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浙江省X X 医院临床基因扩增检验实验室管理程序和标准操作程序(SOP)起草人：XXX批准人：XXX起草日期：2003年2月10号目录1.目录---------------------------------------------------12.C001 手套使用及左右手分开原则 ------------------------ 32. C002 实验耗材的质检方法--------------------------------53. C003 试剂的质检操作程序--------------------------------64. C004 实验室常用溶液的配制标准程序----------------------75. C005 标本的验收和保存标准程序--------------------------96. C006 样品编号操作程序---------------------------------127. C007 实验台摆放规范-----------------------------------158. C008 样品处理操作程序---------------------------------179. C009 核酸扩增荧光检测实验和结果分析标准操作程序-------1910. C010 实验有效性判断----------------------------------2311. C011 实验室室内质控标准操作程序----------------------2512. C012 实验室化学试剂及废弃物处理，生物防护措施--------3013. I001 LightCycler的使用、维护和校准操作程序-----------3314. I002 加样器使用、维护和校准的标准操作程序-------------3715. I003 离心机的使用、维护和校准操作程序----------------4216. I004 超净工作台使用和维护的标准操作程序--------------4517. I005恒温水浴箱使用和维护的标准操作程序---------------4618. I006 旋涡振荡器使用和维护的标准操作程序--------------4819. I007 冰箱使用和维护的标准操作程序--------------------4920. I008 仪器故障时的标记、放置的标准操作程序------------5021. I009 检验结果报告标准操作程序------------------------51１22. I010 实验室清洁标准操作程序--------------------------5323. M001核酸扩增荧光检测实验室规章制度-------------------5424. M002 内务制度----------------------------------------5725. M003 实验室人员的培训程序----------------------------6026. M004 实验人员行为规范--------------------------------6127. M005 抱怨处理----------------------------------------6328. M006 记录管理文件------------------------------------65２1 目的核酸扩增荧光检测实验室中，实验人员常要接触各种传染性标本（如乙肝病毒、结核杆菌等），作为一项最基本的防护措施，实验过程中必须戴手套操作，这是要遵守的原则。
PCR实验室7500SOP【】ABI 7500型核酸扩增荧光检测仪使⽤、维护、校准程序-LAB-SOP-FZSW-0111.⽬的：确保ABI7500仪器的正确使⽤及正常运⾏2.适⽤范围：美国应⽤⽣物系统公司⽣产的ABI7500实时荧光定量PCR仪3.运⾏环境：电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。
通风：仪器的通风应该没有阻挡。
温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10～30℃之间。
湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。
空间：易于操作，安全。
