微生物实验思考题参考答案及知识要点

实验一显微镜的使用和细菌简单染色六、思考题1.用油镜观察时应注意哪些问题？由于油浸镜的工作距离很短(0.19mm左右)，故使用时必须特别小心。

在低倍镜找到要观察的部位以后，将镜筒升起，在标本上加一滴香柏油，转换油镜头，从侧面注视，用粗调螺旋将镜筒小心下降，使油镜头浸入油滴，直到几乎与标本接触为止(注意切勿压在标本上，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头)。

从目镜观察，先用粗调螺旋徐徐升起(只准上升镜筒，不能向下调节)，当视野中有模糊的标本物像时，改用细调螺旋调节，直到标本物像清晰为止，如转动粗调螺旋已使镜头离开油镜，应重新调节，直至调到看清物像为止。

3.什么是物镜的同焦现象？一般情况下，当五项在一种物镜中已清晰聚焦后，转动转换器将其它物镜工作时，物像基本保持在聚焦状态。

实验二革兰氏染色法六、思考题1．哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？菌龄、图片厚度、染色均匀度、脱色时间、脱色均匀度等。

其中脱色时间是关键。

2．革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老？为什么？菌龄太老，其中的部分细胞可能已经死亡或自溶，造成细胞壁的通透性增强，染色结果可能出现假阴性。

3．革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？不能。

初染前加碘液的话就会先和染料结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞壁进入细胞质膜，达不到初染效果。

4.不经过复染，能否区别革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌？可以。

因为脱色后G+是紫色的而G-是无色的，所以已经可以区分了。

但是如果不经复染的话，镜检时看不清G-的细胞形态。

5.制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？涂片、固定、脱色6.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？因为如果制片和油镜镜头之间有水层，透过载玻片的光线就会发生折射而不能完全进入镜头，从而降低视野的亮度；另外，由于水层的折射，会降低显微镜的分辨率，造成图像不清晰。

7.如果图片未经热固定会出现什么问题？加热温度过高、时间过长又会怎样？实验四放线菌、酵母菌、霉菌形态观察六、思考题1．酵母菌死活细胞观察中，美兰液有何作用？美兰的氧化态为蓝色，还原态为无色。

食品·微生物学实验思考题答案食品微生物学技术思考题答案1.如何区别高倍镜和油镜答：（1）油镜更接近标本片（2）油镜与标本间的介质是香柏油（3）油镜刻有“oil”或“Hi”字样，也刻有一圈红线或黑线为标记。

2．为什么在使用高倍镜及油镜是应特别注意避免粗调节器的错误操作答：使用高倍镜及油镜时镜头距离标片很近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的错误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。

一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。

3.用油镜观察时应注意哪些问题在载破片和镜头之间加滴什么油起什么作用答：（1）应该先用擦镜纸将镜头擦干净，以防止上次实验的污染，操作时，先低倍再高倍，用完要擦掉油。

（2）在转换油镜时，从侧面水平注视镜头注视镜头与玻片的距离。

使镜头浸入油中而不以压破载玻片为宜。

（3）从目镜内观察，把孔径光阑开到最大，使其明亮。

然后用微调将镜台下降，直至视野内物象清晰。

如油镜已离开油面仍未见物象，需重复操作。

加的是香柏油。

作用是增加折光率，增加显微镜的分辨率。

4.在调节焦距时，往往出现一些疑似观察标本的物象点，物象点可能是目镜或物镜上的杂质，也可能是标本片上的观察对象，如何通过操作判断这些物象点是否在标片上答：移动标本片，看物象点是否移动，如果不移动，则不在标本片上。

5．如果涂片未经热固定或固定温度过高、时间过长，会出现什么现象答：固定时间是杀死菌体，使菌体蛋白质凝固黏附于载玻片上，增加菌体对染色剂的结合力，易于着色。

但是如果没固定，不容易着色，且容易被清水冲走。

温度过高会使细胞收缩变形，时间过长会导致菌体变形或形态破坏，难以着色，从而导致难以着色。

6.为什么要培养18-24h的细菌菌体进行革兰氏染色答:此时菌体进入比较活泼的繁殖生长期，细胞壁比较好着色。

若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应，关键在于细胞壁的通透性的改变。

如果菌龄过老，不便于显微镜下观察时阴性还是阳性菌。

《微生物学检验》复习思考题参考答案绪论1、微生物的概念、特点，微生物分哪三型八大类？微生物：是存在于自然界的一大群体形微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须藉助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物。

包括细菌、病毒、真菌等三类。

特点：⑴个体微小，结构简单⑵比表面积大、吸收多、转化快⑶代谢旺盛，繁殖迅速⑷种类繁多，分布广泛⑸适应力强，容易变易按结构和组成不同，可分为三型八大类⑴非细胞型微生物：病毒⑵原核细胞型微生物（广义的细菌）：包括细菌（狭义的细菌）、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体及放线菌。

⑶真核细胞型微生物：真菌2、简述临床微生物学检验的主要任务有哪些？⑴研究感染性疾病的病原体特征⑵提供快速、准确的病原学诊断⑶指导临床合理使用抗生素⑷监控医院感染3、简述临床微生物学检验的目的和核心任务是什么？临床微生物学检验的目的是为感染性疾病提供微生物学诊断，以达到治疗、控制和预防感染性疾病的扩散。

微生物学检验的核心任务是快速、准确地进行病原学诊断和药敏检测，为临床感染性疾病的诊断、治疗提供依据。

4、简述临床微生物检验的原则。

⑴确保临床标本可靠；⑵全面了解机体正常菌群；⑶保证检验质量、快速准确提供信息；⑷微生物学定性、定量和定位分析，并结合病情（三定一结合）；⑸加强与临床联系。

5、填空题⑴根据微生物能耐受不同的温度，人们常用、、和来保存菌种。

细菌的具有高度抗热性，这常给消毒带来困难。

⑵生物学性状基本相同的细菌群体构成一个菌种，不同来源的同一菌种的细菌称为该菌的不同_____；性状相近关系密切的若干菌种构成____；具有某种细菌典型特征的菌株称该菌的____。

⑴普通冰箱（4 ºC）；低温冰箱（-20 ºC）；干冰（-70 ºC）；液氮（-196 ºC）；芽胞⑵菌株、菌属、标准菌株（典型菌株）细菌的形态与结构1、名词解释：细菌L⑴细菌L型：是指细胞壁缺陷型的细菌。

微生物实验思考题参考答案及知识要点一．酵母菌形态观察及死活细胞鉴别1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同对酵母菌死细胞数量有何影响?是分析其原因。

美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。

用美蓝对酵母的活细胞进行染色时,由于细胞的新陈代谢作用,细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。

因此,具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色,借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。

美蓝浓度高了,代谢不太活跃的活细胞也会被染色,从而使观察到的死细胞较多,活细胞较少；反之，则代谢微弱的细胞也能还原美蓝,不被染色，从而使观察到的死细胞较少，活细胞较多。

二.细菌的简单染色和革兰氏染色1.革兰氏染色中那一步是关键？为什么？你是如何操作的?革兰氏染色的关键步骤是:乙醇脱色(是脱色时间）。

如果脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。

脱色时间的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱色是应当控制速度，脱色时间一般为20—30s)。

2. 固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同?自然死亡的菌体本身已经部分自溶,结构已经改变。

固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。

３. 不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？能。

在酒精脱色后,不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋),被酒精脱色为革兰氏阴性菌。

最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。

4．涂片为什么要固定,固定适应注意什么问题?a 杀死细菌并使菌体黏附与玻片上;b增加其对染料的亲和力。

固定时应注意：手持玻片,菌膜朝上,在微火过3次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜),固定时应尽可能维持细胞原有形态,防止细胞膨胀或收缩。

三. 霉菌、放线菌的形态观察1．镜检时，如何区分基内菌丝与气生菌丝？一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状,比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮,可看到横隔膜,继而断裂成球状或杆状小体。

