育种、杂交育种、原生质体融合育种和基因工程育种等双孢蘑菇遗传育种研究的现状及进展,并展望了上述研究领域的发展趋势。

关键词:双孢蘑菇;杂交育种;原生质体融合;基因工程;遗传标记中图分类号:S 646.110.36 文献标识码:A 双孢蘑菇(A garicus bis porus (Lange )Sing.)营养丰富,味道鲜美,是目前世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌,产量约占世界食用菌总产量的40%左右[1]。

双孢蘑菇也是我国目前最大宗的出口创汇食用菌[2,3],产品主要销往东南亚[4]、德国、加拿大、美国及东欧国家[5]。

众所周知,食用菌生产的发展很大程度上依赖于菌种,因此,筛选出抗逆性强、产量高、品质好的双孢蘑菇优良菌株对双孢蘑菇生产具有重要意义。

1　双孢蘑菇遗传育种研究现状1.1人工选择育种 人工选择育种就是人工选择自然发生的有益变异,从而获得优良菌株的方法。

1894年,康斯坦丁等首次制成蘑菇纯菌种[6];1929年,美国人Lambert 公开了用蘑菇孢子和组织培养物制种的秘密[6]。

此后,蘑菇单孢和组织培养分离技术迅速发展起来。

法国(1948年)的索米塞尔蘑菇菌株及美国(1950年)的奶白、棕色和白色等蘑菇菌株都是通过人工选择育种获得的[7,8]。

由于我国缺乏双孢蘑菇种质资源,20世纪80年代以前,我国的栽培品种如S 2176等主要是以引进菌株经人工选择育种而成的[6,9]。

1.2杂交育种 杂交育种是一种遗传物质在细胞水平上的重组过程。

20世纪70年代,冰岛的GerdaFrit sche 博士[10]开始利用蘑菇不育单孢子培养物配对、以恢复可育性为标记选育杂交菌株,于1981年首先育成纯白色蘑菇品种和米色蘑菇品种间的杂交菌株U1和U3,并在欧洲广泛使用。

我国的杂交选育是从70年代末80年代初才发展起来的。

80年代初,上海农业科学院食用菌研究所和福建轻工业研究所开始进行双孢蘑菇单孢杂交育种研究,选育出一批优良的单孢杂交菌株如闽1号,并被广泛使用[11];1987年,王贤樵、王泽生等提出双孢蘑菇杂种子一代与子二代遗传变异的酯酶同工酶模式,并育成杂交菌株As2796系列,这是我国培育的首批双孢蘑菇杂交菌株[12]。

1.3原生质体技术育种1.3.1原生质体融合原生质体融合技术是按照人们的需要,使两个不同遗传性状的细胞融合成一个新的杂种细胞,其特点是可克服远缘杂交不亲和性,扩大现有品种的遗传变异范围,为实现远缘杂交育种开辟新途径[13]。

最初的工作主要是研究双孢蘑菇原生质体的制备与再生、同核体的分离与鉴定等[14]。

随后,又对同核原生质体亲和性反应及杂交异核体F2代的农艺性状和F2代的分离与变异规律进行了研究,并建立了以菌落形态、菌丝生长速度、羧甲基纤维素酶相对活性以及酯酶同工酶电泳为手段的杂交异核体的鉴定体系[15,16]。

第1期李　琳,等:双孢蘑菇遗传育种研究进展1.3.2原生质体单核化通过原生质体技术得到的单核体称为单核原生质,这一现象称为原生质体单核化。

原生质体单核体和由孢子形成的单核体具有不同的遗传特性。

原生质体单核杂交,亲本中的优良性状可以得到稳定表达。

Anderson等利用原生质体单核杂交,从双孢蘑菇菌丝体中制备出同核原生质体,但由于再生率很低(0.1%或更低),得到的同核体比例也很低[17]。

Wessels等采用有效的溶壁酶系统,使原生质体再生率高达30%[18],并采用等电聚焦的同工酶电泳方法,有效地鉴定出同核体和异核体。

Anderson采用RFL Ps方法鉴定双孢蘑菇同核原生质体再生率时指出,同核体与异合体的比例为10%左右[19]。

1.4基因工程育种 基因工程育种是在基因水平上,以人为的方法从某一供体生物中提取所需要的基因,在离体条件下用适当的限制性核酸内切酶切割,把它与载体连接起来一并导入受体生物细胞中进行复制和表达,从而选育出新品种,可完成超远缘杂交。

1987年,Elliott等建立了双孢蘑菇基因文库[20];1991年,Challen等首次提出了双孢蘑菇转化的策略[21];同年,Royer等展望了双孢蘑菇转化系统的现状与未来[22];1993年,Kerrigan建立了包括同工酶、RFL P、RA PD、rDNA重复序列以及少量外部表型性状等多种标记的遗传连锁图,为进一步分析双孢蘑菇的遗传行为,定位、克隆有关基因提供了一个很好的参照标尺[23,24]; 1996年,Stoop等首次建立了双孢蘑菇的转化体系,为双孢蘑菇的遗传转化工作奠定了良好的基础[25];2000年,Challen等在双孢蘑菇转化技术研究中,使用原生质体筛选,获得了一些抗新潮霉素转化子;福建省轻工业研究所从1994年开始进行双孢蘑菇基因工程育种的理论探索、技术研究与育种试验,投资100多万元建立了基因工程实验室,拥有一个储存300多个野生和人工栽培双孢蘑菇菌株的种质库,其中包括耐高温、抗干泡病、抗绿霉等的优良种质,并与美国Sylvan 公司合作,初步建立起基因文库[26]。

