扫描电镜生物样品制备技术
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(完整)扫描电镜样品制备程序
(完整)扫描电镜样品制备程序扫描电镜样品制备程序一、固定：戊二醛-锇酸双固定法1．2.5%戊二醛（试剂1）固定4小时（或者过夜)2．0.1M 磷酸缓冲液（试剂2)清洗3次,每次15-30分钟3．1％锇酸（试剂3)固定2-4小时4．0。
1M 磷酸缓冲液（试剂2）清洗3次，每次15分钟二、脱水：乙醇系列1．30%乙醇 15－20分钟2．50％乙醇 15－20分钟3．70％乙醇 15－20分钟4．80％乙醇 15－20分钟5．90%乙醇 15－20分钟6．95%乙醇 15－20分钟7。
100%乙醇两次每次15-20分钟三、置换：乙酸异戊酯2次，每次15分钟（或过夜）。
四、干燥：临界点干燥五、离子溅射金六、扫描电镜观察附注：试剂配置试剂1:2.5%戊二醛取0.2M磷酸氢二钠40.5mL（A液），0.2M磷酸二氢钠9。
5mL（B液)，混合均匀（即0。
2M磷酸盐缓冲液 pH7.4），加入10mL浓度为25％的戊二醛，用超纯水稀释至100mL。
试剂2：0。
1M 磷酸缓冲液（pH 7.4）A液：0。
2M磷酸氢二钠称取3。
561g Na2HPO4.2H2O（或者5。
365g Na2HPO4.7H2O); 或7.164g Na2HPO4.12H2O），溶于100mL双蒸水中.B液：0.2M磷酸二氢钠称取2。
760g NaH2PO4。
H2O(或者3.121g NaH2PO4。
2H2O），溶于100mL双蒸水中。
量取A液36.0mL， B液14。
0mL,混合均匀后用双蒸水稀释至100mL，得0。
1M 磷酸缓冲液（pH 7.4）。
试剂3:1％锇酸将2％的锇酸溶液与0。
1M磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4)等体积混合,得1％锇酸。
注意：该操作在通风橱中进行。
11.第六章 扫描电镜样品制备技术
（2）、冷冻干燥法：本方法是将新鲜的样品或经固 定、脱水的样品迅速冷冻后，放入真空环境中，使 玻璃态的冰直接升华跑掉，最终样品干燥。在样品 的干燥过程中不存在液体的挥发，也就消除了液体 表面张力的作用了，从理论上讲可以最大程度的保 存样品的原始形貌。但是本法的干燥速度太慢，有 人做过试验一块0.5平方毫米生物样品，在－80度中 干燥需要24小时。，如果样品块再大一些干燥需要 的时间会更长。所以本法在扫描样品制备时也不常 用。 （3）、莰烯低真空干燥法：莰烯是一种具有樟脑味， 无色透明的结晶。能溶于醚、环己烷、氯仿和丙酮 中，它在室温下为固态，遇空气很易升华，升华的 速度与温度成正比。
D.样品筐的底部和顶部要盖一层滤纸，防止样品 的污染。 E.严格控制操作温度和压力，严守操作规程。 F.保证所用二氧化碳的纯度，不纯会使干燥失败。
5、粘托
样品干燥后，需要用胶粘物质将干燥的样品粘 到样品托上。 1）、粘托时所选用的胶粘物质应具备以下条件： （1）、有一定的粘度，在室温下易干燥。 （2）、具有较低的电阻率，导电性能好，颗粒细。 （3）、干燥后收缩率小，胶膜平滑。 （4）、化学性质稳定，受电子束轰击不分解。
1）、取材的方法
动物和植物组织的取材：方法与超薄切片的取材 基本相同，只是因为扫描电镜主要是观察组织的游离 表面形态结构，因此在取材时一定要保护好所需要的 游离表面的部位，不能造成任何损伤；另外所取样品 块可稍大一些，一般观察面大小可在长X宽大约为 3X5毫米（可根据样品的性质变化取材的大小）。 离体培养的细胞取材：可在接种时把处理好的盖 玻片放在培养瓶内，让细胞长在盖片上，把带有细胞 的盖片直接进行制样处理。 细菌的取材：平板和斜面培养的，可用牙签取菌 落涂到干净的盖片上，进行制样。 悬液培养的细胞或细菌要离心收集细胞或细菌， 然后再进行制样。
扫描电镜SEM样品制备
主要优点： 景深长，所获得的图像立体感强，可用来观察生物 样品的各种形貌特征。
二、实验用品
1. 材料
2.
植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。
3. 2. 试剂
4.
丙酮、乙醇、2％戊二醛溶液、1％锇酸、
磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液体二氧化碳、导
电胶等。
5. 3. 器材
6.
扫描电镜、 临界点干燥法、真空喷镀仪、
6. 样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
• 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下：
• 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷 10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。
• 排气：在保持温度不变的条件下(即不关电源)，打开流量 计的排气阀门，以1.0～1.51／min的速度排气(速度慢些 更好)。约经45～60min后，排气完毕，样品杯的压力下降 到零，将温度调节至室温约5rain后，即可取出样品装台镀 膜(若不能立即装台，应置于干燥器内保存)。
临界点干燥操作时的注意事项： • 在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至0～10℃。 • 样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时
离子溅射镀膜法:
在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金 属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行 金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜法的装置很 简单，主要由真空部分(真空泵)和溅射部分(真空罩)组成， 在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装有用 于溅射用的金属靶(黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等)，样 品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10～ 1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000～3000V的直流电压， 两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残 余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引 轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着 在样品表面而形成金属导电膜。
二、实验用品
1. 材料
2.
