第四章 蛋白组学概论及其研究方法

第四章蛋白质组学及其研

究方法概况

蛋白质组(proteome)由澳大利亚学者Williams和

Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质

(protein)与基因组(genome)两个词的组合，即”

一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质"。

蛋白质组对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，

不局限于一个或几个蛋白质。在不同细胞和组织

中，同一基因组的表达情况各不相同，蛋白质组

在空间和时间上是呈动态变化的整体。

激光显微切割技术整合蛋白组学研究的操作流程

向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。

iTRAQ技术原理图

iTRAQ试剂标记原理（4种标记）iTRAQ试剂包括3部分：

1.报告部分

2.肽反应部分

3.平衡部位

报告部分共有4种：质量数分别为114~117Da，最多可同时标记4组样品。

iTRAQ试剂结构

肽反应部分：能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价连接，从而将报告部分

iTRAQ试剂标记原理（8种标记）iTRAQ试剂包括3部分：

1.报告部分

2.肽反应部分

3.平衡部位

报告部分共有8种：质量数分别为113~121Da，因此iTRAQ最多可同时标

iTRAQ试剂结构

记8组样品。

iTRAQ实验流程

iTRAQ实验流程。

收集不同组别的样本并分别提

1、收集不同组别的样本并分别提

取蛋白质；

2、蛋白质经过还原，封闭后用胰

蛋白酶酶切；

3、各组样本的肽段混合物分别用

不同的iTRAQ试剂标记；

4、等量混合各样本中的标记肽段；

5、MS/MS质谱检测及分析。

2、各组肽段分别用4种iTRAQ试剂

标记(例如对照组用iTRAQ 117标记，其他3个实验组分别用iTRAQ 114, 115, 116标记)；

3、标记好的各组样本等量混合，液相分离和质谱分析.

4、不同样本中蛋白质的差异表达可通过二级质谱中iTRAQ试剂的峰面

积确定，如图所示：与对照组相比，该蛋白在3个处理组(114-116)中的相对表达量较高。

5、根据该肽段的二级质谱峰图，结合数据库检索，得到蛋白的定性信息。

Label-free定量蛋白质组学

◆理论依据：蛋白质丰度与质谱数据一级谱

呈现定相关性

肽段峰强度或二级谱数目呈现一定相关性。

◆定量方法：1、信号强度法：基于一

级谱图母离子强度（谱图峰高、谱图峰

面积、谱图峰容量等）。2、谱图计数

法：基于肽段匹配的二级谱图数目。

◆复杂的蛋白样品首先经过酶解形成肽

段，再经过广泛分级，由自动化的串联

质谱鉴定。这种方法可以分析全细胞裂

解样品和组织抽提物，也可以分析亚细

胞分级组分、分离的细胞器等其他亚蛋

白质组。

举例比较：

莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtti) 是一种直径约10 μm的单细胞真核绿藻，

目前是生物燃料氢气，生物柴油和烃的原料。

•相比于高等植物，莱茵衣藻结构简单，生长迅速，遗传背景清晰，基因组测序已完

成，是科研中一种良好的模式生物。

•IF：4.2

成，是科研中种良好的模式生物。

•4组技术重复

•技术路线•90 ug •3ug •3ug •90 ug

•3ug •3组生物学重复

•A: 用以评估技术重复定量准确性（4组技术重复）

•B: 用以评估生物学重复定量准确性（3组生物学重复）

•蛋白定量值评估

✓在蛋白表达差异1-2.5倍范围内，iTRAQ 和Label free 定量结果均较为准确（红线标注范围）而在蛋白表达差异3-10倍范围内，iTRAQ 定量值与实际值相差较大（蓝线标注范围）。

•鉴定蛋白和定量蛋白数目比较

•技术重复•生物学重复

•921

•558

•639

•896

•128•210•329

•124✓Label-free 可比iTRAQ 多鉴定30-40%蛋白，多定量40-62%蛋白。

•iTRAQ 和Label free 定量相关性分析

•生物学重复鉴定蛋白数比较

•61%•67%

三次生物学重复，iTRAQ overlap蛋白比例为61%，Label free overlap蛋白比例为67%。•GO注释分析比较

本研究中，富集于胡萝卜

素生物合成、谷胱甘肽代

谢、线粒体电子转运、核

小体组装、磷酸戊糖转运

等生物学进程的蛋白来自

于Label‐free方法。

蛋白质翻译后修饰的研究

蛋白质相互作用研究

翻译后修饰

抗

SDS-PAGE

切取

搜索数据库得到与