MTT法测定细胞生长曲线

MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT法原理、步骤以及注意事项MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处（也有用570nm波长的，我目前用的都是570nm)测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml 的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml 保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

简述mtt法能绘制细胞生长曲线的原理
MTT法（即3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）是一种常用的细胞代谢活性检测方法，常用于测定细胞增殖与毒性的活性。

MTT法的原理是通过将MTT激发后生成的水溶性产物还原成紫色的颗粒沉淀，进而通过溶解颗粒沉淀来评估细胞数量和代谢活性。

主要步骤如下：
1. 细胞接种：将待测细胞接种在含有MTT试剂的培养皿中。

2. 细胞培养：细胞在MTT试剂中进行培养，培养期间细胞会代谢活跃并增殖。

3. 溶解颗粒沉淀：经过一定时间的培养后，MTT试剂会被还原成紫色的颗粒沉淀。

将培养皿中的培养液倒掉，然后加入溶解剂（如酒精或二甲基亚硫酸钠溶液）溶解颗粒沉淀。

4. 颜色测定：溶解颗粒沉淀溶解后的溶液会变成紫色，利用酶标仪或多孔板读取器测定溶液的光密度。

MTT法通过测定光密度来间接评估细胞的增殖与活性。

细胞越多，MTT试剂被还原成颗粒沉淀就越多，溶解后的溶液光密度就越高，说明细胞数目越多，代谢活性越高。

因此，通过测定光密度的变化可以绘制细胞生长曲线，反映细胞增殖与活性的变化情况。

MTT法绘制生长曲线一细胞生长曲线：A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。

B、背景知识细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。

只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。

因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。

原理（选填项目）：细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

C、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 24培养板4. 胶塞（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. RPMI16404. 双抗（青霉素、链霉素）5. 0.08%胰酶（四）、操作步骤1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。

3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。

培养3～5d常要给未计数的细胞换液。

4. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。

9（五）、注意事项1．细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。

2．现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。

3．标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。

4．在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。

悬浮细胞：MTT分析法是以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。

MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的for mazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。

还原生成的for mazan结晶可在含50%的N, N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。

也可以用DMSO来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。

实验的时候建议关闭超净台上的日光灯来避光。

步骤如下：1:接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。

2:培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3: 呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS <ph=7.4>配）20ul. 继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加150ul DMSO，振荡10 分钟，使结晶物充分融解。

4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

注意事项：1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。

在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。

其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

细胞生长曲线测定细胞生长曲线目录概念方法概念方法展开编辑本段概念细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。

一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。

在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。

为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。

以存活细胞数(万／mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。

编辑本段方法计数法1．取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数(见四、细胞传代培养的实验步骤)。

如是非粘壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。

2．根据细胞计数结果按每个小方瓶5×104／mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。

3．24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。

计算平均值。

连续计数7 d。

4．根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。

MTT法1．制备1 mL细胞悬液。

空白对照以1 mL培养基代替细胞悬液。

加入0．1 mL MTT于37℃孵育4 h。

使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶。

2．加1 mL DTW脱色液，37℃至少静置30 min(甚至过液)，使甲质颗粒充分溶解。

3．吸取200 μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD 值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。

4．每隔24 h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值。

细胞增殖检测：MTT法MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT噻唑蓝为基础。

MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。

还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。

也可以用DMSO 来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

一、步骤1、接种细胞用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。

2、培养细胞同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3、呈色培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

4、比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

二、注意事项1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。

在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。

其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。

MTT试验方法MTT法原理、步骤以及注意事项(2009-05-28 11:18:56)标签：杂谈分类：实验操作技能MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处（也有用570nm波长的，我目前用的都是570nm)测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。