植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。
3. 2. 试剂
4.
丙酮、乙醇、2％戊二醛溶液、1％锇酸、
磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液体二氧化碳、导
电胶等。
5. 3. 器材
6.
扫描电镜、 临界点干燥法、真空喷镀仪、
6. 样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
• 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是 消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面 张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如 下：
• 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用 滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的 样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装 样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷 10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。
• 排气：在保持温度不变的条件下(即不关电源)，打开流量 计的排气阀门，以1.0～1.51／min的速度排气(速度慢些 更好)。约经45～60min后，排气完毕，样品杯的压力下降 到零，将温度调节至室温约5rain后，即可取出样品装台镀 膜(若不能立即装台，应置于干燥器内保存)。
临界点干燥操作时的注意事项： • 在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至0～10℃。 • 样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时
离子溅射镀膜法:
在低真空中进行辉光放电时，由于离子冲击，阴极金 属物质有飞溅现象称为溅射。利用离子溅射仪对样品进行 金属镀膜的方法，称为溅射镀膜法。溅射镀膜法的装置很 简单，主要由真空部分(真空泵)和溅射部分(真空罩)组成， 在真空罩内装有阴极和阳极，阴极对着阳极的一面装有用 于溅射用的金属靶(黄金靶、铂靶、白金靶或钯靶等)，样 品放在阳极的样品座上面。当真空罩内的真空度抽到10～ 1Pa时，在阴极与阳极之间加上1000～3000V的直流电压， 两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下，罩内残 余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引 轰击金属靶，激发出金属颗粒和电子，并被阳极吸引附着 在样品表面而形成金属导电膜。
扫描电镜样品制备生物技术
金属原子 “辉光放电” 不同角度覆盖样品表面
离子溅射原理
优点：
喷镀颗粒较细，不至于掩盖样品的微细结构 喷镀均匀 二次电子收获量较高
组织导电技术：
原理：金属盐类化合物与生物样品中的蛋白
质、脂类、淀粉等呈化学性结合，使样品表面 离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子之 间，使样品表面电阻降低，从而避免了样品充 电。可避免样品热损伤。
材料防止挤压，观察面做好标记
（二）样品清洁漂洗
一般：生理盐水、5％碳酸钠或与固定液相应的缓冲液 大量粘液：预固定，再用蛋白水解酶 表面形态复杂、皱折凹陷多，不易清洗的样品 ：低频超声波 观察组织、细胞内部结构（如血管等）：灌流清洗后再取材
（三）样品的固定
目的：保持生物样品的微细结构和外部形貌。
扫描电子显微镜样品制备技术
SEM结构
扫描电子显微镜原理
一、常规扫描电镜样品制备技术
样品表面必须清洁 样品要干燥而不失原形 样品要有良好的导电性能 注意辨认和保护观察面
（一）取材要点
材料大小适宜
观察表面结构：直径＜5mm，高度3～5mm 观察内部结构：直径＜2mm，高度3mm± 满足观察内容条件下，样品块尽量小。
原因： 表面张力 目的： 消除表面张力
方法： 空气干燥法 冷冻真空干燥法 临界点干燥法
临界点干燥法
原理：临界状态下表面张力为零 处理液： CO2
临界温度（31.1℃） 临界压力（73个大气压）
操作程序：
取材→双固定→丙酮脱水→中 间液（醋酸异戊酯）置换脱水 剂→液态CO2置换中间液→加 热气化（温度40℃，压力 95~100kg/cm2，3~5分钟） →缓慢放气取样→喷镀→观察。
分辨率为 25 Å （SEM 60 Å ） 4．复型膜由铂、碳粒子组成，可长期保存。
离子溅射原理
优点：
喷镀颗粒较细，不至于掩盖样品的微细结构 喷镀均匀 二次电子收获量较高
组织导电技术：
原理：金属盐类化合物与生物样品中的蛋白
质、脂类、淀粉等呈化学性结合，使样品表面 离子化，或游离出金属分子镶嵌于生物分子之 间，使样品表面电阻降低，从而避免了样品充 电。可避免样品热损伤。
材料防止挤压，观察面做好标记
（二）样品清洁漂洗
一般：生理盐水、5％碳酸钠或与固定液相应的缓冲液 大量粘液：预固定，再用蛋白水解酶 表面形态复杂、皱折凹陷多，不易清洗的样品 ：低频超声波 观察组织、细胞内部结构（如血管等）：灌流清洗后再取材