4.操作程序：4.1开关机程序：开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机⾯板上的绿灯亮后即可打开ABI7500系统软件，进⾏实验。
关机顺序：确认实验已经结束后，⾸先关闭ABI7500系统软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。
4.2 创建绝对定量反应板⽂件：4.2.1依次选择 Start > Programs > Applied Biosystems 7500 >Applied Biosystems 7500 SDS Software ( )，以启动 SDS 软件;或在桌⾯双击Applied Biosystems 7500 SDS Software ( )图标。
4.2.2选择 File （⽂件） > New （新建）。
4.2.3在 New Document Wizard （新建⽂件向导）窗⼝中，从 Assay （实验）下拉列表中选择Absolute Quantification (Standard Curve)（绝对定量，标准曲线）。
接受 Container （反应板类型）和 Template （模板）字段中的默认设置（即分别为 96-Well Clear（空⽩96 孔板）和 Blank Document（空⽩反应板））。
4.2.4在 Default Plate Name （默认反应板名）字段中输⼊反应板⽂件名，或接受默认⽂件名。
程序文件的管理和维护制度1. 目的：基因诊断程序文件是指导临床基因扩增检验活动的法规性文件，属内部受控文件，不得擅自修改、涂改，不得遗失、外借翻印。
为保持其现行有效和持续适应性，并确立因条件变化进行修改的程序。
2．编写依据：ISO/IEC170250－1999《检测和校准实验室能力的通用要求》因卫生部《临床基因扩增检验实验室技术验收表（check list）》是根据ISO/IEC17025而设计卫生部《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》及《临床基因扩增检验实验室工作规范》3．适应范围：临床检验标本4．内容5．编制及职责：程序文件由PCR实验室负责人主持编写、修订、审核并保持它的现行有效性。
由科主任批准和颁布实施，并负责解释。
6．发放与持有者责任：程序文件由科主任批准发放，发放与回收要登记签字，由PCR实验室负责人保管，并组织全室工作人员认真学习，了解内容，熟悉其中各项规定，程序文件执行情况纳入实验室目标管理，与奖惩挂钩。
持有者调任时，要收回该程序文件。
7．修订：科室任何工作人员均可提出对程序文件的修改建议，文件修改须经有关人员讨论，PCR实验室负责人根据条件变化提出是否修改的决定，如作小的修改则可在修改页上进行，修改文件经科主任审核批准后，并填写入程序文件修改页。
如果文件须作重大修改，PCR实验室负责人可进行改版。
新版程序文件经科主任批准后生效，收回旧版，并予以销毁，登记签字后发出新版，保证工作现场只有唯一的，最新的使用版本。
实验室内务管理及清洁制度1 目的：保证实验室日常内务管理及清洁工作顺利进行。
2 范围：实验室相关人员及医院清洁工人。
3 内务管理及清洁制度内务管理制度a.实验人员要有强烈的时间观念，按时上下班，不迟到、早退。
b.进入实验室的工作人员必须遵守实验室的单一流向的规定，禁止逆向走动。
c.非本室工作人员未经允许不得进入实验室。
d..实验室工作人员应严格遵守各项规章制度和操作规程。
荧光定量PCR实验操作SOP一、实验目的通过本操作获得准确、无误差、客观的样品基因扩增数据，用于下一步实验结果的分析。
二、实验准备：1. 进行荧光定量PCR实验操作之前，荧光定量PCR 操作实验室需紫外灯照射15 分钟，关闭紫外灯后开启通风系统抽风15分钟。
2. 进入荧光定量PCR操作实验室后需要佩戴一次性无菌口罩、无菌乳胶手套、实验中尽量避免与同事交谈，防止PCR模板污染。
3. 实验前将70%乙醇涂布于操作台及器具（移液器等）表面，两分钟后用纸巾擦除。
4. 准备实验中放污染材料的器皿、用于荧光定量PCR 实验操作的耗材（要求无菌）1ml枪头、200ul枪头、10ul枪头、1.5ml 离心管，用于荧光定量PCR 操作的试剂: 荧光定量PCR Master Mix、H2O，DNA 或cDNA 模板（注意必须在配制完荧光定量PCR所需MIX后才可以取出）.5. 一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。