微生物学思考题答案1、你如何使你的朋友相信微生物不仅仅是一种病原？尽管目前微生物仍在严重威胁人类的生存，但另一方面，我们必须强调，大多数微生物对人类是无害的。

事实上，大多数微生物对人类社会还有巨大的价值。

整个农业系统在许多方面都依赖微生物的活动。

许多主要的农作物属于豆科植物，它们的生长同专一性细菌紧密相连，这些细菌可在植物的根部形成根瘤结构。

根瘤结构中，大气中的氮转变成可用于生长的氮化物。

根瘤细菌的固氮活动，减少了昂贵肥料的需要。

微生物在农业上的另一个重要性在于，某些动物是反刍动物，这些主要的农业动物具有瘤胃，微生物在瘤胃中进行消化。

没有这些微生物牛羊的饲养是不可能的。

植物营养方面，微生物在碳、氮、硫这些重要营养成分的循环起着关键作用。

土壤和水中的微生物可见这些元素转化成植物容易利用的形式。

微生物与食品的关系，不仅仅是产生腐败变质等不利影响。

奶制品的制造至少部分是借助微生物的活动，包括乳酪、酸乳酪和黄油，都是主要的具有经济价值的产品。

泡菜、腌制食品和一些腊肠也归功于微生物的活动。

可烘焙的食品及乙醇的制造也基于酵母菌的发酵。

微生物在能源生产方面也起着重要作用。

天然气是细菌作用的产物，由甲烷细菌代谢产生。

光营养的微生物能够收集太阳能生产生命有机体中的储存物――生物量。

废物如生活垃圾、剩余谷物、动物废料等通过微生物转化微生物燃料――甲醇和乙醇。

利用微生物清理被人类活动污染的大气――生物整治。

利用微生物降解油污、溶剂、杀虫剂和其他环境污染物。

通过基因操纵技术，能在微生物种生产出人类胰岛素。

利用基因组学方法搜索带几百个目的蛋白的基因蓝图，然后将它们转入到合适的受体中由于生产重要的、有商业价值的蛋白质。

在自然界中，它无限小，但作用无限大。

2、胡克和列文虎克对微生物学的贡献有那些？科恩对微生物学的贡献有那些？1665年，罗伯特.胡克描述了霉菌的子实体结构，因此他是第一个描述微生物的人。

1676年，列文虎克在研究辣椒水渗出的过程中发现了细菌，因此他是首次描述细菌的人。

微生物思考题及答案1、何为硫磺样颗粒，有什么临床意义？答在患者病灶组织和瘘管中流出的脓汁中，可找到肉眼可见的黄色小颗粒，称硫磺颗粒，这种颗粒是放线菌在组织中形成的菌落。

用于放线菌的微生物学诊断。

（P184）2、简述白喉外毒素的产生、作用机制。

答当b棒状杆菌噬菌体侵袭无毒白喉棒状杆菌时，其编码外毒素的tox基因与宿主菌染色体整合，无毒白喉棒状杆菌则成为产毒的白喉棒状杆菌而产生白喉毒素。

作用机制：此毒素是一种毒性强、抗原性强的蛋白质，由A和B 肽链经二硫键连接而成。

A肽链是白喉毒素的毒性功能区，抑制易感细胞蛋白质的合成。

B链上有一个受体结合区和转位区，但能和心肌细胞、神经细胞等表面受体结合，协助A链进入这些易感细胞。

细胞内蛋白质的合成过程中，需要延伸因子1和延伸因子2.当白喉毒素A链进入细胞后可促进辅酶I上的腺苷二磷酸核糖与延伸因子2结合，结果延伸因子2失活，使蛋白质无法合成。

（P174）3、简述结核分枝杆菌形态染色，生长特点。

答形态染色：细长略带弯曲杆菌，齐-尼抗酸染色法阳性。

生长特点：生长缓慢，3-4周后可见颗粒、结节或菜花状，乳白色或米黄色菌落，不透明。

（P150）4、简述结核菌素试验的原理，结果判断及意义。

答原理：是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起迟发性超敏反应（Ⅳ型变态反应）从而判定机体对结核有无免疫力的一种试验。

结果判断及意义：阴性反应：无硬结者或直径小于5mm,表示未感染过结核分枝杆菌，也未曾接种过卡介苗。

阳性反应：直径大于5mm,表示感染过结核分枝杆菌或接种过卡介苗，机体对结核分枝杆菌有一定的免疫力。

强阳性反应：直径大于15mm,表示体内可能有活动性结核感染。

（P153）5、简述结核分枝杆菌原发感染与原发后感染的特点。

答原发感染：多发生于儿童；原发综合征：原发灶、淋巴管炎、肺门淋巴结肿大；转归原发后感染：多发生于成人，多为内源性感染；病灶多局限，易形成结核结节，发生开发性肺结核的机率大（P152）6、支原体的定义。

实验一显微镜的使用及微生物大小测定的方法二、基本原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，它们由机械装置和光学系统两大部分组成。

物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。

其中油镜的放大倍数最大，对微生物学最为重要。

微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。

微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具—测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。

其中镜台测微尺并不直接用来测量细胞大小，而是用于校正目镜测微尺每格的相对长度。

目镜测微尺每小格所代表的实际长度因显微镜的不同放大倍数而异，因此用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微格数，即可计算出细胞的实际大小.两重合线间镜台测微尺格数×10目镜测微尺每格长度=两重合线间目镜测微尺格数思考题1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？答（1）应先用摖镜纸将镜头摖干净，以防止实验的污染。

使用油镜时，应先用低倍镜再用高倍镜，然后再是油镜，用完之后也要用摖镜纸将油镜摖掉。

（2）滴加香柏油（3）作用是增加折射率，即增加了显微镜的分辨率，油的折射率和分辨率成反比，同时与波长成正比。

2、影响显微镜分辨率的因素有哪些？答：显微镜的分辨率指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力，最小分辨距离越小，分辨率越高，最小可分辨率距离=λ／2NA且NA=n.sin,所以，分辨率由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定，当然还有介质的折射率。

3、为什么要换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？答：不同放大倍数，目镜测微尺每小隔所代表实际长度不一样，必须用镜台测微尺进行重新校正，这样目镜测微尺测量的长度才是目前状态的准备长度。

4、在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一微生物的大小时，其测定的结果是否相同？为什么？答：相同的，不同的放大倍数，目镜测微尺每小格所代表实际长度不一样，必须重新校正，才能得到目前状态的准确长度。

微生物思考题及参考答案1.用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比.2.什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。

利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。

3.影响显微镜分辨率的因素有哪些？答：物镜的NA值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长.4.美蓝染色液作用时间的不同,对酵母菌死细胞数量有何影响,试分析原因答：会造成更多的死细胞，在显微镜下观察，活的是透明无色，衰老的是淡蓝色，死亡的是蓝色，如果美蓝染色液作用时间过长，会造成细胞脱水死亡并渗透染液，影响实验结果。

5.镜检时如何区分放线菌基内菌丝，气生菌丝以及孢子丝一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮，可看到横隔膜，继而断裂成球状或杆状小体。

6.在进行细菌涂片时应注意哪些环节1、载玻片应该冷却后再涂片。

2、如果是涂布液体，可以用毛细管或接种环滴一小滴，然后轻轻抹开，一圈足够。

3、如果是涂布菌落或菌苔，应该在载玻片上先滴一滴水，再将菌落或菌苔涂布上去，接种环的尖蘸一点点即可。

4、为了节省时间，可以将干燥和热固定合并成一步。

但是应该避免高温，因为温度一高，细菌会变形。

5、染色时间视染色液种类而定。

如结晶紫只需几十秒，亚甲基蓝则需一到两分钟。

6、冲洗时，水流不能太大，而且尽量避免水流直接冲在涂片上。

7、冲洗后干燥，可以用酒精灯加热以节省时间，同样的，应该避免高温，因为温度一高，细菌会变形。

微⽣物实验问题与答案.微⽣物实验问题与答案⼀、光学显微镜的操作及细菌、放线菌个体形态的观察1、为什么油镜的放⼤倍数⽐普通物镜⼤？答：油镜能减少光的折射，进⽽提⾼视野的亮度；通过提⾼显微镜的数值⼝径增加显微镜的分辨⼒。