（三）样品的固定
目的：保持生物样品的微细结构和外部形貌。
扫描电子显微镜样品制备技术
SEM结构
扫描电子显微镜原理
一、常规扫描电镜样品制备技术
样品表面必须清洁 样品要干燥而不失原形 样品要有良好的导电性能 注意辨认和保护观察面
（一）取材要点
材料大小适宜
观察表面结构：直径＜5mm，高度3～5mm 观察内部结构：直径＜2mm，高度3mm± 满足观察内容条件下，样品块尽量小。
原因： 表面张力 目的： 消除表面张力
方法： 空气干燥法 冷冻真空干燥法 临界点干燥法
临界点干燥法
原理：临界状态下表面张力为零 处理液： CO2
临界温度（31.1℃） 临界压力（73个大气压）
操作程序：
取材→双固定→丙酮脱水→中 间液（醋酸异戊酯）置换脱水 剂→液态CO2置换中间液→加 热气化（温度40℃，压力 95~100kg/cm2，3~5分钟） →缓慢放气取样→喷镀→观察。
分辨率为 25 Å （SEM 60 Å ） 4．复型膜由铂、碳粒子组成，可长期保存。
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备
扫描电子显微镜对样品的要求及样品的制备扫描电子显微镜是一种大型的分析仪器,主要功能是用于固态物质的形貌显微分析和对常规成分的微区分析,广泛应用于化工、材料、医药、生物、矿产、司法等领域.由于其价格昂贵及特殊的工作原理,它对样品制备有着较高的要求,样品的制备好坏,直接影响着样品分析是否成功,为此,本文着重介绍一下扫描电子显微镜应用中有关样品制备的相关知识和技术.1 扫描电子显微镜对样品的要求(1)样品必须是无毒、无放射性的物质,以保证工作人员的人身安全.(2)样品可以是块状、片状、纤维状;也可以是颗粒或粉末状,无论是什么样的样品都不能是有机挥发物和含有水分.如果将含有水分的样品放在镜筒内能产生三种严重不良后果:一是当真空达不到要求强行通高压时,其产生的水蒸汽遭遇高能电子流产生电离而放电引起束流大幅度波动,使所成的像模糊,或根本不能成像;二是造成镜筒污染;三是损坏灯丝,当高能电压通过灯丝时,温度高达2000Ο,碰到水蒸汽而氧化变质或熔断,因此,应先烘干样品中的水分.(3)无论是块状样品,还是粉末颗粒状样品,其化学、物理性质要稳定,在高真空中的电子束照射下,都要能保持成分稳定和形态不变.(4)表面受到污染的样品,要在不破坏样品表面结构的前提下,进行适当清洗、烘干.(5)无论是样品的表面,还是样品新断开的断口或断面,一般不需要进行处理,以保持其原始的结构状态.(6)对磁性样品要预先去磁,以免观察时电子束受到磁场的影响.(7)粉末样品要适量,不易过多;块状样品大小要适合仪器专用样品底座的尺寸,不能过大.一般小的样品座Φ3～5mm,大的样品座为Φ30～50mm,以分别用来放置不同大小的样品,样品的高度一般限制在5～10mm左右.2 样品的制备技术2.1 块状样品的制备对于块状导电样品,基本上不需要进行什么制备,只要其大小适合电镜样品底座尺寸大小,即可直接用导电胶带把样品黏结在样品底座上,放到扫描电镜中观察,为防止假象的存在,在放试样前应先将试样用丙酮或酒精等进行清洗,必要时用超声波清洗器进行清洗.对于块状的非导电样品或导电性较差的样品,要先进行镀膜处理,否则,样品的表面会在高强度电子束作用下产生电荷堆积,影响入射电子束斑和样品发射的二次电子运动轨迹,使图像质量下降,因此这类样品要在观察前进行喷镀导电层的处理,在材料表面形成一层导电膜,避免样品表面的电荷积累,提高图象质量,并可防止样品的热损伤。
扫描电镜SEM和透射电镜TEM样品制备技术
手柄
凹槽 21
PP2000T冷冻样品制备室
各种样品台
样品支架安装在转移装置上 （旁边是插入液氮装置，背 景是控制器）
样品插入冷冻剂
2
S E M 制 样 技 术
样品 取样 不含水或 含水少 样品种类 含水 多 清洗 导电 不导电 固定 脱水干燥
镀金 SEM观察并照相
3
SEM的制样准则 • 尽可能保持样品本来的形貌和结构 • 在样品的干燥过程尽可能减少样品变形 • 样品表面应有良好导电性能和二次电子 发射率
4
微 胶 囊 化 产 品 的 超 微 结 构
表面结构的观察：
在SEM样品台上贴上双面胶，将少许微胶囊化产品的粉末撒于双面胶 上，吹去多余的粉末，然后喷金，采用SEM进行观察。加速电压为 15kV。
内部结构的观察：
撒少许微胶囊化DHA和EPA产品在贴了双面胶的样品台上，稍稍压 实，使一部分粉末陷入双面胶的胶基中。用刀片刮去表面的粉末，然后轻 刮双面胶的表面，立即喷金，然后用SEM进行观察，加速电压为15kV。
9
• 临界点干燥（Critical-point drying, CPD）
31.3℃ 72.8 atm
在31.3℃以下， CO2以液态形式存在，在临界温度31.3℃以 上，CO2以气态形式存在，在任何压力下都不能使CO2液化。 在临界温度下，使CO2气体液化所需的最小压力Pc为临界压 力。
10
低温（5～10℃）时，将样 品加到液体CO2中，液体CO2 取代有机溶剂，当温度升高到 31.3℃，液体CO2转化成CO2 气体，从加压池中把CO2气体 放出，由于在临界态气液不 分，当液体CO2转化成CO2气 体时，样品干燥未经过两相界 SPI # 13200-AB临界点干燥机 面。
凹槽 21
PP2000T冷冻样品制备室
各种样品台
样品支架安装在转移装置上 （旁边是插入液氮装置，背 景是控制器）
样品插入冷冻剂
2
S E M 制 样 技 术
样品 取样 不含水或 含水少 样品种类 含水 多 清洗 导电 不导电 固定 脱水干燥
镀金 SEM观察并照相
3
