多克隆抗体的制备及抗体效价测定教案

多克隆抗体制备多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。

【晶莱生物】具体实验步骤如下：1.兔子的准备挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.预采血（作阴性参照用）1.1 将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤口；1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝结释放血清；1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min； h.收集上清，即为血清。

2. 兔子的免疫2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。

2.2 将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白色；2.3 小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留数秒以防止抗原外流。

2.4 免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和最终放血),总共免疫4-5次。

3.效价检测3.1 2个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也可以37℃孵育2小时。

3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃孵育2小时。

3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。

JLU
37℃ ，40min. ❖ 洗 涤: 加洗液200ul/孔，轻磕板1分钟，弃上清，洗三次 . ❖ 酶标抗体: 加入HRP标二抗100 µL/孔37℃ 40min. ❖ 洗 涤: 加洗液200ul/孔，轻磕板1分钟，弃上清，洗三次 . ❖ 显 色: 加入底物100 µL/孔，避光15min ❖ 加终止液: 加2M硫酸 50 µL/孔 ❖ 测 量: 酶标仪测定OD 490nm值.
稀释度 （倍）
OD值
阴性 200 400 800 1600 3200 6400 12800 对照 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.11 0.08
抗体效价 ≈ 6000
数据统计方法（结果示意图）
注意事项
❖ EP管做好标记 ❖ 离心配平 ❖ 移液器操作：缓吸缓吐，用后恢复到最大量程 ❖ 加板：贴壁 ❖ 磕板：轻柔，防止交叉污染 ❖ 弃上清：甩板或倒扣
JLU
多克隆抗体制备-ELISA
王飞 fei@
实验材料
❖ 96孔ELISA板、移液器、镊子、离心管 ❖ 抗原包被液：50ug/ml OVA in 0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6 ❖ 封闭液：5%脱脂奶粉 in PBS pH7.4 ❖ 抗体稀释液：PBS pH7.4 ❖ 二抗：HRP标记羊抗鼠抗体 ❖ 洗涤液(PBST)：0.1%Tween-20 in PBS pH7.4 ❖ 显色液：0.04%OPD、0.15%H2O2 in 柠檬酸-磷酸缓冲液 pH5.0 ❖ 终止液：2M硫酸
加板方法
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12源自A1:200B
1:400
C
1：800
D
1:1600
E
1:3200
F

多克隆抗体制备多抗制备通常用抗原免疫动物，激发动物机体免疫系统产生抗体，最后通过获取动物高免血清获得抗体；获得的高免血清大部分可以直接使用，用于普通免疫学实验，有些则需要机一部纯化修饰才可以使用。

一、动物免疫动物的免疫是制备抗体最为重要的环节之一，物种选择上最好选择与抗原物种远亲缘动物为宜。

下表列出常规抗原在不同动物上的使用剂量和免疫程序。

程序和剂量：以蛋白类抗原为例（一般免疫间隔为3周，如果比较急，也可间隔2周免疫一次）天数佐剂类型免疫程序剂量（质量/体积）兔子小鼠大鼠豚鼠山羊鸡0 完全佐剂预取血（血清背景检测）首次免疫100μg/500μl40μg/50μl100～500μg/200μl100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl20 不完全佐剂第一次加强免疫100μg/500μl40μg/50μl100～500μg/200μl100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl40 不完全佐剂第二次加强免疫100μg/500μl40μg/50μl100～500μg/200μl100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl60 不加佐剂第三次加强免疫(静脉)100μg/500μl40μg/50μl100～500μg100～500μg/200μl1000μg/1000μl300～500μg/300μl70 终放血1.动物的准备及背景测试选取健康符合实验动物标准的动物，免疫前需要静养一周，免疫前采血进行背景测试。

1.2 兔耳静脉取血方法耳静脉取2ml血，如果耳静脉不明朗，可擦拭二甲苯，一般来说取1ml以上是足够做背景测试用的。

1.2.1 将兔子固定在固定盒内，轻轻抚摸背部使其安静下来；1.2.2 用75%酒精棉擦拭兔耳朵，使其耳静脉可见，必要时可用刮刀刮净兔耳上的毛，如果血管依然不明显可用二甲苯擦拭，使其血管膨胀。