2、数值⼝径的表达公式？答案：N.A=n ×sin α，n为介质折射率；α为光线最⼤⼊射⾓的半数。

3、显微镜数值⼝径与分辨⼒的关系？答案：分辨⼒是指显微镜能辨别两点之间最⼩距离的能⼒，它与光的波长成反⽐，与数值⼝径成正⽐。

4、油镜的使⽤与普通物镜有何不同？答案：油镜必须借助于光折射率等于或接近于玻璃的试剂，如⾹柏油等才能使⽤，⽽普通物镜则不需要；油镜是由100×物镜与⾹柏油构成，⽽普通物镜则限于10×物镜、40×物镜等。

5、使⽤油镜时应特别注意什么？答案：上下调节镜头时应使⽤微螺旋，否则容易损坏镜头；应使油镜始终浸泡在⾹柏油中，否则就不是油镜；使⽤完毕后，必须⽤搽镜纸沾取⼆甲苯等有机溶剂搽去残留的油迹，否则会玷污油镜。

6、什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？答：在⼀般情况下，当物像在⼀种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到⼯作位置进⾏观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。

利⽤这种同焦现象，可以保证在使⽤⾼倍镜或油镜等放⼤倍数⾼、⼯作距离短的物镜时仅⽤细调节器即可对物像清晰聚焦，从⽽避免由于使⽤粗调节器时可能的误操作⽽损坏镜头或载玻⽚。

7、根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微⽣物的⼤⼩,选择不同的物镜进⾏有效地观察答：细菌⽤油镜，真菌⽤⾼倍镜。

都是先⽤低倍镜找到⽬标后，再⽤⾼倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。

答：放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较⼤，⽤放⼤40倍的物镜就可以看了，细菌⼩，要⽤放⼤1000倍的物镜看，感觉还很⼩。

病毒那就要⽤电⼦显微镜看了。

⼆、微⽣物染⾊1、单染⾊的原理是什么？答案：主要基于微⽣物细胞能与各种染料进⾏不同程度地结合。

绪论1、你如何使你的朋友相信微生物不仅仅是一种病原？尽管目前微生物仍在严重威胁人类的生存，但另一方面，我们必须强调，大多数微生物对人类是无害的。

事实上，大多数微生物对人类社会还有巨大的价值。

整个农业系统在许多方面都依赖微生物的活动。

许多主要的农作物属于豆科植物，它们的生长同专一性细菌紧密相连，这些细菌可在植物的根部形成根瘤结构。

根瘤结构中，大气中的氮转变成可用于生长的氮化物。

根瘤细菌的固氮活动，减少了昂贵肥料的需要。

微生物在农业上的另一个重要性在于，某些动物是反刍动物，这些主要的农业动物具有瘤胃，微生物在瘤胃中进行消化。

没有这些微生物牛羊的饲养是不可能的。

植物营养方面，微生物在碳、氮、硫这些重要营养成分的循环起着关键作用。

土壤和水中的微生物可见这些元素转化成植物容易利用的形式。

微生物与食品的关系，不仅仅是产生腐败变质等不利影响。

奶制品的制造至少部分是借助微生物的活动，包括乳酪、酸乳酪和黄油，都是主要的具有经济价值的产品。

泡菜、腌制食品和一些腊肠也归功于微生物的活动。

可烘焙的食品及乙醇的制造也基于酵母菌的发酵。

微生物在能源生产方面也起着重要作用。

天然气是细菌作用的产物，由甲烷细菌代谢产生。

光营养的微生物能够收集太阳能生产生命有机体中的储存物——生物量。

废物如生活垃圾、剩余谷物、动物废料等通过微生物转化微生物燃料——甲醇和乙醇。

利用微生物清理被人类活动污染的大气——生物整治。

利用微生物降解油污、溶剂、杀虫剂和其他环境污染物。

通过基因操纵技术，能在微生物种生产出人类胰岛素。

利用基因组学方法搜索带几百个目的蛋白的基因蓝图，然后将它们转入到合适的受体中由于生产重要的、有商业价值的蛋白质。

在自然界中，它无限小，但作用无限大。

2、胡克和列文虎克对微生物学的贡献有那些？科恩对微生物学的贡献有那些？1665年，罗伯特.胡克描述了霉菌的子实体结构，因此他是第一个描述微生物的人。

1676年，列文虎克在研究辣椒水渗出的过程中发现了细菌，因此他是首次描述细菌的人。

实验一细菌涂片的制备及革兰氏染色1、制备细菌染色标本时应注意什么？涂片不要太厚，要均匀，固定的时候一定按照要求，快速，染色脱色时间要控制好2涂片2、固定的意义何在？固定时应注意什么问题？固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。

此制片可用于染色。

3、革兰氏染色的原理及染色成败的关键？机制：结果为阳性（紫色）和阴性（红色）两大类，与细菌细胞壁的结构组成有关。

细菌经结晶紫初染和碘液媒染之后，所有细菌都染上不溶于水的结晶紫与碘的复合物，呈深紫色；阴菌的细胞壁含脂类较多，当以95%乙醇脱色时，脂类被乙醇溶去，而肽聚糖少，且交联疏松，不易收缩，在细胞壁中形成的孔隙较大，复合物极易被乙醇溶解洗脱，最后被红色的染料复染成红色；阳菌与阴菌相反，复合物不能脱出，经红色染料复染后仍为紫色。

｛（碱）结晶染色→碘媒染→酒精脱色→①可脱为G+②不脱为G—｝关键：革兰氏染色四大基本步骤：结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色沙黄复染其中乙醇脱色是关键因为如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性实验二培养基的制备1、为什么在校正培养基pH时,少量培养基时用0.1摩尔每升氢氧化钠,而大量时用1摩尔每升氢氧化钠?少量培养基在校正时，需要的氢氧化钠少，所以用浓度底的校正的结果会更准确。

而大量的就需要大量的，如果还用浓度低得话，结果会准确，但是工作量极大，而换1mol/L的话，结果误差不会很大，综合考虑：在校正大量的培养基时，应使用浓度高的。

2、为什么肉汤培养基在高压灭菌之前ph要略调高些？牛肉膏中有些物质在加热后会分解出酸性物质导致pH下降。

因此初始pH 应比需要值高0.2左右。

3、试述普通肉汤和琼脂培养基的主要用途？琼脂培养基是在实验室做实验时专门配置的，一般植物源琼脂培养基适用于培养真菌一类的微生物；动物源琼脂培养基适用于细菌类微生物培养。

油镜便于观察的原理是什么?用油镜观察时在油镜与载玻片之间加入了和玻璃折射率相近的香柏油，使进入透镜的光线增多，视野亮度增强，使物象明亮清晰。

1.细调节器每旋转一周使镜筒上升或下降0.1mm.一。

培养基的配制原理：微生物的生长发育都有一定的营养需要，培养基即人工培养物，为其生长发育提供所需营养的基质。

培养基配制好以后必须经过灭菌方能用于分离培养微生物实验。

一次培养基的配制和灭菌是微生物实验室中最基本的操作，通过本次实验学习微生物实验室中常用培养基的配制方法和灭菌方法。

1.称药品的钥匙不要混用称完药品应及时盖紧瓶盖，因为某些成分如蛋白胨极易吸水潮解调PH时要小心操作，避免回调。

配制培养基应注意哪些问题？要选定合适的培养基;培养基成分要称量准确；PH要适宜；灭菌要严格。

培养基配制完成后为什么要立即灭菌？已灭菌的培养基如何进行无菌检查？防止细菌污染培养基一旦细菌污染了培养基，由于培养基有丰富的营养物质，细菌会段时间内大量产生这样子就会跟培养物争夺营养物质，另一方面，细菌生长过程中会产生有毒物质致使培养物死亡。