6. 实验结束后移出个人专用材料（实验记录本）至个人专用区域保管；封好污染材料盛放器皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；将70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15分钟。
三、实验步骤：1. 荧光定量PCR MIX 的配置：在实验记录本上记录下要进行实验的样品内容、日期、实验样品孔信息（无特殊要求每样品每基因均按照3平行孔实验），然后计算出所需MIX 体积，分别加入后混匀分装至PCR扩增板，单孔荧光定量PCR孔Master Mix 按照20uL反应体系内容如下：Primer F: 0.8ul(0.4uM)Primer R: 0.8ul(0.4uM)2×TB Green Premix: 10ulROX: 0.4ulH2O: 6ulMIX Total: 18ulMIX配制通常准备10%冗余量。
2. MIX 配置好后混匀快速分装至PCR反应板，快速准确的将样品DNA/cDNA 小心加入装有反应液体的反应管内：DNA/cDNA Template: 2ul(<100ng)荧光定量PCR 反应总体积：20ul.3. 模板加好后, 盖紧盖子并做好标记, 写上编号（用防水笔书写）；4. 严格按照荧光定量PCR 仪的操作手册启动仪器，设置实验扩增程序（包含荧光定量PCR 扩增程序、荧光定量PCR 样品孔信息），保存文件，最好以日期及样品名称命。
目录文件名称：管理文件页码：1. PCR实验室设置及管理 (5)2. PCR实验室人员配置及管理 (7)3. 实验人员的培训程序 (8)4. 仪器设备的管理程序……………………………………………………………9 5.实验室内务管理及清洁制度 (10)6. 检验报告单管理程序 (11)7. 试剂准备区的配置、功能、管理文件 (12)8. 标本制备区的配置、功能、管理文件 (13)9. 扩增及产物分析区的配置、功能、管理文件 (14)附件：1：临床基因扩增实验室规章制度2：试剂准备区工作制度3：标本制备区工作制度4：扩增分析区工作制度标准操作、程序文件10. SLAN荧光定量扩增仪使用、维护和校准程序 (15)11.离心机使用与维护标准操作程序 (19)12.超净工作台使用与维护标准操作程序 (21)13.生物安全柜的使用与维护标准操作程序 (22)14.旋涡振荡器使用与维护标准操作程序 (23)15.加样器使用与维护标准操作程序 (24)16.加样器校准标准操作程序 (28)17.冰箱使用与维护标准操作程序 (29)18.紫外线消毒车的使用、维护标准操作程序 (30)19.恒温金属浴的使用、维护与校准标准操作程序 (31)20.传递窗的使用及维护标准操作程序 (32)21.仪器故障时的标记、放置标准操作程序 (33)22.临床标本的采集标准操作程序 (34)23.标本验收和保存的标准操作程序 (35)24.样品编号的标准操作程序 (37)25.实验台摆放规范 (38)26.核酸扩增及产物分析检测的操作程序 (39)27.乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测标准操作程序 (40)28. 结核分支杆菌（TB）核酸扩增（PCR）荧光检测标准操作程序 (42)29.检测结果报告程序 (44)30.实验结果的保存程序 (46)31.实验结果有效性判断 (48)临床实验室32.室内质量控制程序 (49)33.实验室室间质量评价标准操作程序 (50)34.实验室生物防护程序 (51)35.实验室废弃物处理程序 (52)36.实验室清洁程序 (53)37.试剂质检的标准操作程序 (54)38.实验室耗材消毒的管理程序 (55)39.实验室消耗品购买、验收和贮存程序 (56)40.实验室化学试剂贮存程序 (57)41实验室常用溶液配制标准操作程序 (58)42抱怨处理程序 (59)43.应急处理程序 (61)44.室污染紧急防范措施 (63)附图及附表附图： 1.基因扩增实验室平面图2.报告单模式临床实验室附表： 1.实验室主要负责人简历表2.实验室工作人员一览表3.主要仪器设备一览表4.拟开展的临床扩增项目表5.工作区冰箱温度记录表6.工作区温度、湿度记录表7.试剂清点及配置登记表8.标本超低温保存记录表9.PCR扩增仪运行状况登记表10.离心机运行状况登记表11.实验室清洁消毒记录表12.试剂及消耗性材料验收记录13.实验室基础工作出室记录表14.室内质控结果记录表15.PCR扩增拒受标本记录表16.PCR扩增可接受标本记录表17.生物安全柜运行状况登记表18.超净工作台运行状况登记表19: 实验结果记录表20：应急处理登记表21：抱怨记录和处理反馈意见登记PCR实验室设置及管理1. 目的：根据卫生部卫医发[2002]10号文件关于临床基因扩增检验实验室管理暂行办法及临床基因扩增检验实验室基本设置标准精神，确保PCR扩增质量和检验结果的准确性，防止实验污染、减少检验医学差错与医疗事故的发生为目的，特制订本程序。
