食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌

食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验1范围本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的检验方法。

本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。

2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36℃±1℃；b）冰箱：2℃～5℃；c）恒温水浴箱：50℃±1℃，46℃±0.5℃；d）天平：感量0.1g；e）均质器；f）显微镜：10×～100×；g）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；h）无菌试管：18mm×180mm；i）无菌培养皿：直径90mm；j）pH计或pH比色管或精密pH试纸；k）厌氧培养装置。

3培养基和试剂3.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录A中A.1。

3.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录A中A.2。

3.3缓冲动力-硝酸盐培养基：见附录A中A.3。

3.4乳糖-明胶培养基：见附录A中A.4。

3.5含铁牛乳培养基：见附录A中A.5。

3.60.1%蛋白胨水：见附录A中A.6。

3.7革兰氏染色液：见附录A中A.7。

3.8硝酸盐还原试剂：见附录A中A.8。

3.9缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录A中A.9。

4检验程序产气荚膜梭菌检验程序见图1。

图1产气荚膜梭菌检验程序5操作步骤5.1样品制备5.1.1样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2℃～5℃保存；如8h 内不能进行检验，应以无菌操作称取25g （mL ）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。

5.1.2以无菌操作称取25g （mL ）样品放入含有225mL 0.1%蛋白胨水（如为5.1.1中冷冻保存样品，室温解冻后，加入200mL 0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min ～2min ；或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8000r/min ～10000r/min 均质1min ～2min ，作为1:10稀释液。

产气荚膜梭菌国标检测方法
《产气荚膜梭菌国标检测方法》
产气荚膜梭菌是一种在自然界中广泛分布的细菌，在土壤、水体和动植物表面等环境中都可能存在，同时也是人和动物的肠道正常菌群。

然而，产气荚膜梭菌也会引起食物中毒，对人体健康造成威胁。

因此，及时、准确地检测产气荚膜梭菌成为了食品安全监管的重要内容之一。

为了规范产气荚膜梭菌的国家标准检测方法，中国国家标准化管理委员会发布了《食品安全国家标准食品微生物检验鲜肉和肉制品、水产品及蛋品中产气荚膜梭菌检验》（GB 4789.9-2016）。

该标准规定了在食品中产气荚膜梭菌的检测方法及技术要求，其内容包括了样品制备、检测方法、结果判读和报告等方面。

在该标准中，样品制备包括了样品采集、致病菌分离培养和纯化等步骤；检测方法主要采用分子生物学技术和培养方法相结合的策略；结果判读则依据标准规定的指标和标准质控程序进行判定；报告部分则要求对检测结果进行详细的描述和解释。

此外，随着检测技术的不断更新和完善，国家标准化管理委员会也会不断修订和完善相关标准，以确保检测方法的准确性和适用性。

同时，食品生产企业也应当严格按照国家标准要求，对生产过程中的食品样品进行产气荚膜梭菌的检测，以保障食品的安全和质量。

总之，《产气荚膜梭菌国标检测方法》作为国家标准的一部分，对食品安全监管起着重要的作用，通过该标准的执行，可以有效避免食品中产气荚膜梭菌的污染，保障食品安全，保护消费者的健康。

食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌ppt教案•引言•产气荚膜梭菌生物学特性•食品卫生微生物学检验方法•产气荚膜梭菌检验流程及操作规范•实验室安全与防护措施•案例分析与实践操作演示引言课程背景与目的背景随着食品工业的发展，食品卫生安全问题日益突出，微生物污染是其中重要的问题之一。

目的通过本课程的学习，使学生掌握食品卫生微生物学检验的基本理论和技能，了解产气荚膜梭菌等常见食源性致病菌的生物学特性和检测方法。

食品卫生微生物学是研究食品中微生物的种类、数量、分布及其对食品质量和安全的影响的学科。

定义研究内容重要意义包括食品中微生物的污染来源、生长繁殖条件、代谢产物及毒素的形成等。

对于保障食品安全、预防食源性疾病的发生具有重要意义。

030201食品卫生微生物学概述产气荚膜梭菌简介生物学特性产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性菌，能形成芽孢，具有厌氧生长的特性。