放在37℃的恒温箱中一两天后，培养基上没有生长任何微生物的就可以使用（若有微生物则是以菌落出现的肉眼可以看见）二。

细菌的单染色技术原理：单染色法师利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

在中性，碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。

碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易于带负电荷的细菌结合而使细菌着色。

制备染色标本时的注意事项？选择合适菌龄的细菌；固定时避免火焰直接烘烤破坏细菌形态；染色时间要适宜；水洗时水不能直接冲在涂片处。

制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？油和水之间会分层，油就不能与标本接触还有光会发生折射等等原因，这样不利于油镜观察三。

细菌的革兰氏染色法原理：细菌先经碱性染料结晶紫染色，而经碘液媒染后用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，为G+，有的可被脱去，为G-.1.革兰氏染色成败的关键是乙醇脱色。

1培养基配好后，为什么必须立即灭菌？灭菌是杀灭培养基中本身的原著菌或在空气中附着的杂菌,更好的让目标菌生长，如果存放时间长不进行灭菌培养基内的微生物就会在基内发酵生长，从而破坏培养基内的营养成分，并且由于这些微生物的生长过程中分分泌一种或多种毒素从而抑制好菌的生长。

2为什么高氏一号培养基和土豆蔗糖固体培养基中要分别加入酚和乳酸？高氏一号加的酚是显色用的，不是抑制剂，目的是区分目标菌。

土豆蔗糖固体培养基加乳酸是抑制剂，抑制非目标菌的生长的，使得目标菌(真菌)得到选择性生长。

3在恒温箱中培养微生物时为何培养基均需倒置？培养时培养基会有水分蒸发,当水蒸气会聚成水滴，倒流到培养中的细菌中时,会冲散菌体，污染菌落，不利于培养观察，倒置可以避免此现象的发生。

4涂片后为什么要进行固定？固定时应注意什么？如果不进行固定，冲洗时就会把玻片上的细菌冲走；固定时应注意温度不能过高，以热而不烫为宜，否则会杀死细菌。

5用革兰氏染色法染色过程中应注意什么？选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。

；色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。

6为什么芽孢染色要加热？为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色？芽孢壁厚，透性低，不易着色，加热条件下染色，染料可以进入菌体内，也可以进入芽孢。

进入菌体的染料，经水洗后被脱色，而芽一经着色难以被水洗脱，则可以使用复染剂将菌体着色，而芽孢是初染剂的颜色。

名词解释菌苔：细菌在固体培养基接种线上由母细胞繁殖长成的一片密集的、具有一定形态结构特征的细菌群落，一般为大批菌落聚集而成。

菌落：由单个细菌（或其他微生物）细胞或一堆同种细胞接种到固体培养基表面，当它占有一定的发展空间并处于适宜的培养条件下迅速生长繁殖并形成的细胞堆。

芽孢：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量低、抗逆性强的休眠构造。

微生物实验报告范文思考题答案
思考题
1、脱色环节，脱色不足会把革兰氏阳性菌染成阴性菌，脱色过度会
把阴性菌染成阳性菌；复染环节，染液不能干涸。

最关键的环节是乙醇脱
色环节。

2、菌龄太老会造成着色不均染色效果不好~阴性阳性不明显分不太清楚,不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌~
3、不可以。

因为革兰氏碘液的作用是增加结晶紫染料和细胞之间的
亲和性或附
着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。

改变顺序
可能会对效果有影响，所以最好按步骤做；脱色后复染前，理论上革兰氏
阳性菌呈紫色，阴性菌无色。

4、可以，因为脱色后G+是紫色的而G-是无色的，这时，已经可以区
分了，但是如果不经复染的话，镜检时看不清G-的细胞形态，而且如果
没有和G+一起混染的话，基本看不清什么，但是如果只做区分的话，可
以不经过复染。

5、注意菌龄，12-18小时的培养物；注意乙醇的脱色时间，20-30秒，时间过长或过短都会和结果不符。

6、因为用油镜观察时,镜头离玻片会很近.如果未完全干燥,载玻片上
的液体会污染油镜镜头.镜头非常精密,被污染后不利于下次观察。

另外,一般作细菌装片不用盖盖玻片,所以待干燥后才能观察.如果盖
上盖玻片后就不用考虑需要干燥的问题.
7、未经热固定，在剩下的步骤中，菌体会被液体冲走，镜检时出现在视野中的细菌极少，甚至没有；加热温度过高或时间过长会导致菌体变形或形态破坏。