SEM的制样准则 • 尽可能保持样品本来的形貌和结构 • 在样品的干燥过程尽可能减少样品变形 • 样品表面应有良好导电性能和二次电子 发射率
4
微 胶 囊 化 产 品 的 超 微 结 构
表面结构的观察：
在SEM样品台上贴上双面胶，将少许微胶囊化产品的粉末撒于双面胶 上，吹去多余的粉末，然后喷金，采用SEM进行观察。加速电压为 15kV。
内部结构的观察：
撒少许微胶囊化DHA和EPA产品在贴了双面胶的样品台上，稍稍压 实，使一部分粉末陷入双面胶的胶基中。用刀片刮去表面的粉末，然后轻 刮双面胶的表面，立即喷金，然后用SEM进行观察，加速电压为15kV。
9
• 临界点干燥（Critical-point drying, CPD）
31.3℃ 72.8 atm
在31.3℃以下， CO2以液态形式存在，在临界温度31.3℃以 上，CO2以气态形式存在，在任何压力下都不能使CO2液化。 在临界温度下，使CO2气体液化所需的最小压力Pc为临界压 力。
10
低温（5～10℃）时，将样 品加到液体CO2中，液体CO2 取代有机溶剂，当温度升高到 31.3℃，液体CO2转化成CO2 气体，从加压池中把CO2气体 放出，由于在临界态气液不 分，当液体CO2转化成CO2气 体时，样品干燥未经过两相界 SPI # 13200-AB临界点干燥机 面。
扫描电镜样品制备
扫描电镜样品制备扫描电子显微镜生物样品制备技术无论是透射电镜或是扫描电镜，样品均处于电镜镜筒的真空之中。
而大多数的生物样品都是柔软而且含大量水分的。
因此，也和透射电镜的样品一样，在进行扫描电镜观察前，必须对生物样品作相应的处理。
扫描电镜的功能很多，不同的功能对样品的要求不同。
例如二次电子像与背散射电子像和吸收电子像对样品的要求基本相同，而与X射线微区分析对样品的要求相差较远。
我们首先介绍二次电子像的生物样品制备技术。
此外，由于样品的性质不同，其处理方法和程序也有不同。
主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。
此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。
如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。
另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。
对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
但是，不管是那一类样品的制备，都应达到以下要求：∙尽可能保持样品活体时的形貌和结构，以便如实地反映样品本来面目。
∙在样品的干燥过程尽可能减少样品变形。
∙样品表面应有良好导电性能和二次电子发射率，以防止和减少样品的荷电效应。
样品的前期处理扫描电镜样品的前期处理主要包括表面清洁、固定、漂洗和脱水等过程。
而每一过程的处理方法基本上都是沿用透射电镜样品的处理方法的，所以，这里不一一再作详述。
但是，由于两种电镜观察的要求不同，因此，在处理中也有不同之处：1. 透射电镜主要研究样品的内部结构要求内部结构保存好，因而样品宜尽可能小使固定液能迅时渗入固定。
扫描电镜观察表面形貌，而且为了操作方便选取较大样品。
一般在8～10mm2左右，高度可达5mm。
扫描电镜的样品制备
扫描电镜的样品制备
扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种高分辨率的显微镜，对于复杂的样品结构、微观形态和表面形貌的分析非常有用。
然而，要获得良好的扫描电镜显像效果，样品的制备至关重要。
下面将介绍几种常用的扫描电镜样品制备技术。
1. 金属喷涂法
金属喷涂法是扫描电镜样品制备的经典方法。
该方法使用金属喷涂仪将金属颗粒喷在样品表面，使其形成一层均匀、导电性良好的金属膜，以便在扫描电镜中观察样品的表面结构。
该方法适用于非导电样品，如细胞、生物组织、聚合物等。
2. 离子切割法
离子切割法利用离子切割机将样品切割成纤细的薄片，以便于在扫描电镜中观察。
这种方法适用于非常薄的样品，如材料薄片、芯片等。
它可以提供非常高分辨率的图像，并且可以通过纵向切割获得样品的三维结构。
3. 冷冻切片法
冷冻切片法是一种用于生物样品的扫描电镜制备方法。
该方法使用超低温技术将样品冻结，并使用超薄刀片切割成极薄的切片，通常为50~200纳米。
这可以保留样品的水感性和原始形态，并使其在扫描电镜中观察更加清晰。
4. 化学蚀刻法
化学蚀刻法是用于金属样品的扫描电镜制备方法。
该方法使用酸或碱对样品表面进行蚀刻，以去除不需要观察的材料，形成清晰的样品结构。
该方法适用于金属薄膜、晶体和合金等金属材料。
总之，良好的扫描电镜样品制备是获得高品质扫描电镜图像的关键。
每种样品都有其独特的制备方法，为了获得最好的结果，在选择合适的制备方法时需要谨慎选择。
悬浮细胞扫描电镜的标本的制备
悬浮细胞扫描电镜的标本的制备
悬浮细胞扫描电镜的标本制备是一个关键的步骤，它需要精确
的操作和耐心。
首先，我们需要准备一个含有悬浮细胞的样品。
这
些悬浮细胞可以来自培养物中的细胞，或者从组织中分离出来。
接
下来，我们需要将这些悬浮细胞固定在一个适当的载玻片上。
固定
的方法通常包括用乙醛或氧化铂等化学物质进行固定，或者使用冷
冻固定技术。
固定后，样品需要进行脱水处理，通常使用乙醇浓度
逐渐升高的方法。
然后，样品需要被干燥，可以通过自然干燥或者
使用临界点干燥法。
接下来是金属涂覆，通常使用金属如金或铂进
行喷涂，以增加样品的导电性。
最后，样品可以被放入扫描电镜中