分布与污染广泛分布于自然界中，常见于土壤、水、动物肠道等环境，也可通过食品加工过程污染食品。

危害产气荚膜梭菌在食品中生长繁殖可产生多种有害代谢产物，如气体、毒素等，导致食品腐败变质，严重时还可引起食物中毒。

产气荚膜梭菌生物学特性形态与结构形态产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，两端钝圆，单个或成双排列，偶见链状。

结构菌体有荚膜，无芽孢，在体内可形成卵圆形芽孢，芽孢位于菌体中央或近端，芽孢直径不大于菌体。

生长条件与培养基生长条件产气荚膜梭菌为厌氧菌，生长适宜温度为37℃，pH值为7.0～7.5。

培养基在血平板上菌落较大、灰白色、不透明，边缘呈锯齿状，多数菌株有双层溶血环，内环是θ毒素的作用，而外环不完全溶血是a 毒素所致。

生理生化特性代谢产气荚膜梭菌能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死。

生化反应产气荚膜梭菌可发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气；不发酵甘露醇、卫矛醇和侧金盏花醇；液化明胶，产生H2S，吲哚和动力。

品有限公司生效日期：2014.01.01页码：第1页，共2页1 目的规定矿泉水产气荚膜梭菌的检验方法，保证按标准化操作。

2 适用范围适用于产气荚膜梭菌检测。

3 术语产气荚膜梭菌：是继沙门氏菌、葡萄球菌后引起食物中毒的又一重要的病原菌。

属于革兰氏阳性粗大梭菌，芽孢呈卵圆形，肉汤培养时芽孢少见，须在无糖培养基中才能生成芽孢。

无鞭毛，不运动，属于专性厌氧菌。

4 职责质检员负责按作业指导书进行检验。

5 流程图无6 作业内容6.1 检验方法原理微孔滤膜是一种微孔径的过滤膜（通常孔径为0.22µm、0.45µm，滤膜直径为47mm），滤膜能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上的典型微生物菌落数，算出一定体积水样中含有的微生物菌落总数。

6.2 实验器材、培养基及试剂6.2.1 实验器材不锈钢过滤器装置、滤膜（直径47mm，微孔径0.22µm）、抽滤设备、无齿镊子、显微镜（10×～100×）、量筒、培养皿、灭菌锥形瓶、恒温培养箱（36±1℃）、恒温水浴锅（46±1℃）、酒精灯、冰箱（0～8℃）、厌氧培养装置、超净工作台。

6.2.2培养基及试剂庖肉培养基、庖肉牛肉粒、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）、液体硫乙醇酸盐培养基（FT）、动力硝酸盐培养基（A法）、含铁牛奶培养基、卵黄琼脂培养基、1g/L蛋白胨水、硝酸盐还原试剂（甲）、(乙)液、亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂配套试剂、革兰氏染色液6.3操作步骤6.3.1推测性检验6.3.1.1水样过滤：在100级的洁净工作台进行过滤操作。

6.3.1.2用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好品有限公司生效日期：2014.01.01页码：第2页，共2页滤器，将50mL水样或稀释液通过孔径0.22µm的滤膜过滤。

产气荚膜梭菌检验标准操作程序As the development of science and technology advances, the testing standards and procedures for Clostridium difficile (C. diff) have become more refined and rigorous. 随着科学技术的进步，产气荚膜梭菌(C. diff)的检测标准和程序变得越来越精细和严格。

When it comes to the detection of C. diff, it is essential to follow standardized operating procedures to ensure accurate and reliable results. 检测C. diff时，遵循标准化的操作程序至关重要，以确保结果准确可靠。

One of the critical steps in the testing process is sample collection. Proper sample collection is crucial for obtaining accurate results. 检测过程中一个关键的步骤是样品采集。