• 乳化: 一般抗型变原态与反免应,疫并佐使其剂增体强积。 比1:1混合。 首次免疫采用完全佐剂，加强免疫采用不 完全佐剂。
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免疫方式
• 注射途径: 免疫注射的途径也很重要。一般 采用多点注射，一只动物注射总数约为8～ 10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部 两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内 易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有 利
多克隆抗体制备
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多克隆抗体的制备方法
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动物选择
一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种类 应考虑的要点: •需要制备的抗血清的质量; •供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种 系关系; •免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的 免疫原选用相应的动物）。 二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的 影响
血液采集
采血量
少量
采血部位
尾静脉，耳静脉，眼 底静脉
中量
耳中央动脉，颈动/静 脉，心脏
大量
股动脉，颈动脉，心 脏，摘眼球
血清的分离：采取4℃静置过夜，3000-4000 转离心10-15min钟。
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多克隆抗体纯化
•蛋白A亲和层析 •蛋白A可与多种哺乳动物的IgG重链的Fc片段 相结合也可与某些IgM和IgA相结合 •抗原亲和纯化 •多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一 种层析方式。基本思路是将抗原固定在一种 基质上, 然后与抗血清孵育以捕获相应的抗体, 然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体, 最后 再将抗体洗脱下来
.鸡Biblioteka 鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白 质的抗体具有独特的优点。
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可保 持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件 下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和单价 的Fab或Fab′等片段。 鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中, 从鸡蛋中收获抗体 可避免采用损伤性的收集手段。

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实验材料: 1. 新西兰雄性大白兔共16只,2只/班,昆明鼠48只,6只/班 2. 灭活伤寒沙门菌 3. 注射器(免疫用、采血用)、碘酒酒精棉球等 4. 肥大氏反应用实验材料
一、大白兔耳缘静脉免疫方法 1. 将大白兔固定,将耳缘静脉附近的毛剪去,并用酒精棉球消毒。 2. 用2ml注射器吸取1ml (初次0.5ml)伤寒沙门菌液经耳缘静脉注入大白兔体内。 3. 每周免疫1次,连续3-4次。 注意:先自耳缘静脉远端注射。
二、大白兔皮内免疫方法 先将大白兔固定,剪去背部兔毛,注意不要剪破皮肤。然后用酒精棉球进行消毒。 用2ml注射器吸取1ml伤寒沙门菌液进行皮内注射,共4-6点,每点大约0.2ml。 3. 每周免疫1次,连续3-4次。
三、小鼠腹腔免疫方法 1.用左手抓取小鼠固定,消毒腹部皮肤。 2.用1ml注射器吸取伤寒沙门菌0.2ml进行腹腔注射。 3.每周免疫1次,连续3-4次。
进行实验记录: 包括实验名称 指导教师 年级专业 参加实验学生 整个实验过程 意见和建议
兔标记方法: 1班:剪去头左侧毛 5班:剪去腹左侧毛
一、大白兔耳缘静脉免疫方法: 1.将大白兔固定,将耳缘静脉附近的毛剪去,并用酒精棉球消毒。 2.用2ml注射器吸取1ml(初次0.5ml)伤寒沙门菌液经耳缘静脉注入大白兔体内。 3.每周免疫1次,连续3-4次。 注意:先自耳缘静脉远端注射。
二、大白兔皮内免疫方法 1.先将大白兔固定,剪去背部兔毛,注意不要剪破皮肤。然后用酒精棉球进行消毒。 2.用2ml注射器吸取1ml伤寒沙门菌液进行皮内注射,共4-6点,每点大约0.2ml。 3. 每周免疫1次,连续3-4次。
三、小鼠腹腔免疫方法 1.用左手抓取小鼠固定,消毒腹部皮肤。 2.用1ml注射器吸取伤寒沙门菌0.2ml进行腹腔注射。 3.每周免疫1次,连续3-4次。

多克隆抗体的制备1. 器材：剪刀（剪兔毛用）一把、弯头眼科手术镊子（游离血管用）一把、直头眼科手术剪（剪血管用）一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿（直径18cm）、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。