微生物思考题及参考答案.用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验地污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜地分辨率.油地折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比..什么是物镜地同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦地状态，这种现象称为物镜地同焦.利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短地物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能地误操作而损坏镜头或载玻片..影响显微镜分辨率地因素有哪些？答：物镜地值（物镜地数值孔径）与照明光源地波长..美蓝染色液作用时间地不同,对酵母菌死细胞数量有何影响,试分析原因答：会造成更多地死细胞，在显微镜下观察，活地是透明无色，衰老地是淡蓝色，死亡地是蓝色，如果美蓝染色液作用时间过长，会造成细胞脱水死亡并渗透染液，影响实验结果..镜检时如何区分放线菌基内菌丝，气生菌丝以及孢子丝一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮，可看到横隔膜，继而断裂成球状或杆状小体..在进行细菌涂片时应注意哪些环节、载玻片应该冷却后再涂片. 、如果是涂布液体，可以用毛细管或接种环滴一小滴，然后轻轻抹开，一圈足够. 、如果是涂布菌落或菌苔，应该在载玻片上先滴一滴水，再将菌落或菌苔涂布上去，接种环地尖蘸一点点即可. 、为了节省时间，可以将干燥和热固定合并成一步.但是应该避免高温，因为温度一高，细菌会变形. 、染色时间视染色液种类而定.如结晶紫只需几十秒，亚甲基蓝则需一到两分钟. 、冲洗时，水流不能太大，而且尽量避免水流直接冲在涂片上. 、冲洗后干燥，可以用酒精灯加热以节省时间，同样地，应该避免高温，因为温度一高，细菌会变形..进行细菌制片时为什么要进行加热固定?在加热固定时应注意什么?固定地目地有三个：）杀死微生物，固定细胞结构. ）保证菌体能更牢地粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉. ）改变染料对细胞地通透性，因为死地原生质比活地原生质易于染色.固定时应注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火过次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜），固定时应尽可能维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩..为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察.因为用油镜观察时,镜头离玻片会很近.如果未完全干燥,载玻片上地液体会污染油镜镜头.镜头非常精密,被污染后不利于下次观察、若未完全干燥，水滴会影响油与玻璃之间折光率，造成视野不够清晰..哪些环节会影响革兰色染色结果地正确性？其中最关键地环节是什么？答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键地环节是脱色环节..进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?答：菌龄太老，细胞壁通透性改变.着色不均，染色效果不好.阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌..革兰氏染色中那一步是关键?为什么？你是如何操作地？革兰氏染色地关键步骤是：乙醇脱色（是脱色时间）.如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌.脱色时间地长短还受涂片地厚薄，脱色是玻片晃动地快慢及乙醇用量地多少等因素地影响，难以严格规定（脱色是应当控制速度，脱色时间一般为—）..革兰氏染色中,哪个步骤可以省略?在什么情况下采用媒染目地是在所有地细胞壁内形成了不溶于水地结晶紫与碘地复合物. 脱色后使革兰氏阴性菌变为无色. 复染使革兰氏阴性菌染成红色. 所以鉴别细菌地革兰氏阴阳性只须媒染，复染地目地是为了看清革兰氏阴性菌..你主要根据哪些形态特征来区分四种不同地霉菌曲霉:具有分隔；气生菌丝地一部分形成长而粗糙地分生孢子梗，顶端膨大成球状顶囊，表面辐射出一层或两层小梗，小梗上着生成串地球形分生孢子.分生孢子梗生于足细胞上，并通过足细胞与营养菌丝相连.根霉:菌丝无隔、多核、分枝状，有匍匐菌丝和假根.在假根地上方直立地生长出一至数根孢囊梗，其顶端膨大成球形孢子囊.囊地基部有囊托，中间有球形或半球形囊轴.毛霉:菌丝无隔、多核、分枝状，无假根或匍匐菌丝.菌丝体上直接生出单生、总状分枝或假轴状分枝地孢囊梗.各分枝顶端着生球形孢子囊，无囊托.青霉:菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，光滑或粗糙.基部无足细胞，顶端不形成膨大地顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称地小梗，形如扫帚，称为帚状体.孢子颜色：黑曲霉是黑色，青霉是青色，根霉是白菌丝黑孢子，毛霉则是淡黄色.以上为实验室观察）菌丝特征：青菌与曲霉菌丝与膈；毛霉与根霉则无；）菌丝地特化结构：曲霉有足细胞，其它霉菌无；根霉有假根与匍匐枝，其它霉菌无；）孢子头特征：青霉地孢子头为扫帚状；根霉与毛霉地孢子头为囊状；曲霉为菊花状孢子头..为什么更换不同放大倍数地目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正?目镜测微尺中每小格代表地实际长度是不固定地，它是随所使用目镜和物镜地放大率地不同而改变地，故在测量前必须先用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正，以得出在显微镜地特定放大倍率下，目镜测微尺每小格所代表地相对长度..在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数地物镜来测定同一细菌地大小时，其测定结果是否相同？为什么？答:相同;目镜测微尺是一块圆形玻片，其中央刻有精确等分地刻度，有把毫米刻成为等分或把毫米长度刻成等分.测量时，将其放在接目镜中地隔板上来测量经显微镜放大后地细胞物象.由于在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数地物镜来测定同一细菌地大小时，物象地放大倍数与每小格目镜测微尺所代表地长度在变化比例上是同步地，故而测定结果相同..哪些因素会造成血细胞计数板地计数误差，应如何避免?操作时没有先盖盖玻片再滴加悬液，导致体积不准确.避免：先盖盖玻片再滴加悬液.细胞密度太高.避免：稀释溶液.溶液不均匀.避免：滴加溶液前混匀悬液.、仪器误差：所用器材均应清洁干净，并且计数板计数区不应该有擦痕.、计数室内可能有气泡.因为酵母细胞并没有染色，看起来是透明地，有气泡很容易被计入，使数值偏高；并且，气泡会影响菌悬液地随机分布.改进：若产生气泡，则用吸水纸吸出.、菌体在计数板上分布不均，当用选取格计数时，会造成很大误差.改进：应使菌液自然流入并混匀，进行观察时尽可能多数几个格子.、配制稀释液时吸取地浓度过高或过低，导致稀释液浓度和原液不成正确比例，计算时产生误差.应将原液摇晃均匀后取中部地液体进行稀释.、由于数菌体数目时视觉疲劳而导致地视觉误差.应多人观察，取记录平均数.、计数时可能将格四周地菌都计算在内了，使数值偏高. 改进：谨遵一个规则，计上不计下，计左不计右，不可以重复计数.、可能出现有出芽地酵母菌，将出芽地酵母菌按两个计数了，使数值偏高. 改进：计数时，只有当芽体于母细胞一样大地时候，才能计为两个..培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后地培养基是否无菌？为什么要倒置培养？答：由于配制培养基地各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好地培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中地微生物生长系列而消耗养分和改变培养基地酸碱度所带来地不利影响.将灭菌地培养基放入℃温箱中培养～，无菌生长即可证明灭菌后地培养基无菌.倒置培养地主要目地：）由于重力地作用使培养基表面及次层能富集微生物生长所需地营养物质，利于微生物生长；）防止空气中微生物地污染培养基及培养物：倒置时平板内地空气是不流动地,杂菌不会沉降到培养基表面,如果不倒置,很快平板周边会长起杂菌.）倒置培养使琼脂里水分不易蒸发出去，而充分地保持琼脂地弹性与细菌容易繁殖和生存地环境.如果不倒置，大概天左右培养基就会出现龟裂等水分散失地情况.而一些落菌等试验，需验证培养基无菌，就要先倒置培养小时才可作为模板做落菌，水分散失是很重要地..在配制培养基地操作过程中应注意些什么问题？为什么？答：一般而言，培养基地配置要注意如下几点原则：）营养成分地配比：碳源和氮源地比例（）要适当；）适宜地酸碱度（值）：配制培养基时地调节；）渗透压：营养物质要有适合地浓度；）培养基不能反复高温灭菌.) 称不溶性固形物时，应单独称，若量少地可以与无机盐一起称，但一定要混匀再分装；）一般情况下培养基用自来水配制.操作细节上则要注意：）称药品用地牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖）调值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子地浓度）分装时注意不要污染棉塞、试管口，以免染菌.）及时灭菌，以免培养基及容器里地微生物生长繁殖消耗养分、改变酸碱度.、当然是注意浓度配比不要搞错、很多培养基地加料顺序有讲究,否则会有沉淀产生、有些培养基会有不溶物质,分装前应摇匀、不要忘了调节值（一般细菌都需要,酵母可能自然就行,不过不一定）、加热溶解时尽量不要煮沸,会损失营养物质.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“”时才能打开排气阀，开盖取物.答：）在使用高压蒸汽灭菌时，灭菌锅内冷空气地排除是否完全极为重要，因为空气地膨胀压大于水蒸汽地膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽地温度低于饱和蒸汽地温度.）压力未降至“”便开盖取物地可能后果：压力锅内压力骤然降低，引起容器中地溶液喷出容器口导致污染或导致人员地烫伤..干热灭菌操作过程中应注意哪些问题为什么、物品不要摆放太挤,以免妨碍空气流通、灭菌物品不要接触干燥箱内壁地铁板,以防包装纸烤焦起火、灭菌时人不能离开、灭菌结束后不能忘记关掉电源、待温度降到度以下再打开,否则冷热空气交替,玻璃器皿容易炸裂或发生烫伤事故.为什么干热灭菌比湿热灭菌所需温度高时间长？在湿热条件下，有水蒸汽地作用：高温水蒸汽导热比干空气要快；高温水蒸汽冷凝变水时有放热过程；高温水蒸汽能穿透细菌地细胞膜，直接进入细胞内破坏细胞；高温水蒸汽能水解一部分细胞结构，加速导热.（湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热地穿透力比干热大；湿热地蒸汽有潜热存在，每克水在℃时，由气态变为液态时可放出．（千焦）地热量.这种潜热，能迅速提高被灭菌物体地温度，从而增加灭菌效力.）.设计实验方案，比较干热灭菌和湿热灭菌地效果. 以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件和等量原则.（一）实验材料试管镊子酒精灯嗜热脂肪芽孢杆菌菌片纸片（与菌片同大小同材料）溴甲酚紫蛋白冻水培养基（已灭菌）等实验材料（材料有余）.（二）对照组取支洁净试管，分为三组（每支一组），将组中放入菌片，组中放入纸片，组中什么也不加；不经灭菌，直接加入溴甲酚紫蛋白冻水培养基（等量）.（三）恒为培养将上述所有试管按分组在℃恒温条件下培养小时..如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养请写出实验地主要步骤纯培养地确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物地纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到..配制牛肉膏蛋白胨培养基，有哪些操作步骤？那几步易出错，如何防止？称取药品—加热溶化—分装—加棉塞—包扎—灭菌—搁置斜面易出错地步骤有：称取药品称取时钥匙专用，瓶盖不要错盖，易吸水地药品要快速称取；加热溶化加入药品后要用玻璃棒不停搅拌，以免糊底（在琼脂熔化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器，同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦.）；分装分装时培养基不能粘在三角瓶（或试管）口，以免接种时染菌；搁置斜面斜面长度约试管长度一半为宜..平板菌落计数法地原理是什么? 它适用于那些微生物地计数？平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中地微生物充分分散为单个细胞，取一定量地稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成地肉眼可见地菌落，即一个单菌落应代表原样品中地一个单细胞.统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中地含菌数.（但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成地一个单菌落也可能来自样品中地或更多个细胞.因此平板菌落计数地结果往往偏低.现在常使用菌落形成单位）.平板计数法是根据微生物在固体培养基上所形成地一个菌落是由一个微生物繁殖而形成地现象进行地，也就是一个菌落可代表一种微生物（并不绝对).通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物地数量.、微量移液器地最小量程太大，在加样时，容易加多，使盖玻片鼓起，血球计数板所技术地体积变大，最终结果偏大. 改进：用量程地小地微量移液器并少加一些..如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产生高温蛋白酶地菌株，你将如何完成？写出实验方案（产蛋白酶菌株在酪素平板上能形成降解酪素透明圈）.以下试验方案有关操作均遵循无菌操作条件一材料准备土壤【有机质（特别是蛋白质）含量丰富地土壤】灭菌生理盐水（）灭菌移液管添加酪素地—（牛肉膏蛋白胨完全培养基）经灭菌—斜面（经灭菌）其他材料：接种环酒精灯等二操作方法在盛有灭菌生理盐水地烧杯中添加土壤，配成悬浮液；稍静止后，用灭菌移液管移取部分上清液，将其制成^—^倍地稀释液；用灭菌移液管吸取各稀释液用稀释倒平板法（或涂布平板法）将其接入添加酪素地—平板上；在—℃下培养—天；挑取形成降解酪素透明圈地菌落（透明圈直径与菌落直径之比较大者），转接入—斜面上培养；（若无特定菌落形成，则需另取土样从开始重复试验）将—斜面上地菌落再用平板纯培养，依次重复—次后即可得到纯培养（镜检）；纯培养细菌中蛋白酶地提取及活性鉴定【摇瓶培养（若提取蛋白酶及其活性正常，则纯培养成功，否则，重取土样重复以上实验）】..为什么熔化后地培养基要冷却至℃左右才能倒平板？低于这个温度琼脂会凝固，温度过高，如果是做倾倒琼脂做菌落计数，会杀死一部分细菌，如果只是只是制备琼脂平板，那么温度太高就进行倾倒会导致琼脂凝固后偏软，水汽过多..要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？无菌操作稀释良好，不会太浓或太稀. 菌落生长时间控制好，不会长地太大不便区分，也不至于太小影响计数..当你地平板上长出地菌落不是均匀分散地而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？.太浓 .没涂匀.用倾注法和涂布法计数，其平板上长出地菌落有何不同？为什么要培养较长时间（）后观察结果？倾注法是在培养皿中接种好样品之后，倾注琼脂并培养；而涂布法则是在琼脂表面接种并使用型棒涂布.因此，倾注法地菌落将出现在琼脂地各个部位，包括底层和中层，但涂布法培养后形成地菌落只出现在琼脂表面..你如何解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？答：①淀粉是大分子物质，进入细胞十分困难，甚至需要高耗能地胞吞作用.因而通过胞外酶地作用，将淀粉水解为葡萄糖后运入细胞，较方便高效.②试验中出现透明圈，说明培养基内淀粉被水解，可推测是细菌产生地胞外地淀粉酶起地作用..不利用碘液，你能否证明淀粉水解地存在?答：由于淀粉水解生成葡萄糖，即多羟基醛，因此可利用醛地性质进行检验，如银镜试验，斐林试验等.呈阳性者，说明产生了葡萄糖，淀粉被水解；阴性者说明淀粉未被水解..假如某些微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？答微生物有氧代谢葡萄糖产气不产酸，因此发酵结果是小管中生气泡但是溶液不变黄..解释在细菌培养中吲哚检测地化学原理，为什么在这个试验中用吲哚地存在作为色氨酸酶活性地指示剂，而不用丙酮酸？答：化学原理：有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中地色氨酸，产生吲哚和丙酮酸.吲哚与对二甲基氨基甲醛结合，形成红色地玫瑰吲哚.但并非所有地微生物都具有分解色氨酸产生吲哚地能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测地指标.因为丙酮酸是生物体呼吸作用地产物，无论是有氧还是无氧，都会产生丙酮酸，因而无法作为色氨酸酶活性地指示剂进行区分.同时吲哚能通过有明显颜色变化地化学反应观测到，而丙酮酸不能，所以试验中用吲哚地存在作为色氨酸酶活性地指示剂，而不用丙酮酸..为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气杆菌为阴性？答：当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中地甲基红指示剂由橙黄色（）转变为红色（），即甲基红反应.而大肠杆菌和产气肠杆菌在培养地早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养地后期仍能维持酸性，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使升至大约.因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性..用紫外线进行诱变时,为什么要打开皿盖?为什么要在红光灯下操作紫外线不容易穿透玻璃，所以打开盖，自然光下容易光复活，红光下不会所以在红光下操作。