实时荧光定量PCR （Q-PCR）SOP 流程1. 实验前需要确认的信息1.1.客户提供样本的数量、编号、种属、样本来源部位1.2.样本类型（细胞或组织等）。
1.3.保存条件。
1.4.检测方法。
1.5.检测指标。
1.6.上样顺序。
1.7.试剂是否齐全。
1.8.客户基本信息：姓名、邮件地址、电话信息等。
2. 实验开始前需要准备的试剂及仪器2.1. [实验试剂][实验仪器]3. Q-PCR 实验操作流3.1.实验原理（简单描述）通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR 反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，可通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
3.2. 实验总体注意事项3.2.1.为得到最佳的实验结果，实验人员要尽可能减少样品间交叉污染的可能，避免将核酸从一个实验带入下一个实验。
以下措施有助于避免实验污染问题：3.2.2.用稀释的漂白剂或净化剂以及75%酒精抹擦工作台。
3.2.3.理想的条件是在指定地配有紫外灯的超净室、罩式或台式超净台中准备样品，如果没有要确保操作台的洁净。
3.2.4.在样品准备和配制反应液过程中勤换手套。
3.2.5.使用专门的移液器和枪头，勤用稀释的漂白剂清洁移液器。
3.2.6.只使用PCR 级的水和PCR 专用试剂进行PCR 实验。
3.2.7.用带旋盖的EP 管稀释和配制反应液。
3.2.8.除了注意以上事项，在进行PCR 实验时，还应准备一个无模板的对照来验证有无污染发生。
3.2.9.为最小化实验结果的统计学偏差，先制备混合反应液，建议所有样本有三个重复。
大剂量包装的反应试剂，使用前进行分装，尽量减少试剂的反复冻融。
3.3. 标准步骤:基本流程：RNA 的提取→反转录成cDNA→ 引物设计→Q-PCR的扩增3.3.1. 不同样本RNA 抽提：A 组织样本，先用液氮研磨破碎或者加TRIZOL 溶液后用匀浆机破碎。
LightCycler480荧光定量PCR仪安全使用说明及SOPLightCycler480荧光定量PCR仪安全使用说明1．每次反应最后一步都必须做降温，降至40度，维持至少30秒。
2．在操作过程中，切忌戴有粉末的乳胶手套或裸手接触光学透性封板膜。
3．先开电脑和仪器，编辑程序后，再配制反应液。
加样封膜完毕，在板式离心机中1500×g（3000rpm）离心两分钟，排除气泡。
4．先开电脑再开仪器，先关仪器再关电脑。
打开电脑，并打开LightCycler480软件，然后打开LightCycler480仪器后方的电源开关，仪器与电脑软件接通后进行自检，仪器正面右边两盏桔黄色的灯会闪烁。
自检完毕后，左边的灯会变绿，右边的灯仍为桔黄色。
这时按一下灯右边带双箭头的开关，仪器的载板器会自动伸出，将准备好的反应板放入载板器中（反应板的切角在右下角）。
再按一下带双箭头的开关，仪器的载板器会自动缩入仪器内，此时仪器能自动检测到反应板，原来呈桔黄色的灯会变绿，软件中Start Run按钮也同时变为激活状态。
5．设定完实验程序并编辑完样本后（样本信息可以在实验完成后编辑），点击软件中Start Run按钮，运行实验。
6．软件界面上出现Run Complete….标识时，说明实验运行完毕，按一下仪器上带双箭头的按钮，使载板器伸出，取下反应板，再按一下带双箭头的按钮，使载板器缩回，关闭LightCycler480仪器后方的电源开关，在电脑上分析实验数据。
7．分析完实验数据后保存结果，打印报告，并关闭电脑及总电源。
实验员在离开PCR扩增区时带走用完的反应板。
维护SOPLightCycler 480是一台免维护的仪器。
做任何维护工作前，须确认主机电源已被关闭。
预防性维护：1．检查LightCycler 480主机两侧与背后空间，确保无任何阻碍空气流通的物品，包括书本、纸张或窗帘等；2．若主机表面和桌面有灰尘，用不起毛的软布蘸少量清水擦拭干净。