2. 试剂：生理盐水(或PBS)，弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant, FCA） Sigma F-5881，弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant, FIA) Sigma F-5506，二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN33. 兔子的选择：兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。

4. Pre-bleeding：抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。

待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。

取血量约5ml足矣。

免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。

抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。

将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。

首次免疫用FCA，以后都用FIA。

免疫方法可采用背部多点注射法。

即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射（不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好）。

每次免疫的抗原量约100μg。

免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。

免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。

因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。

在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。

最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下：a.家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。

实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。

⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。

⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。

一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。

多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。

将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。

如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。

通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。

首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。

但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。

免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。

三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。

通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。

【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。

⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。

⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。

⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。

由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。

肥达反应结果图
血清的凝集效价（滴度）：是指能与一定量 的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“++”凝集） 的血清最高稀释倍数。血清效价代表血清中抗体 的含量，血清效价越高，所含抗体的量愈多。一 般认为，伤寒沙门菌“O”抗体凝集效价在1：80 以上，“H”抗体在1：160以上，甲、乙型副伤 寒沙门菌凝集效价在1：80以上才有诊断价值。
7. 轻轻振摇反应板，使其混匀，置37℃恒温 箱2~3小时观察结果。
肥达反应稀释法示意表
试验管（每管0.2ml）
对照管
12
3
4
5
6
血清稀释度 1:20 1:40 1 “O”抗原 0.2 0.2
1:80 0.2
1:160 0.2
1:32 0
0.2
（NS 0.5ml）
0.2
2 “H”抗原 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
21/27 静脉
26/34 静脉
抗原
弗氏完全佐剂 单纯抗原 单纯抗原 单纯抗原 单纯抗原 单纯抗原
剂量（mL）
1.0
0.5
0.2
0.5
1.0
பைடு நூலகம்
2.0
三、动物采血
采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定， 若效价达到要求，应在末次免疫后一周及 时采血，否则抗体效价会下降。 (1) 颈动脉采血法 (2)心脏采血法 (3)静脉采血法
②选择性沉淀—选择某抗原理化特性，采用相应沉 淀剂或溶液环境。 核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法
例： 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋； 8%～12%PEG6000可沉淀IgG。
•
盐析法沉淀抗原的机理
③超滤法—利用孔径大小不同的特制薄膜对 不同分子大小的抗原物质进行滤筛。

增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细 胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增 强和扩大免疫应答的效应。
多克隆抗体的制备
动物免疫
免疫动物的选择：
抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种 属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系 或亲缘关系越近，免疫效果越差。
人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、 双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；油剂：如弗氏完全 佐剂、花生油乳剂等；
纳米佐剂
多克隆抗体的制备
弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）
分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊 毛脂或吐温-80）按1：1～1：5比例混合而成；
选择性沉淀：
选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如：
核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法
多克隆抗体的制备 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小
的抗原物质进行滤筛。 电泳
多克隆抗体的制备
精分离
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
多克隆抗体的制备及 抗体活性测定
张江中试平台
多克隆抗体的制备
主要内容
• 多克隆抗体制备的基本原理 • 多克隆抗体制备的操作步骤 • 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断
多克隆抗体的制备
原理
1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞 分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中， 如无发生突变其基因是完全相同的。
多克隆抗体的制备

实验一 多克隆抗体制备
微生物与免疫教研室 周芳美
一、实验目的

掌握多抗制备的原理和过程 熟悉常用的佐剂 掌握福氏完全佐剂的作用机理和制备方法 掌握研磨法和注射器法制备免疫乳剂，掌握 制备成功的判别标准 掌握动物的免疫方法


二、实验原理

抗体：介导体液免疫的重要效应分子，是B
细胞接受抗原激活后增殖分化为浆细胞所合 成分泌的一类能与相应抗原特异性结合的、 具有免疫功能的球蛋白。


抗原

不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，
这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、
化学活性基团、立体结构、物理形状和弥 散速度等