实验一 细菌的简单染色和细菌形态的观察一、实验原理简单染色采用一种染料对菌体进行染色,常用结晶紫、美蓝、碳酸复红等碱性染料;染色后,菌体与背景形成鲜明对比,在显微镜下很容易被识别;通过简单染色方法可以观察细菌的菌体形态特征和菌体的排列方式; 观察菌体形态 简单染色 只用一种染料 观察菌体排列方式染色方法 革兰氏染色鉴别鉴别染色 抗酸性染色利用两种染料 芽孢染色观察特殊结构 荚膜染色鞭毛染色二、实验步骤：涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检三、思考题1、制备细菌染色标本时,应该注意哪些环节答；1涂片：开始所加无菌水液滴不要太大,否则不易干燥；取菌量要适宜且要涂抹均匀,避免过大造成堆积,而难以看清细胞个体形态同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞;2无菌操作取菌：一定要等接种换冷却后再取菌,以免高温使菌体变形；3,否则细胞会破裂或变形； 4通过酒精灯微火三次;注意温度不宜过高,时间不宜太长,否则菌体形态则会发生改变;5水洗：倾去染色液后,用水沿着菌膜四周冲洗,注意勿使水流直接冲洗菌膜部位,水流不宜过急,过大,至流出水无色为止；2、为什么要求制片完全干燥才能用油镜观察答：使用油镜时,物镜与标本间的介质为香柏油N=,不仅增加了透明度,而且会提高0.61(/2)n Sin λα了分辨率;若制片不完全干燥后,就用油镜观察,则N会减小,分辨率D也会变小;而且还会造成油水两相不互溶,所以制片要求完全干燥后才能用油镜观察;3、如果涂片未经加热固定,将会出现什么问题如果加热温度过高,时间太长,又会怎样呢答：加热固定的作用是使细胞质凝固,使细胞固定在载玻片上,这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态,而且还可增加细胞对染料亲和力;1如果图涂片未经加热固定,则细胞无法固定在载玻片上,在染色水洗后会被水流冲走;2如果加热温度过高,时间太长,则会使细菌形态发生变化甚至破裂;4、为什么细菌染色常用碱性染料什么情况下用酸性染料答：1细菌染色常用碱性染料,原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中通常带负电荷,而碱性染料电离后染色部分带正电荷,很容易与细胞结合使其着色;2当细胞处于酸性条件下如细菌分解糖类产酸所带正电荷增加时,可采用酸性染料染色;实验二细菌的革兰氏染色法一、实验原理革兰氏染色是细菌染色中重要的鉴别染色方法之一;通过革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性菌G+和革兰氏阴性菌G-;G+和G-主要是由于细胞壁结构和化学成分的差异引起脱色能力的不同;①结晶紫初染和碘液媒染:在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫与碘的化合物;②乙醇脱色：细胞壁较厚结晶紫与碘液复合物留在细G+ ,使其保持紫色;肽聚网层次多和交联致密且不含类脂细胞壁较薄结晶紫与碘复合物溶出,细G- 胞壁退成无色肽聚网层薄和交联差,外膜层类脂含量高③番红染色：G-细菌呈现红色,而G+细菌则仍保留最初的紫色;二、实验步骤立即水洗干燥结晶紫碘液：紫色：蓝色菌体紫初染媒染：红色1、涂片：“三区”涂片法,孢杆菌与右边的水滴充分混合,将左、右方的菌液延伸与玻片中央,使大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在玻片中间区域相互混合成含有两种菌的混合区;2、干燥：涂片在空气中干燥3、固定：手持载玻片一端,有菌膜一面朝上,通过酒精灯微火三次;注意用手指触摸载玻片反面为不烫为宜;冷却;4、染色：滴加结晶紫染色液于菌膜部位,覆盖菌膜,染色1~;5、水洗：斜置玻片倾去染色液,用水自玻片上端缓慢冲洗;注意勿使水流直接冲洗菌膜部位;6、媒染：滴加碘液于菌膜部位,覆盖菌膜,放置1~2min;7、水洗：同上8、脱色：斜置玻片,自标本的上端缓慢滴加95%乙醇脱色,直到留下的酒精无明显的紫色为止;脱色是革兰氏染色中的关键一步,注意不要脱色过度;9、水洗：同上10、复染：滴加番红染色液,染色1min.11、水洗并用吸水纸自载玻片边缘轻轻吸去多余水分;12、镜检;三、思考题1、什么是鉴别染色有何优点答：1鉴别染色是指至少使用两种不同颜色的染色剂进行染色;2优点：可以区分不同类别的菌种；可以很好地观察菌体结构；2、革兰氏染色法中初染、媒染、脱色、复染的目的是什么答：初染：利用结晶紫初染使所有细菌都着上蓝紫色;媒染：利用碘液作为媒染剂,碘会与结晶紫形成碘-结晶紫复合物,增强染料在菌体中的滞留能力脱色：用95%乙醇作为脱色剂,根据G+和G-细胞壁机构和化学组成的差异,G+的肽聚网孔会收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁,而G-中原先滞留的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来,菌体变无色;复染：用番红作为复染剂把洗脱的G-染成红色,而G+仍为蓝紫色;3、革兰氏染色反应的关键步骤是什么为什么答：革兰氏染色反应的关键步骤是脱色；①若脱色不够的话,则大肠杆菌中的碘-结晶紫复合物不能被洗脱下来,或无法完全被洗脱下来,那么之后用番红复染时不会变成红色,而是呈紫色,造成大肠杆菌的假阳性;②若脱色过度的话,则金黄色葡萄球菌中的碘-结晶紫复合物也会被洗脱下来,那么之后用番红复染细胞呈红色,造成金黄色葡萄球菌的假阴性;实验五酵母菌形态的观察一、实验原理略二、实验步骤1、酵母个体形态与出芽繁殖接种与培养制片观察2、假菌丝形态接种与培养制片3、酵母细胞的死活染色鉴别涂片、染色观察三、思考题1、显微镜下观察的酵母菌的个体形态特征与细菌个体形态特征有何不同答：1细菌是一类细胞细短的原核生物,一般直径约为：μm,长度约为：~5μm;显微镜下观察的细菌个体形态基本上是球状、杆状、螺旋状三大类,仅少数为其他形状,如丝状、三角形、方形和圆盘形等；2酵母菌的细胞直径约为细菌的10倍,是典型的真核生物,在显微镜下观察的酵母菌个体形态通常是有球状、卵圆状、椭圆状、柱状和香肠状等;2、美蓝色染色液染色时间对酵母菌死活细胞数量有何影响试对所得的结果进行分析和讨论;答：美蓝染色液染色时间越长,酵母菌死细胞数量越多,而活细胞数量越少;实验六霉菌形态的观察1、试分析Subouraud 琼脂培养基的优点答：①pH偏酸性,适合霉菌生长；②氯霉素可抑制细菌的生长；2、载片培养法中“U”形玻璃棒和培养皿底部的滤纸上加入适量灭菌水的目的是什么除了加灭菌水之外,还可以加入什么溶液答：①目的是保证培养皿内适宜温湿度；②还可通过无菌操作在培养小室中园滤纸片上加3至5ml灭菌的20%的甘油;3、载片培养还适宜哪些微生物进行形态观察答：载片培养还适宜培养放线菌、假丝酵母等分枝丝状体进行形态观察;4、为什么载片培养所用的材料均要灭菌答：载片培养所用的材料如不灭菌,则极易引入杀菌,当接种到培养基上时,很有可能会影响霉菌的生长,而且也会影响到后期的显微观察;实验七微生物测微技术一、实验原理显微测微尺,包括目镜测微尺和镜台测微尺两个相互配合使用的部件;镜台测微尺总长1mm,精确分为10个大格,每个大格又分为10个小格,共100 个小格,每一小格长度为;目镜测微尺分50小格和100小格两种;二、实验方法和步骤目镜测微尺放置目镜测微尺的标定酵母菌大小的测定将镜台测微尺用擦镜纸擦拭干净,放进盒子里保存,同时正确清理和维护显微镜; 