荧光定量pcr操作流程
荧光定量PCR技术是一种常用的实时PCR技术，可以检测DNA和RNA的含量。
它被广泛应用于病毒检测和转基因研究等。
本文将介绍荧光定量PCR技术的操作流程。
首先，在实验室中准备所需要的实验材料，包括样本，PCR引物，模板DNA，dNTP，DNA聚合酶和实时PCR荧光探针，缓冲液，水等。
其次，将样本进行DNase处理，解析得到模板DNA，将模板DNA 用合适的容量放入每个实验管中，以此来建立实验。
然后，将PCR反应液配制好，将与模板DNA一起放入PCR反应管中，包括PCR引物，dNTP，DNA聚合酶，实时PCR荧光探针，缓冲液，水等。
接下来，将放入PCR反应管中的反应液放入PCR设备里进行反应，PCR反应完毕分为一系列步骤，包括反应温度的上升，溶解和延迟，合成，放大等。
其中最重要的步骤是DNA聚合酶与模板DNA的结合，可加速DNA的复制。
最后，PCR反应完毕后，将反应管中的反应液进行荧光定量，将荧光的强度和弱度绘制成曲线，而反应体系中的DNA含量可以用曲线来测定，从而得出DNA的数量。
以上就是荧光定量PCR技术的操作流程。
它可以检测DNA和RNA 的含量，是实验室中常用的实时PCR技术。
它具有灵敏度高，操作简便，时间节约，可重复性好，可用于病毒检测和转基因研究等。
实时荧光定量PCR (Q-PCR)SOP流程1.实验前需要确认的信息1.1.客户提供样本的数量、编号、种属、样本来源部位。
1.2.样本类型（细胞或组织等）。
1.3.保存条件。
1.4.检测方法。
1.5.检测指标。
1.6.上样顺序。
1.7.试剂是否齐全。
1.8.客户基本信息：姓名、邮件地址、电话信息等。
2.实验开始前需要准备的试剂及仪器2.1.[实验试剂][实验仪器]3.Q-PCR实验操作流3.1.实验原理（简单描述）通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR 反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，可通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。
3.2.实验总体注意事项3.2.1.为得到最佳的实验结果，实验人员要尽可能减少样品间交叉污染的可能，避免将核酸从一个实验带入下一个实验。
以下措施有助于避免实验污染问题：3.2.2.用稀释的漂白剂或净化剂以及75%酒精抹擦工作台。
3.2.3.理想的条件是在指定地配有紫外灯的超净室、罩式或台式超净台中准备样品，如果没有要确保操作台的洁净。
3.2.4.在样品准备和配制反应液过程中勤换手套。
3.2.5.使用专门的移液器和枪头，勤用稀释的漂白剂清洁移液器。
3.2.6.只使用PCR级的水和PCR专用试剂进行PCR实验。
3.2.7.用带旋盖的EP管稀释和配制反应液。
3.2.8.除了注意以上事项，在进行PCR实验时，还应准备一个无模板的对照来验证有无污染发生。
3.2.9.为最小化实验结果的统计学偏差，先制备混合反应液，建议所有样本有三个重复。
大剂量包装的反应试剂，使用前进行分装，尽量减少试剂的反复冻融。
3.3.标准步骤:基本流程：RNA的提取→反转录成c DNA→引物设计→Q-PCR的扩增3.3.1.不同样本RNA抽提：A组织样本，先用液氮研磨破碎或者加TRIZOL溶液后用匀浆机破碎。
一般需要客户提供动植物组织30-50mg（如黄豆大小），如果组织完整需要先将其剪碎至小块状以便于匀浆，加1mlTRIZOL，根据提供的样本量以此增加或减少加入的TRIZOL量。
租用平台的匀浆机，在冰上操作，用PBS清洗匀浆机机头，用纸擦干，伸入1.5mlEP管至TRIZOL溶液2/3处每次匀浆3-5秒，防止机头过热，直到明显组织块均破碎，每换一个样本匀浆都要清洗机头。
B全血样本，先以1:3-1:5（1ml样本加入3-5ml裂解液）加红细胞裂解液至样本中，室温静置10min，3500转6min，弃上清后加TRIZOL溶液。
一般全血样本2-3ml对应1mlTRIZOL。
C细胞样本，细胞一般接种孔板时用细胞计数板计数，1*105-1*106，细胞长到70-80%以上。
贴壁细胞吸掉旧的培养基，用PBS清洗两遍，加入1-2mlTRIZOL铺满孔板或培养瓶瓶底，几分钟后贴壁细胞脱落裂解完全加到EP管中。
悬浮细胞吸到离心管中1200转离心2-3min，吸去废培养基加入1-2mlTRIZOL。