正确的样品采集对于获得准确的结果至关重要。

In addition to sample collection, sample transportation and storage are also vital aspects of the testing procedure. Proper transportation and storage conditions help preserve the integrity of the sample and prevent contamination or degradation. 除了样品采集外，样品的运输和储存也是检测过程中至关重要的方面。

76 食品安全导刊 2013年3月刊TEChNOLOGy ThESIS 科技文苑随着我国经济的快速发展，从产气荚膜梭菌检验工作的实际情况来看，现有标准与出现的新情况、新问题不相适应，主要表现在：原标准的适用性、内容的完整性、操作的规范性等方面还有待进一步的提高。

中国检验检疫科学研究院、中国疾病预防控中心营养与食品安全所和辽宁出入境检验检疫局适时地组织和开展对GB/T 4789.13—2003《食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》的修订，修订后的标准已经颁布实施了。

产气荚膜梭菌（C l o s t r i d i u m Perfringens)是引起食源性胃肠炎最常见的病原菌之一，该菌的各种检测方法对保障食品安全起着非常重要的作用，尤其是食品安全国家标准。

现就GB 4789.13－2012《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》主要修订的部分进行说明，包括以下5个方面。

1 样品制备如样品采集后不能立即进行检验，以前不知道样品该如何处理，现在就可以依据GB 4789.13－2012《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》中5.1样品制备部分对样品及时进行正确处理。

另外，针对固产气荚膜梭菌检验标准的修订□ 刘沛 何艳玲 北京陆桥技术有限责任公司摘 要：GB 4789.13－2012《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》已经颁布实施，文章就该标准的修订部分及修订原因进行详细说明，包括样品制备、选择性计数琼脂的选择、活菌计数培养、确证实验和菌数计算等方面。

关键词：产气荚膜梭菌 检验 国家标准体或半固体样品的处理，增加了拍击式均质器均质的方法，该方法处理样品时效率高且效果好。

拍击式均质器在微生物检测领域中已得到广泛应用，在国内外许多标准和方法中被推荐使用，及时增加该方法，使用时就有据可依了。

2 将选择性计数琼脂由亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）改为胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂GB/T 4789.13—2003《食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》采用S PS 琼脂对产气荚膜梭菌进行计数，而U S-F DA BA M （U S-FDA Bacteriological Analytical Manual Chapter 16 Clostridium Perfringens （2001））、I S O 标准（I S O 7937 Microbiology of food and animal feeding stuffs—Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens—Colony-count technique）和AOAC官方方法[AOAC O f ficia l Method 976.30：Clostridium Perfringens in Foods Microbiological Method （First Action 1976；Final Action 1979）]均采用TSC琼脂对产气荚膜梭菌进行计数，所以安排试验比较TSC琼脂与SPS琼脂的效果。

出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法1.适用范围本方法适用于出口食品的检验。

2.培养基和仪器2.1.培养基胰月示 -亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂；d-环丝氨酸溶液；卵黄乳液；缓冲动力-硝酸盐培养基；乳糖-明胶培养基；产芽孢肉汤；多价蛋白胨-酵母膏(PY)培养基；硫乙醇酸盐液体培养基；蛋白胨水；亚硝酸盐试剂；缓冲甘油-氯化钠溶液。

2.2.仪器吸管1.0mL和10.0mL，分别具有0.1mL和1.0mL刻度；菌落计数器；均质器；厌氧培养装置；超低温冰箱；恒温培养箱：36±1℃；恒温水浴箱：46±1℃；培养皿：90或100mm；显微镜。

3.样品制备3.1.样品的贮存和运送如不能立即进行检验时，应在样品中加等量缓冲甘油-氯化钠溶液(液体食品应加双料的)。

将样品作低温保存，直到检验。

运送样品时，应使样品保持冷冻状态，并要避免容器破损。

3.2.制样将样品解冻，取25g移入灭菌均质杯，加225mL蛋白胨水，以13 000r/min 均质2min，如为液体样品，则取样25mL，加入盛有225mL稀释剂的500mL稀释瓶中，摇匀，吸取此1∶10样品匀液10mL加于90mL蛋白胨水中，摇匀，制成1∶100样品稀释液，必要时，按此法将样品作进一步的10倍递增稀释，如从10－3～10－4……。