本次实验采用抗原是生科大实验制备的LDL （至少有2mg，如量不够则用牛血清白蛋 白），用生理盐水溶解。
抗原剂量的选择

抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类，免疫 次数，注射途径，以及受体动物的种类，免 疫周期及所要求的抗体特性等而不同。
2-4周
第一次加强免疫
2-3周
第二次加强免疫
7天
效价测定
第一次免疫（基础免疫）
免疫乳剂的制备 ①研磨法: 取1.2ml佐剂加入到无菌的研钵中，缓慢加 入1ml抗原+0.2ml卡介苗混合液，每加一滴 研磨至小滴消失，边加边往同一个方向研磨， 抗原全部加入后继续研磨至乳白色粘稠的油 包水乳剂。

①研磨法


本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研 钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。 注意事项：
⑴每加一滴应研磨至小滴消失，滴加速度要 慢
⑵边加边往同一方向研磨，否则不易制成乳 白色粘稠的油包水乳剂，免疫效果就差。
剂量过低，不能形成足够强的免疫刺激 剂量过高，有可能造成耐受

多克隆抗体的制备1.蛋白纯化：重组蛋白表达形式为包涵体时，可通过切胶进行蛋白纯化。

表达重组蛋白的细菌（200ml菌液为例）4500r/min离心20min，菌体沉淀用15ml PBS 悬起，4500r/min离心15min，共清洗3次。

沉淀用4ml PBS悬起，通过超声处理进行裂解。

超声条件为超声时间3s，间隔3s，全程时间为30min，4℃（置于冰水混合物中），功率为400W。

超声后10000r/min离心5min，沉淀用500µl PBS悬起，后加入400µl 2×SDS凝胶加样缓冲液、100µl DTT混合，立即加入沸水中煮10min。

将500µl 处理后样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（每块凝胶加入500µl 样品）。

凝胶用H2O、PBS清洗后，将凝胶放入预冷的0.25M KCl中显色（或低温显色）30s左右，可见不同位置出现白色的蛋白条带。

将目的蛋白位置的凝胶条切下（尽量避免同时切下其他蛋白条带），PBS（预冷）清洗后，将胶条碾碎放入EP管中（大约占1/2），加入PBS 浸没胶粒（PBS加入量控制在可使胶粒完全溶于其中，上下颠倒可缓慢流动）。

反复冻融3次，10000r/min离心3min，吸取的上清即为纯化后蛋白（可多次离心后小心吸取上清，避免吸到胶粒）。

取纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳，鉴定蛋白的纯化度并测定其浓度。

纯化蛋白置于4℃短暂保存。

2.蛋白复性将纯化蛋白置于已处理的透析袋中（透析袋于2% NaHCO3中煮沸10min，H2O冲洗后于1mM EDTA中煮沸10min，可于4℃1mM EDTA保存），放入复性液（配方：20mM Tris-HCl pH 8.0；0.1mM氧化型谷胱甘肽；0.9mM还原型谷胱甘肽）中，4℃作用1h。

更换复性液，4℃作用2h。

再放入TE缓冲液（配方：10mM Tris-HCl；1mM EDTA pH8.0）中，4℃作用2h或过夜。

泰实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。

⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。

⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。

一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。

多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。

将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。

如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。

通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。

首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。

但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。

免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。

三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。

通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。

【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。

⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。

⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。

⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。

由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。

实验一多克隆抗体的制备（可溶性抗原）上海师范大学实验报告专业、年级生物科学班级姓名学号课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（可溶性抗原）实验日期基本原理免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。

抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。

材料(一)动物：健康雄性家兔2只(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。

(三)试剂1.灭菌生理盐水；2.纯化人IgG(10mg／ml)；3.消毒酒精及碘酒；4.弗氏不完全佐剂（FCA）5.弗氏完全佐剂（FIA）6.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：吸2ml FCA于研钵中，逐滴加入1mg／ml 纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

7. 弗氏不完全佐剂乳化抗原(FIA-IgG)的制备：吸2ml FIA于研钵中，逐滴加入1mg／ml纯化人IgG 1 ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

免疫方法1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；2.第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

3.第二次免疫：间隔14天后，于两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FIA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。