进行观察和成像。
在整个制备过程中，需要严格控制各个步骤的时
间和条件，以确保最终的标本能够展现出清晰的细胞结构和形态特征。
此外，在操作过程中需要注意安全，避免对人体和环境造成伤害。
总的来说，悬浮细胞扫描电镜的标本制备需要细致的操作和严
格的控制，以确保最终观察到的细胞结构和形态信息是准确可靠的。
细胞扫描电镜样品制备流程
细胞扫描电镜样品制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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第五章 扫描电镜生物样 品制备技术
第一节 常规生物样品SEM 常规生物样品SEM 制备技术
Features of SEM
高分辨率
Features of SEM
强立体感
Features of SEM
广泛的放大倍率
Features of SEM
应用范围广
生物、医学、动物、材料、 化学、 生物、医学、动物、材料、 化学、 物理、地质、冶金、矿物、 物理、地质、冶金、矿物、污泥 (杆菌 、机械、电机及导电性样 杆菌)、 杆菌 机械、 品如半导体电子材料等
T
R T R
T. harzianum (T)寄生在立枯絲核菌 菌株上的情形 寄生在立枯絲核菌(R)菌株上的情形 寄生在立枯絲核菌
松材線蟲( 松材線蟲(雄)
松材線蟲( 松材線蟲(雌)
松材線蟲頭部口針
白粉病分生孢子
麻竹墊銹菌孢子
第二节 扫描电镜特殊样品制备技术
特殊生物样品制备主要有： 特殊生物样品制备主要有： （1）管道铸型样品 ） （2）冷冻断裂样品 ） （3）游离细胞样品 ） （4）组织消化样品 ）
离子溅射法
原理： 原理：
利用气体在低真空中的辉光放电所产生的 高能离子，对靶极产生撞击， 高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打出金 属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。 属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。 在到达样品前， 在到达样品前，金属粒子之间以及金属粒子与 气体分子之间要发生相互撞击， 气体分子之间要发生相互撞击，改变了金属粒 子飞向样品的方向，具有“绕射”效应， 子飞向样品的方向，具有“绕射”效应，所以 在样品表面能形成一层连续的、 在样品表面能形成一层连续的、厚度均匀的金 属膜。 属膜。
五、干燥
目的： 目的：去除样品中的脱水剂 方法：空气干燥法、冷冻干燥法、 方法：空气干燥法、冷冻干燥法、 叔丁醇干燥法、 叔丁醇干燥法、临界点干燥法等 常用干燥法：叔丁醇干燥法、 常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法
空气干燥法
方法：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度， 方法：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度， 退回至85%脱水剂，取出， 退回至85%脱水剂，取出，空气中自然干 脱水剂 燥。 优点：脱水剂为低表面张力物质， 优点：脱水剂为低表面张力物质，挥发过程 中减少了样品的收缩及损伤 缺点： 缺点：常常使样品发生变形收缩 适用范围： 适用范围：铸型或体表比较坚硬的甲壳昆虫 等含水量较少的样品
1.0%四氧化锇 ’~1h) 四氧化锇(30’ 四氧化锇
固定温度： 固定温度：
一般以4℃为宜。 室 温，一般以 ℃为宜。
四、脱水
要求： 要求：不改变样品的体积和表面积的情况 去除样品中的水份。 下，去除样品中的水份。 常用的脱水剂：乙醇、丙酮 常用的脱水剂：乙醇、 方法： 方法：梯度脱水 时间： 时间：视样品大小而定 注意事项：避免裸露， 注意事项：避免裸露，夹伤
谢 谢！
要点：稳，钝角 要点：
样品粘托
Fixing the specimen
七、镀膜（样品的导电处理） 镀膜（样品的导电处理）
目的：使样品导电， 目的：使样品导电，增加二次电子的发射率
金属镀膜技术：包括真空喷镀法和 金属镀膜技术：包括真空喷镀法和离子溅射法 真空喷镀法
真空喷镀法
方法：在高真空中使金属加热蒸发， 方法：在高真空中使金属加热蒸发，在 样品表面沉积形成一层金属膜。 样品表面沉积形成一层金属膜。 缺点：金属损耗大， 缺点：金属损耗大，容易产生污染和热 损伤，容易形成“死角” 损伤，容易形成“死角”。
3 游离细胞样品
样品制备要点： 样品制备要点： 将相对低浓度、分散、游离的细胞浓缩、集中、 将相对低浓度、分散、游离的细胞浓缩、集中、 固定 步骤：预固定 步骤： 干燥 离心 镀膜 涂片 固定 脱水
血 细 胞
4 组织消化样品 用化学腐蚀或酶消化方法， 用化学腐蚀或酶消化方法，来充分 暴露和显示被检样品结构的表面形态。 暴露和显示被检样品结构的表面形态。 步骤： 步骤： 固定 清洗 消化 表面稳定 后固定 脱水 干燥 镀膜 观察
临界点干燥法
空气干燥法
Comparison between critical point drying and air drying
六、粘托
SEM样品在干燥处理 样品在干燥处理 或金属镀膜之前， 或金属镀膜之前，需用特 制导电胶或双面胶将样品 粘贴在金属样品台上。 粘贴在金属样品台上。 导电胶一般具有黏着 力较强、容易挥发固化、 力较强、容易挥发固化、 干燥后表面电阻率低、导 干燥后表面电阻率低、 电性能好等特点。 电性能好等特点。