操作流程1)以加1ml TRIZOL溶液为例，充分混匀，静置10min。
2)4℃12000g离心10min，吸取上清放入新的EP管中，不要吸到沉淀。
3)加入200ul氯仿剧烈振荡15S，然后室温静置5min。
4)4℃12000g离心15min，离心液体分三层（下面是氯仿，中间是油脂，上面是含RNA的溶液），小心吸取上层液体，转移到一个新的EP管中，不要吸取到油脂。
5)加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10分钟（此步不要太剧烈震荡，上下颠倒10下左右即可）。
6)4℃12000g离心10min，弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤两次（第一次要把沉淀全部旋起）。
7)4℃7500g离心5min，弃上清，沉淀干燥，风干后用15ul 或20 ul DEPC水溶解得到RNA原液。
3.4.RNA浓度测定。
3.4.1.RNA纯度鉴定在平台使用微量核酸蛋白检测仪鉴定得到RNA的浓度，纯度指标（浓度以ng/ul为单位，纯度用A260/A280的比值表示，具体测定流程由平台的工作人员操作并打印出结果详单。
3.4.2.反转录体系操作流程Step 1：基因组DNA去除（一般根据引物设计是否跨内含子来决定是否去除基因组DNA，如果引物设计跨内含子则不需去除，直接按照Step 2往下操作如何去除），去除基因组DNA按以下体系，在无核酸酶的离心管中加入以下组分Step 2：在无核酸酶的离心管中加入以下组分（如果紧接第一步反应则直接加组分至原离心管中）然后在冰上迅速冷却2min；Step 3:在上述体系中再加入如下成分：cDNA产物在-20℃保存。
3.5.引物设计（具体操作流程参见附件的视频教程）引物使用Primer5.0 软件设计，由invitrogen公司合成。
引物设计原则：1)PCR扩增产物长度：80-150bp最为合适（可以延伸至300bp）。
2)引物长度一般在17-25碱基之间，上下游引物不能相差太大。
3)G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。
4)TM值在58-68度之间。
上下游引物的TM值不能相差太大。
5)碱基要随机分布，尽量均匀。
3′端不可修饰，而且要避开AT，GC rich的区域，避开T/C或A/G连续结构（2-3个）。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物末端碱基为G或C。
6)引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
7)一般可设计2-3对引物可供选择。
预实验选出最佳引物。
8)引物特意性验证，用blast（操作步骤见附件中的教程）。
3.6.Q---PCR反应两步法反应如下：3.7.数据分析定量结束后，设置阈值和基线，得出Ct值，Ct值是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，ΔCt实验组=(Ct，目的基因-Ct，管家基因)实验组，ΔCt对照组= (Ct，目的基因-Ct，管家基因)对照组，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，2-ΔΔCt 即为两组的差异。
4.实验结果的标准4.1.RNA的质量（包括浓度和纯度）验证：浓度以ng/ul为单位，样本组织的提取浓度>200，细胞提取的浓度>30，纯度一般A260/A280在1.8-2.0之间为标准，实际实验范围可适当放宽为1.7-2.1之间。
严格按照提取RNA 步骤，减少盐离子的影响。
4.2.溶解曲线，扩增曲线4.2.1.溶解曲线主要是看是否存在非特异性扩增，如果是单峰，且出峰位置是需要的退火温度，可以确定扩增的产物是单一，特异性的，则该结果可用（图1为标准的溶解曲线）。
如果出现多峰或退火温度不对，则可能是出现引物二聚体或者非特异性扩增。
图1 .溶解曲线4.2.2.扩增曲线图中x-轴表示PCR循环数，y-轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。
扩增曲线显示2个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。
在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。
