氨基酸标样的分析
一、实验目的
（1）熟悉高效液相色谱仪的结构、分离原理和操作程序。
（2）掌握氨基酸标样的分析方法、原理。
二、实验原理
氨基酸与PITC发生反应生成的衍生物，在254nm处有最大吸光值。氨基酸衍生物进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积可进行定性和定量。该方法是柱前衍生法中的一种。PITC方法的反应方程式如下图所示：
三、实验仪器和试剂
1、仪器：
高效液相色谱仪（带紫外检测器）。
2、材料：
氨基酸标样
3、试剂：
衍生液：
异硫氰酸苯酯：甲醇：三乙胺：水（V/V）=1：7：1：1
正己烷、乙腈、乙酸、乙酸钠
以上试剂中乙腈为色谱醇，水为二次蒸馏水，其它为分析醇。
四、实验步骤
1、柱前衍生步骤：
（1）将100ul衍生液加入100ul氨基酸标样或样品中，震荡使混合均匀，室温放置1小时。
（2）反应液中加入200ul正己烷，充分震荡后放置使分层。
（3）取下层溶液用一次性滤膜过滤器（0.45ul）过滤。
（4）取滤液5ul注入HPLC。
2、分离条件的设定
（1）色谱柱：Shim-pack VP-ODS 4.6mm x 15cm
保护柱：Shim-pack GVP-ODS4.6 mm x 1cm
（2）流动相：
A液：0.1M乙酸钠pH6.50（用乙酸调整，500ml乙酸钠中约加
2滴乙酸）。
B液：乙腈/水=4/1
（3）流量：1ml/min
柱温：36℃
检测波长：254nm
（4）梯度洗脱程序：
TIME(min) FUNC VALUE
0．01 BCONC 10
3 BCONC 10
21 BCONC 39
21.01 BCONC 80
25 BCONC 80
25.01 BCONC 10
35 STOP STOP
3、数据采集
打开real-time CS analysis软件采集数据并对数据进行分析
五、注意事项
1、流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。
2、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。
3、不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
4、每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
5、气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
6、如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。
六、思考题
1、试述反相离子对色谱的分离机理。
2、试述本实验氨基酸分析的基本原理和方法，除了本方法外，还有那些氨基酸分析方法？