叔丁醇干燥法
（1）乙醇梯度脱水至 ）乙醇梯度脱水至100﹪/ 2次 ﹪ 次 （2） 叔丁醇与乙醇混合液置换至 ） 叔丁醇与乙醇混合液置换至100%叔丁醇 叔丁醇 70﹪、 80﹪、 90﹪ 、95﹪和 100﹪/ 2次 ﹪ ﹪ ﹪ ﹪ ﹪ 次 5 - 10min/次 次 （3）在样品表面滴上 100%叔丁醇 ） 叔丁醇 （4）将标本置于 ℃以下使样品快速固化 ）将标本置于4℃ （5）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。 ）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。
三、 固定 目的： 目的：
保存样品表面的真实结构； 保存样品表面的真实结构； 硬化组织， 硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品 的损伤； 的损伤； 提高样品的二次电子发射率； 提高样品的二次电子发射率； 提高样品的耐热性和导电性。 提高样品的耐热性和导电性。
常用的固定剂： 2.5%戊二醛 （1～3h) 常用的固定剂： 戊二醛 ～
离子溅射的优点： 离子溅射的优点：
要求的真空低 工作温度低 金属粒子无方向 连续的、 连续的、厚度均匀
甲 虫
3kV
Байду номын сангаас
大肠杆菌
耳蜗
尿酸钠结晶 巨噬细胞吞噬
红 细 胞
上左： 上左：兔肾小体细胞 上右： 上右：血细胞发生 下图： 下图：十二指肠绒毛
A
B
SEM觀察苗木下表皮氣孔分 SEM觀察苗木下表皮氣孔分 佈及葉部組織之微細構造 A：氣孔密度(橫線=120mm) 氣孔密度(橫線=120mm) B：氣孔形態(橫線=12mm) 氣孔形態 橫線=12mm) C：葉組織(橫線=120mm) 葉組織(橫線=120mm)
冷冻干燥法
方法： 方法：将含大量水分的生物样品迅速投入液 氮中，使样品冷冻固化， 氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移入真 空镀膜仪内，在高真空状态下升华， 空镀膜仪内，在高真空状态下升华，脱水剂 直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。 直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。 优点：不存在气相与液相间的表面张力问题， 优点：不存在气相与液相间的表面张力问题， 故对样品损伤较小。 故对样品损伤较小。 缺点：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤， 缺点：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤， 费时。 费时。 适用范围： 适用范围：含水量较多的生物样品
1. 管道铸型样品
用于研究血管淋巴管胆管等空腔性脏器 的立体结构关系和内表面结构。 的立体结构关系和内表面结构。 铸型方法: 铸型方法: 铸型剂灌入管腔 硬化成型后将 组织腐蚀去掉 处理铸型进行观察 铸型处理： 铸型处理：干燥 喷镀 观察
2 冷冻断裂样品
用于实质性脏器内部组织结构的研究， 用于实质性脏器内部组织结构的研究，观 察组织细胞内部各种复杂的细胞器及相互之间 的关系。 的关系。 步骤： 步骤：取材 固定 清洗 防冻 冷冻 包埋 割断 软化 后固定 导电 及终末固定 脱水 临界点干燥 镀膜 观察 要求：取材迅速 ，大小为1×1×5mm， 用具要 要求： 大小为 ， 预冷，切忌夹持观察面， 预冷，切忌夹持观察面，冷冻的速度要 快，外力要轻
不含水份 具有较高的二次电子发射率 良好的导电性 耐热性 最大限度的保持样品的形貌
扫描电镜样品常规制备的操作程序
1. 取 材
2. 清 3. 固 4. 脱 5. 干 6. 粘 7. 镀 洗 定 水 置换） 燥（置换） 托 导电处理） 膜（导电处理）
一、 取 材
要 点： 确定观察样品的目标 要求及注意事项： 要求及注意事项： 做好充分准备（试剂、仪器、器械等） 做好充分准备（试剂、仪器、器械等） 保护观察面， 保护观察面，作好标记 速度要快 ，每次取材数量不宜过多 10 × 10 × 5毫米 大小要合适 毫米 避免拉割、 避免拉割、挤压
二、清洗
目的：去除观察面的杂质， 目的：去除观察面的杂质，充分暴露观察面 方法：物理方法: 漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声。 方法：物理方法 漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声。 化学方法: 化学方法: 用酶消化法 注意事项： 注意事项： 在保证不破坏观察面的条件下， 在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面 不要损伤观察面或者使样品膨胀、 不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等 不要将样品裸露在空间， 不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型
临界点干燥法
原理：利用物质在临界状态时， 原理：利用物质在临界状态时，气相与液相 的界面消失， 的界面消失，样品在没有表面张力的 情况下进行干燥。 情况下进行干燥。 步骤： 置换（醋酸异戊酯） 步骤：脱水 置换（醋酸异戊酯） 预冷 放入样品 注入液态CO2 CO2置换 注入液态 CO2加温气化 排除CO2 排除 温度： 温度：31.4度 度 压力： 个大气压 压力：73个大气压