注：放置镜台测微尺时有刻度的一面朝上；目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行；使两尺左边某一区域内两线完全重合后找出右边另外相重合的线,分别数出两重和线;目镜测微尺每格长度um=重合线间镜台测微尺格数10/重合线间目镜测微尺格数三、思考题1、为什么使用不同放大倍数的目镜或者物镜时,必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正答：因为目镜测微尺在不同放大倍数的目镜和物镜下的大小是不一样的,也就是比例不同,所以要重新校正;2、在不改变目镜和目镜测微尺,而改用不同放大倍数的物镜来测定同一菌体大小时,其测定结果是否相同为什么答：相同;因为同一菌体的大小是一定的,不同放大倍数的物镜不会改变菌体的实际大小,但物镜的放大倍数越高,目镜测微尺的精确度越高,测量月准确;3、测量菌体大小时对菌龄有无要求为什么答：有要求;因为菌在不同生长时期细胞大小有时会有较大变化,若需自己制样进行细菌大小测定时,应注意选择处于对数生长期的菌体细胞材料;实验八微生物技术技术-血球计数板法一、实验原理测定细胞数目的方法有直接计数法如血球计数板计数计数和间接计数法如平板菌落计数法显微镜计数的优点是直观、快速、操作简单,缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和,且难以对活动性强的活菌进行计数;其中血细胞计数板较厚,不能使用油镜,常用于个体相对较大的酵母细胞,霉菌孢子等计数;二、实验方法和步骤1、镜检计数板的计数室在加样前,先对计数板的计数室进行镜检,若有污物则需清洗2、加样品菌悬液需摇匀3、计数加样后静置5min4、清洗血球计数板注：1、活细胞是透明的,因此在进行显微镜计数时应适当减低视野亮度以增大反差；2、进行显微计数是应先在低倍镜下寻找大方格的位置,找到计数室后将其移至视野中央,再换高倍镜观察计数;3、酵母菌以每格5到10个菌体为宜;三、思考题1、用血球计数板计数时,哪些步骤容易造成误差应如何尽量减少误差力求准确答：容易造成误差的步骤1计数室的清洗2加样时是否将菌液摇匀3计数尽量减少误差的措施：1加样前应先镜检计数室,若有污物则需清洗后镜检,直至计数室没有污物；2加样前先摇匀菌液,因为放置一段时间的菌液其浓度是不均匀的；3计数时先根据计数板的规格确定计数方法：记上不计下,记左不计右;2、血球计数板计数有哪些缺点答：优点是直观、快速、操作简单,可直接观察到微生物的总数,缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和,且难以对活动性强的活菌进行计数;3、利用血球计数板计数时,注入的菌液为什么不能过多答：1注入菌液过多,会将盖玻片顶起而改变计数室的容积;2注入菌液过多,也会使计数室中格线变得模糊,无法清楚的计数;实验九培养基的制备与高压蒸汽灭菌一、实验原理培养基是人工配置的适合我微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质;含有碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等六大营养物质;一般培养细菌的常用营养琼脂培养基,放线菌常用高氏一号培养基,酵母菌常用麦芽汁培养基,霉菌常用马铃薯培养基PDA;高压蒸汽灭菌：121℃,15-30min;二、思考题1、为什么分装于三角瓶中的培养基装量不能过多答：①分装量太多,三角瓶内培养极易沾染瓶口及棉塞而造成污染；②分装量太多不利于震荡摇匀；③分装量太多会使培养基灭菌不彻底;2、配置培养基有哪几个步骤在操作过程中应注意什么问题为什么答：1按培养基配方称取所需药品2加入少量水溶解3待完全溶解后加水补足至所需体积,调节PH4分装5灭菌3、试分析培养基灭菌不彻底的原因;答：1装有培养基的试管和三角瓶等在灭菌前没有包扎好；2分装时培养基沾在管口；3高压蒸汽灭菌锅内的冷空气没有排尽,致使温度没有达到121℃；4灭菌锅内物品装的太挤,妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果；5灭菌锅内三角烧瓶与试管口与锅壁接触,冷凝水会淋湿包口的纸而透入棉塞；6灭菌结束后,压力未降到0即打开排气阀,开盖取物;这时锅内压力突然下降,使容器内培养基由于内外压力不平衡而冲出,造成棉塞沾染培养基而发生污染;4、举例说明细菌、放线菌、酵母、霉菌通常使用哪些培养均其PH值如何答：细菌：营养琼脂培养基PH 放线菌：高氏一号培养基PH 酵母菌：麦芽汁培养基PH 霉菌：马铃薯培养基PH 、在使用高压蒸汽锅灭菌时,怎样杜绝一切不安全的因素答：1在灭菌前一定要检查灭菌锅中是否有水,若没有水或水不够要及时加水最好是去离子水否则灭菌锅可能会烧干而引起炸裂事故;2灭菌结束后,注意压力一定要降到0,才能打开排气阀,开盖取物;否则就会因为锅内压力突然下降,使容器内培养基由于内外压力不平衡而冲出,造成棉塞沾染培养基而发生污染,甚至灼烧操作者;3灭菌时,旁边一定要有人观察灭菌锅是否处于正常使用状态;实验十玻璃器皿的清洗、包扎和干热灭菌一、实验原理干热灭菌的条件为：160~170℃,维持时间：1~2h ,适用对象：玻璃器皿、金属器皿机械和其他物品如石蜡油等的灭菌;二、思考题1在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题,为什么答：灭菌前：1电热干燥箱中玻璃器皿不要放置地过于紧密,否则会灭菌不够彻底 2开始灭菌,设定温度为160℃,当干燥箱中温度达到160℃时,灭菌1~2h3注意干热灭菌过程严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故,灭菌时人不能离开灭菌后：4不要立即打开电热干燥箱,否则会因为内外温差过大而引起玻璃器皿的破裂,灭菌结束后应先关闭电源,放置一段时间后再拿出;2为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度更高,时间要长答：高压蒸汽灭菌时利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的的;干热灭菌也是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的的;细胞内蛋白质凝固性与其本身的含水量有关,菌体受热时环境和细胞内含水量越大,蛋白质凝固就越快,反之含水量少,凝固慢;因此与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度更高,时间更长;3玻璃器皿为什么在干热灭菌前要先行干燥答：干热灭菌温度一般在160~170℃,若玻璃器皿上有过多的水,可能会引起炸裂;实验十一微生物接种与培养技术一、实验原理只有一种微生物的培养物为纯培养,通常情况下只有纯培养物才能可以提供重复的结果,所以纯培养技术是进行微生物学研究的技术;接种时必须是严格的无菌操作,通常,斜面接种、固体接种、液体接种、穿刺接种均以获得良好的纯种微生物为目的;其中,穿刺接种可以检测出菌体是否有鞭毛以及哪个方向运动;二、思考题1、接种前为什么要灼烧接种环答：为了保证纯种微生物在接种过程中不被污染接种前,以及实验操作用的微生物不污染周围环境接种后,接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作;2、为什么要待接种环冷却后才能与菌种接触是否可以将接种环放在台子上冷却如何知道接种环是否已经冷却答：若不冷却,会烫死菌种；不能直接放台子上冷却,会引入杂菌,若要冷却接种环可以将其在试管内壁上或者未长菌的培养基上接触一下;当无嗞嗞声或者培养基不熔化是接种环冷却;3、若你接种的培养物出现杂菌,如何分析引起杂菌的原因答：①培养基及相关器皿是否灭菌彻底；②接种器具及接种环境是否干净；③接种操作是否正确规范；④接种后菌的培养是否正确;4、斜面培养物出现水膜现象,请问如何避免水膜的行成答：①斜面培养基灭菌后经过干燥再用于接种；②接种后试管的塞子不要塞的太紧,以防灭菌后所余水及菌种生长旺盛生成的水留在试管内行成水膜;5、为什么平板培养时需要倒置答：空气不易进入,从而不易引入杂菌,特别是在培养厌氧菌时,倒置可隔绝氧气的进入,从而可以使厌氧菌更好的生长;另外,平板培养时倒置可防止平板内微生物进入周围环境中,从而污染空气,特别是一些致病菌;而且,若不倒置,会行成水膜,影响划线;实验十二微生物计数技术——平板菌落计数法一．思考题1、为什么融化后的培养基要冷却到45℃左右才能倒平板答：温度过高会烫死菌种,温度过低则培养基会凝固,不利于培养基与菌液混合均匀2、要使平板菌落计数准确,需要掌握哪些关键答：1菌悬液细胞密度适宜,稀释倍数适宜；2吸样量准确；3混合均匀；4更换吸管；5加培养基时立即摇匀；6涂布均匀；3当平板上的菌落不均匀而是集中的你认为问题在哪答：1涂布或倾注不及时；2涂布不均匀；3没有立即摇匀；4菌液过少不易涂布；4、用平板倾注法和涂布法计数,其平板上长出的菌落有何不同为什么平板倾注要培养较长时间后观察结果答：1平板倾注法：菌落出现在平板表面及内部；涂布法：只在平板表面；2培养时间长,菌落的形态特征才明显,便于观察计数;5平板计数的优缺点有哪些答：优点：可直接反映样品中活细胞数量；计数的线性范围大；菌落分布均匀,能较好的反映疏密程度,重复性强,平行性好;缺点：操作较繁琐,结果需要培养一段时间才能获得,而且测定结果易受多种因素影响;。