目前,该实验室主要从事与产量、品质、抗性和耐储藏等相关的重要基因紧密连锁的分子标记的寻找、基因的克隆、表达和功能验证等研究。

1.4.1双孢蘑菇遗传标记技术研究进展探索遗传标记的目的是发现在遗传上与重要特征的决定因素密切相关的优良标记。

在双孢蘑菇遗传育种研究中,遗传标记经历了从外观形态表型标记到生理生化标记,从分子水平的同工酶到DNA分子标记如RFL P、RA PD和A FL P 等[27]。

1.4.1.1同工酶标记这是一种自然存在的、对双孢蘑菇菌株的表现型、外表及习性很少发生(或不发生)作用的标记技术,可从蛋白质水平反映出物种的遗传变异,广泛应用于不同种属、同种不同菌株的分类和鉴别以及杂交育种中亲本的选取、杂交种的鉴别等。

在同样条件下,同功酶是有效标记,而且价格便宜,不足之处就是数量不多,双孢蘑菇的同工酶标记少于10个[28]。

1.4.1.2RFL P标记RFL P标记能反映DNA水平的差异,供试菌株DNA通过酶切、电泳、Sout hern杂交产生不同长度的多态性,显示不同的电泳带型,这些带型是鉴别品系、分析类缘关系、证实遗传分离的科学证据。

Castle等人曾以RFL P为遗传标记分析双孢蘑菇及大肥菇(A g aricus bitorquis)的种间及种内多态性,并比较了栽培种与野生种之间的类缘关系[29];Loft us等利用RFL P研究双孢蘑菇栽培菌株与野生菌株之间的DNA结构差异,以证实遗传分离[30]。

1.4.1.3RA PD标记RA PD标记技术的目的是检测DNA的多态性,这是一种快速、简便、所需样品量少而又有效的分子鉴别方法,广泛应用于物种及杂交子、融合子的鉴定和遗传相关性分析。

罗信昌通过RA PD技术制成蘑菇分离物及对应子实体的指纹图谱,以分析它们之间的DNA同源性及遗传相似度,以鉴别分离物真伪[31,32];Khush则应用RA PD进行遗传亲子分析[33];曾伟等应用RA PD 技术分析了双孢蘑菇及大肥菇种内和种间多态性,进一步证实双孢蘑菇种内相似性很高,而大肥菇种内相似程度较低,同时还分析评价了两个种之间的亲缘关系,为种间杂交选材提供了理论依据[34]。

1.4.1.4A FL P标记A FL P是目前最有效的一种分子标记技术,它能有效地揭示那些在遗传变异上并不明显的物种间的遗传多样性。

与RFL P、RA PD等标记技术相比,A FL P标记获得的遗传信息更丰富稳36食　用　菌　学　报第14卷定。

李荣春应用A FL P标记技术对双孢蘑菇的20个野生菌株和5个栽培菌株的遗传多态性进行了研究,证明A FL P技术能够揭示双孢蘑菇菌株在地理分布上的特性[35]。

辜运富利用A FL P 标记技术研究了15个双孢蘑菇菌株的遗传多态性,发现双孢蘑菇在遗传关系上的差异不大,但不同菌株具有自己独特的A FL P指纹图谱,说明A FL P技术能够有效地揭示双孢蘑菇菌株之间微弱的遗传多态性[36];聚类结果表明,A FL P标记技术不仅能在一定程度上反映双孢蘑菇菌株在地理分布上的特点,也能揭示杂交育种引起的遗传变异。

1.4.2双孢蘑菇重要标记位点研究进展1.4.2.1与双孢蘑菇降解基质能力相关的标记位点一个菌株降解基质的能力直接影响到其产量和品质。

双孢蘑菇降解基质的酶类如木质素酶(漆酶等)、纤维素酶位点始终是蘑菇育种与生理生化学研究的重点[37,38]。

Elliott曾报道过对产漆酶基因的克隆工作,并试图把抗病虫害基因、纤维素酶基因、与保鲜相关的基因分离鉴定出来,并用于转化育种;Piet等从双孢蘑菇中分离编码木质纤维素降解酶基因,并克隆了编码木聚糖酶的基因XlnA[39]。

1.4.2.2与双孢蘑菇产量和品质性状相关的标记位点寻找能预测新菌株产量和质量性状的标记位点,不仅能从成千上万个新菌株中快速识别出优良菌株,从而提高育种效率,并能为目的基因的确定与克隆奠定基础。

现已证明,除了木质素酶、纤维素酶位点外,双孢蘑菇的酯酶、乙醇脱氢酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、细胞色素氧化酶同工酶和水溶性蛋白这6个生化标记也与产量和质量性状明显相关[27,40]。

1.4.2.3与双孢蘑菇褐变或风味相关的标记位点双孢蘑菇子实体生长快速而又容易腐烂,因此,蘑菇栽培者与加工厂商都希望为他们提供不易褐变、风味好、保鲜能力强的优良菌株。

1988年始,美国Monterery研究室的Wach等将杂交菌株U1的DNA片段导入大肠杆菌,建立起基因文库,并尝试把某些DNA片段导入其他菌株,以期育成不因机械伤而发生褐变的优良菌株。

1991年,Khush等应用PCR技术扩增重要的DNA片段,对能催化褐变的双孢蘑菇酪氨酸酶的基因作了研究[27,41]。

2　存在的问题与展望 人工选择育种工作量大,只有靠长期积累才能有所成就。

杂交育种受双孢蘑菇次级同宗配合方式的限制和细胞壁的障碍而只限于种内杂交,而种间、属间等远缘杂交则非常困难,且工作量大、周期长。

双孢蘑菇原生质体技术还处于研究阶段,仍存在着远缘杂交融合不稳定,随机性较大,要获得具有某种特定优良性状的重组子较为困难,应用于栽培生产少等问题,但由于原生质体已去除遗传物质进入细胞的一大屏障,因而是基因转化的最好受体。