如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及鼠蹊部皮下。

4.间隔10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。

效价至少应达到1∶16以上时才能放血。

羊毛脂+液体石蜡 弗氏完全佐剂
羊毛脂+液体石蜡+卡介苗 首次免疫用完全佐剂，再次免疫用不完全佐剂。 羊毛脂、液体石蜡：油包水乳液，增加滞留时间。 卡介苗：增强免疫系统敏感性。提升抗原递呈能
力。
9
2018/3/19
多克隆抗体的分离与纯化
抗血清的制备： 取血，离心
亲和层析纯化： ProteinA/G（中性亲和，酸性解离），所有抗体。 抗原亲和纯化，特异抗体。
抗体的产生及功能
抗体的产生： B细胞被激活后分化为浆细胞并分泌抗体。
抗体的免疫学功能： 识别病原菌表面抗原 阻止病原菌侵袭体细胞 介导特异性免疫攻击
3
抗体的科研应用
免疫沉淀 免疫共沉淀 免疫印迹 免疫荧光染色 流式细胞术
2018/3/19
7
抗体的临床应用
检测待测抗原 妊娠检测 血型鉴定 病原菌鉴定
2018/3/19
JLU
免疫学实验-多克隆抗体的制备
吉林大学 生命科学学院 生物实验教学示范中心 王飞 fei@
内容提要
1
抗体的产生及免疫功能
2
抗体的临床及科研应用
3
抗体制备原理
4
ELISA法测定抗体效价
5
实验项目简介
1
2018/3/19
免疫系统概述
Immune system：protect against disease Major target: detect and distinguish pathogens
4.These bind to any antibodies which are attached to antigen. Excess conjµgante is washed away after a period of incubation

第1篇一、实验目的1. 学习多克隆抗体的制备方法；2. 掌握多克隆抗体的纯化、鉴定及效价检测技术；3. 熟悉多克隆抗体的应用。

二、实验原理多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的抗体，具有特异性强、亲和力高、产量高等特点。

多克隆抗体制备过程主要包括抗原免疫、抗体提取、纯化、鉴定及效价检测等步骤。

三、实验材料1. 实验动物：小鼠（6周龄）；2. 抗原：目的蛋白；3. 试剂：免疫球蛋白G（IgG）亲和层析柱、蛋白纯化试剂盒、SDS-PAGE凝胶、Western Blot试剂盒、酶标仪、凝胶成像系统等；4. 仪器：离心机、PCR仪、电泳仪、Western Blot仪、酶标仪等。

四、实验方法1. 抗原免疫（1）取抗原溶液，加入等体积的福氏完全佐剂，混匀；（2）将混合液注射入小鼠腹腔，免疫剂量根据抗原量和小鼠体重确定；（3）免疫后第2周，重复注射抗原和福氏不完全佐剂，加强免疫；（4）免疫后第3周，采集小鼠血清，进行抗体效价检测。

2. 抗体提取（1）将小鼠血清与蛋白提取缓冲液（pH 7.4）按1:4比例混合；（2）4℃条件下，以15000 rpm离心30分钟，收集上清液；（3）上清液经0.22μm滤膜过滤，得到抗体溶液。

3. 抗体纯化（1）将抗体溶液加入IgG亲和层析柱；（2）用蛋白纯化试剂盒进行梯度洗脱，收集抗体峰；（3）将抗体峰浓缩至适当体积，得到纯化抗体。

4. 抗体鉴定（1）SDS-PAGE电泳：将纯化抗体样品与标准蛋白进行SDS-PAGE电泳，比较分子量；（2）Western Blot：将纯化抗体样品与目的蛋白进行Western Blot检测，观察抗体特异性。

5. 抗体效价检测（1）将抗原溶液与纯化抗体溶液按一定比例混合；（2）加入底物溶液，酶标仪检测吸光度值；（3）根据吸光度值，计算抗体效价。

五、实验结果1. 抗原免疫：小鼠在免疫后第3周，血清抗体效价达到最高值。

2. 抗体提取：纯化抗体溶液经SDS-PAGE电泳，分子量与目的蛋白一致。