未接種菌根菌草海桐苗木之根部微細構造 (A：橫線=300mm； (A：橫線=300mm；B：橫線=12mm) 橫線=12mm)
接種菌根菌及2%鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造 接種菌根菌及2%鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造 (A：橫線=30mm； (A：橫線=30mm；B：橫線=12mm) 橫線=12mm)
材 料 学 土 聚 水 泥
制备扫描电镜样品的总要求
在不损伤样品原始结构状态 的情况下， 的情况下，保证样品的体积和表 面积不发生改变，充分暴露样品 面积不发生改变， 表面的微细结构 。
第一节 常规生物样品SEM 常规生物样品SEM 制备技术
Features of SEM
高分辨率
Features of SEM
强立体感
Features of SEM
广泛的放大倍率
Features of SEM
应用范围广
生物、医学、动物、材料、 化学、 生物、医学、动物、材料、 化学、 物理、地质、冶金、矿物、 物理、地质、冶金、矿物、污泥 (杆菌 、机械、电机及导电性样 杆菌)、 杆菌 机械、 品如半导体电子材料等
T
R T R
T. harzianum (T)寄生在立枯絲核菌 菌株上的情形 寄生在立枯絲核菌(R)菌株上的情形 寄生在立枯絲核菌
松材線蟲( 松材線蟲(雄)
松材線蟲( 松材線蟲(雌)
松材線蟲頭部口針
白粉病分生孢子
麻竹墊銹菌孢子
第二节 扫描电镜特殊样品制备技术
特殊生物样品制备主要有： 特殊生物样品制备主要有： （1）管道铸型样品 ） （2）冷冻断裂样品 ） （3）游离细胞样品 ） （4）组织消化样品 ）
离子溅射法
原理： 原理：
利用气体在低真空中的辉光放电所产生的 高能离子，对靶极产生撞击， 高能离子，对靶极产生撞击，从靶极上打出金 属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。 属粒子，金属粒子在电场的作用下飞向样品。 在到达样品前， 在到达样品前，金属粒子之间以及金属粒子与 气体分子之间要发生相互撞击， 气体分子之间要发生相互撞击，改变了金属粒 子飞向样品的方向，具有“绕射”效应， 子飞向样品的方向，具有“绕射”效应，所以 在样品表面能形成一层连续的、 在样品表面能形成一层连续的、厚度均匀的金 属膜。 属膜。
五、干燥
目的： 目的：去除样品中的脱水剂 方法：空气干燥法、冷冻干燥法、 方法：空气干燥法、冷冻干燥法、 叔丁醇干燥法、 叔丁醇干燥法、临界点干燥法等 常用干燥法：叔丁醇干燥法、 常用干燥法：叔丁醇干燥法、临界点干燥法
空气干燥法
方法：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度， 方法：脱水至无水状态，为减缓其挥发速度， 退回至85%脱水剂，取出， 退回至85%脱水剂，取出，空气中自然干 脱水剂 燥。 优点：脱水剂为低表面张力物质， 优点：脱水剂为低表面张力物质，挥发过程 中减少了样品的收缩及损伤 缺点： 缺点：常常使样品发生变形收缩 适用范围： 适用范围：铸型或体表比较坚硬的甲壳昆虫 等含水量较少的样品
1.0%四氧化锇 ’~1h) 四氧化锇(30’ 四氧化锇
固定温度： 固定温度：
一般以4℃为宜。 室 温，一般以 ℃为宜。
四、脱水
要求： 要求：不改变样品的体积和表面积的情况 去除样品中的水份。 下，去除样品中的水份。 常用的脱水剂：乙醇、丙酮 常用的脱水剂：乙醇、 方法： 方法：梯度脱水 时间： 时间：视样品大小而定 注意事项：避免裸露， 注意事项：避免裸露，夹伤
谢 谢！
要点：稳，钝角 要点：
样品粘托
Fixing the specimen
七、镀膜（样品的导电处理） 镀膜（样品的导电处理）
目的：使样品导电， 目的：使样品导电，增加二次电子的发射率
金属镀膜技术：包括真空喷镀法和 金属镀膜技术：包括真空喷镀法和离子溅射法 真空喷镀法
真空喷镀法
方法：在高真空中使金属加热蒸发， 方法：在高真空中使金属加热蒸发，在 样品表面沉积形成一层金属膜。 样品表面沉积形成一层金属膜。 缺点：金属损耗大， 缺点：金属损耗大，容易产生污染和热 损伤，容易形成“死角” 损伤，容易形成“死角”。
3 游离细胞样品
样品制备要点： 样品制备要点： 将相对低浓度、分散、游离的细胞浓缩、集中、 将相对低浓度、分散、游离的细胞浓缩、集中、 固定 步骤：预固定 步骤： 干燥 离心 镀膜 涂片 固定 脱水
血 细 胞
4 组织消化样品 用化学腐蚀或酶消化方法， 用化学腐蚀或酶消化方法，来充分 暴露和显示被检样品结构的表面形态。 暴露和显示被检样品结构的表面形态。 步骤： 步骤： 固定 清洗 消化 表面稳定 后固定 脱水 干燥 镀膜 观察
临界点干燥法
空气干燥法
Comparison between critical point drying and air drying
六、粘托
SEM样品在干燥处理 样品在干燥处理 或金属镀膜之前， 或金属镀膜之前，需用特 制导电胶或双面胶将样品 粘贴在金属样品台上。 粘贴在金属样品台上。 导电胶一般具有黏着 力较强、容易挥发固化、 力较强、容易挥发固化、 干燥后表面电阻率低、导 干燥后表面电阻率低、 电性能好等特点。 电性能好等特点。
叔丁醇干燥法