然而，随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应。
此时，产物增长速度变慢，反应进入平台期。
反应最初，虽然产物是指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。
当累积了足够的扩增产物，可以产生可检测的荧光信号时，这个循环数叫初始循环数，即CT。
曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。
各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近（图2为标准扩增曲线）。
可疑样本是指曲线在37个Ct值后出现上涨且平台趋势不明显或上涨幅度比较低的标本。
4.2.3.CT值CT值范围一般在15-35这个范围内比较合适，内参基因的CT值一般在15-20，目的基因的CT值在35内都是可信的，超过35个CT那么就算它没有扩增了，如果15之前起峰，那么就是模板浓度太高所引起的。
所有样本做三个平行重复，重复之间的CT值正负0.5之间可用。
5.实验结果的提供形式5.1.实验报告（一般为实验流程）实验结果（标准模板可为excel格式，包含以下几个内容，见提供的模板）⒈标本对照表（一般同一个客户只有标本编号不同，其他都相同）序号标本种属标本形式标本来源原始标本编号标本数量保存条件检测方法检测指标1232. 样本浓度检测信息样品编号浓度ng/ul260/280A 1034.86 1.99B …………图2.扩增曲线3.引物序列信息6.各检测指标Ct值及△Ct等（包括目的基因和内参）7.扩增曲线和溶解曲线（目的基因和内参）8.数据分析包括：8.1.每组结果分析的柱状图8.2.误差线8.3.对整个实验结果的初步总结（就是每个组的表达情况，以及与其他组的区别）三、实验中遇到的常见问题及解决方案1.Q：RNA的质量不好，浓度低，纯度不好A ：浓度低可能是提供的样本量少，或者提取过程中有污染导致RNA降解。
A260/A280的比值在1.8-2.0之间，太低说明有蛋白污染，太高说明核酸有降解。
如果样本量少，可适当减少TRIZOL溶液，提取中需要的EP管，枪头均确保是无RNA酶的，并且操作过程严格按照步骤所写，最好可以在超净台中操作，条件不允许时，也需保证操作台的清洁，操作人员需带上口罩。
2.Q：无CT值（信号）出现A ：1)反应循环数不够。
一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2)引物降解。
可通过PAGE电泳检测其完整性。
3)引物的设计优化。
4)模板量不足。
对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
5)模板降解。
避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
3.Q：CT值出现过晚A：1) 1.扩增效率低，反应条件不够优化。
2)提取液的残留会抑制PCR反应，提取RNA过程中要减少提取液的残留；3)设计更好的引物；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
4) 2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
4.Q：熔解曲线不止一个主峰A：1)引物设计不够优化。
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2)引物浓度不佳。
适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3)镁离子浓度过高。
适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
4)模板有基因组的污染。
RNA提取过程中避免DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
5)产物太长，一般采用80-150bp的产物长度。
5.Q：实验重复性不好A：1).加样不准确。
2)仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。
3)模板浓度低。
样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。