4.检验4.1.平板计数法倾注不含卵黄的TSC琼脂到10个灭菌平皿中，每皿约5mL，并迅速旋转平皿，使琼脂铺平。

当琼脂凝固后，将每个平皿编号标记，以无菌操作，吸取稀释液样品1mL分别加到每个琼脂平板表面中心。

再向平皿中倾注不含卵黄的TSC 琼脂15mL，缓慢地旋转平皿，使其与接种物混合均匀。

也可用灭菌L形玻璃棒，将0.1mL样品稀释液均匀地涂布于含卵黄乳液的TSC琼脂上，将平板水平静置5～10min，使接种物被吸收。

然后用不含卵黄的TSC琼脂10mL覆盖平板表层(含卵黄的TSC琼脂最适于同时含有其他还原亚硫酸盐梭状芽孢杆菌的食品)。

GB 4789.13－2012食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验★方法修订★检验方法一、流行病学产气荚膜梭菌是人类气性坏疽的主要病原菌。

1892年，美国病理学家W.H.韦尔奇等自尸体分出本菌，故又称魏氏梭菌。

本菌广泛存在于土壤、人和动物的肠道以及动物和人类的粪便中，会散发臭味。

常因深部创伤而感染。

有些菌株产生肠毒素，可引起食物中毒。

一、流行病学产气荚膜梭菌为厌氧芽胞杆菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。

可引起典型的食物中毒爆发。

临床特征是患者剧烈腹绞痛和腹泻。

摄食被本菌污染的食品后8～22 h开始发病。

一、流行病学在食品中该菌数量必须达到很高时（1.0×10７或更多），才能在肠道中生产毒素，病程通常在24小时内，但某些个体的不显著症状可能会持续1～2周，已报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。

一、流行病学据报道魏氏梭菌食物中毒在美国占细菌性食物中毒的30%左右。

美国疾病控制中心最新统计数据表明，每年美国由产气荚膜梭菌引起的食物中毒人数在250,000左右，其中大约只报告1200例，暴发约20起，其中约有十人死亡，每年造成的经济损失在1.2亿美元左右。

一、流行病学大量的暴发和少量的发病都与公共饮食有关。

例如：学校的自助食堂和护理病房，产气荚膜梭菌中毒最常发生于儿童和老人。

一、流行病学产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现。

该菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中，从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中，可以分离产气荚膜梭菌。

一、流行病学引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因为食品加热不彻底，芽胞在食品中大量繁殖所致。

一、流行病学此外，不少熟食品，由于加温不够或后污染而在缓慢的冷却过程中，细菌大量繁殖并产生肠毒素，其食品并不一定在色味上发现明显的变化，人们在误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发病。

TJJHCDC-WSW-BG-015
疾病预防控制中心食品微生物检验记录
样品编号样品名称受理日期被检单位检验依据检验日期
操作步骤
1 按无菌操作称取食品检样25g(mL)放入均质器，加0.1%蛋白陈水稀释剂225mL，低速搅动1～2min，使之均质化，作为1∶10稀释液。

2以上述1∶10稀释的均质液按1mL加0.1%蛋白陈稀释剂9mL做成10-2～10-6的系列稀释液。

3吸取各稀释液1mL分别放入2个灭菌平皿内。

每个平皿浇注约50℃的TSC 琼脂15～20mL，仔细转动平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。

4上述琼脂平板凝固后，再加入10mLTSC琼脂，均匀覆盖表面，倒置于厌氧培养装置内，于37℃培养24h。

5选取长有30～300个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。

6 确证实验
7 结果
检验人：复核人：。