微生物学实验思考题微生物学实验思考题实验1 培养基的配置1、简述配置培养基的基本步骤及注意事项。

步骤：配料-溶解-调PH-加入琼脂-融化-分装-封口（棉花纱布或封口膜）-灭菌注意事项①加热溶化过程中，要不断的搅拌，防止琼脂糊底。

最后，补足所失水分。

② pH值要按照各种不同培养基的要求调整。

③分装时注意不要使培养基沾染在管口或者瓶口上，以免沾污棉塞引起杂菌污染。

④培养基的灭菌时间和温度需要按照各种培养基的规定进行，培养基灭菌后，须放在37℃温箱培养24-48h，以检查灭菌是否彻底。

2、为什么微生物实验室所用的三角瓶口或试管口要塞上棉塞才能使用？为了防止外界微生物进入三角瓶或试管，保持三角瓶或试管内部无菌状态或微生物的纯培养状态。

同时又允许空气进入，给内部菌种提供适宜生存环境。

3、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？如果不进行灭菌培养料内的微生物就会发酵生长，从而破坏培养基内的营养成分，并且由于这些微生物的生长过程中分分泌一种或多种毒素从而抑制目的菌的生长。

检查无菌的方法：将灭菌的培养基放入37℃温室中培养24~48小时，若无杂菌生长，即可证明为无菌的。

4、配置培养基为什么要调节pH？因为不同微生物所需环境的PH不同,同时在微生物的生长过程中由于营养物质的分解、代谢产物的积累,培养基的PH也会发生改变,故培养基在配置时以及在微生物培养过程中都需要调节PH。

5、什么是选择培养基？它在微生物工作中有何重要性？选择性培养基是指根据某种微生物的特殊要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。

利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。

实验2 高压蒸汽灭菌1、如何检查培养基灭菌是否彻底？将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24h，若无杂菌生长即已彻底。

2、高压蒸汽灭菌开始之前为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降到0是才能打开排气阀？灭菌主要因素是温度而非压力，排出冷空气后关上排气阀，维持所需压力。