（1）乙醇梯度脱水至 ）乙醇梯度脱水至100﹪/ 2次 ﹪ 次 （2） 叔丁醇与乙醇混合液置换至 ） 叔丁醇与乙醇混合液置换至100%叔丁醇 叔丁醇 70﹪、 80﹪、 90﹪ 、95﹪和 100﹪/ 2次 ﹪ ﹪ ﹪ ﹪ ﹪ 次 5 - 10min/次 次 （3）在样品表面滴上 100%叔丁醇 ） 叔丁醇 （4）将标本置于 ℃以下使样品快速固化 ）将标本置于4℃ （5）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。 ）移入镀膜仪中让样品在真空下升华干燥。
三、 固定 目的： 目的：
保存样品表面的真实结构； 保存样品表面的真实结构； 硬化组织， 硬化组织，减少脱水干燥时水的表面张力对样品 的损伤； 的损伤； 提高样品的二次电子发射率； 提高样品的二次电子发射率； 提高样品的耐热性和导电性。 提高样品的耐热性和导电性。
常用的固定剂： 2.5%戊二醛 （1～3h) 常用的固定剂： 戊二醛 ～
离子溅射的优点： 离子溅射的优点：
要求的真空低 工作温度低 金属粒子无方向 连续的、 连续的、厚度均匀
甲 虫
3kV
Байду номын сангаас
大肠杆菌
耳蜗
尿酸钠结晶 巨噬细胞吞噬
红 细 胞
上左： 上左：兔肾小体细胞 上右： 上右：血细胞发生 下图： 下图：十二指肠绒毛
A
B
SEM觀察苗木下表皮氣孔分 SEM觀察苗木下表皮氣孔分 佈及葉部組織之微細構造 A：氣孔密度(橫線=120mm) 氣孔密度(橫線=120mm) B：氣孔形態(橫線=12mm) 氣孔形態 橫線=12mm) C：葉組織(橫線=120mm) 葉組織(橫線=120mm)
冷冻干燥法
方法： 方法：将含大量水分的生物样品迅速投入液 氮中，使样品冷冻固化， 氮中，使样品冷冻固化，而后将样品移入真 空镀膜仪内，在高真空状态下升华， 空镀膜仪内，在高真空状态下升华，脱水剂 直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。 直接由固态转为气态，样品随之得到干燥。 优点：不存在气相与液相间的表面张力问题， 优点：不存在气相与液相间的表面张力问题， 故对样品损伤较小。 故对样品损伤较小。 缺点：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤， 缺点：需特殊的低温条件，易出现冰晶损伤， 费时。 费时。 适用范围： 适用范围：含水量较多的生物样品
1. 管道铸型样品
用于研究血管淋巴管胆管等空腔性脏器 的立体结构关系和内表面结构。 的立体结构关系和内表面结构。 铸型方法: 铸型方法: 铸型剂灌入管腔 硬化成型后将 组织腐蚀去掉 处理铸型进行观察 铸型处理： 铸型处理：干燥 喷镀 观察
2 冷冻断裂样品
用于实质性脏器内部组织结构的研究， 用于实质性脏器内部组织结构的研究，观 察组织细胞内部各种复杂的细胞器及相互之间 的关系。 的关系。 步骤： 步骤：取材 固定 清洗 防冻 冷冻 包埋 割断 软化 后固定 导电 及终末固定 脱水 临界点干燥 镀膜 观察 要求：取材迅速 ，大小为1×1×5mm， 用具要 要求： 大小为 ， 预冷，切忌夹持观察面， 预冷，切忌夹持观察面，冷冻的速度要 快，外力要轻
不含水份 具有较高的二次电子发射率 良好的导电性 耐热性 最大限度的保持样品的形貌
扫描电镜样品常规制备的操作程序
1. 取 材
2. 清 3. 固 4. 脱 5. 干 6. 粘 7. 镀 洗 定 水 置换） 燥（置换） 托 导电处理） 膜（导电处理）
一、 取 材
要 点： 确定观察样品的目标 要求及注意事项： 要求及注意事项： 做好充分准备（试剂、仪器、器械等） 做好充分准备（试剂、仪器、器械等） 保护观察面， 保护观察面，作好标记 速度要快 ，每次取材数量不宜过多 10 × 10 × 5毫米 大小要合适 毫米 避免拉割、 避免拉割、挤压
二、清洗
目的：去除观察面的杂质， 目的：去除观察面的杂质，充分暴露观察面 方法：物理方法: 漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声。 方法：物理方法 漂洗、换洗、加压冲洗、振荡超声。 化学方法: 化学方法: 用酶消化法 注意事项： 注意事项： 在保证不破坏观察面的条件下， 在保证不破坏观察面的条件下，充分暴露观察面 不要损伤观察面或者使样品膨胀、 不要损伤观察面或者使样品膨胀、收缩等 不要将样品裸露在空间， 不要将样品裸露在空间，防止样品皱缩变型
临界点干燥法
原理：利用物质在临界状态时， 原理：利用物质在临界状态时，气相与液相 的界面消失， 的界面消失，样品在没有表面张力的 情况下进行干燥。 情况下进行干燥。 步骤： 置换（醋酸异戊酯） 步骤：脱水 置换（醋酸异戊酯） 预冷 放入样品 注入液态CO2 CO2置换 注入液态 CO2加温气化 排除CO2 排除 温度： 温度：31.4度 度 压力： 个大气压 压力：73个大气压
未接種菌根菌草海桐苗木之根部微細構造 (A：橫線=300mm； (A：橫線=300mm；B：橫線=12mm) 橫線=12mm)
接種菌根菌及2%鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造 接種菌根菌及2%鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造 (A：橫線=30mm； (A：橫線=30mm；B：橫線=12mm) 橫線=12mm)
材 料 学 土 聚 水 泥
制备扫描电镜样品的总要求
在不损伤样品原始结构状态 的情况下， 的情况下，保证样品的体积和表 面积不发生改变，充分暴露样品 面积不发生改变， 表面的微细结构 。