改良的苯酚_硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究

实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。

3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。

４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。

５．试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。

2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。

6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。

以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。

用exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。

改良的苯酚硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究一、本文概述多糖和寡糖作为生命体系中的重要组成部分，广泛存在于各类生物体内，具有多种生物学功能，如能量储存、细胞识别、信号传导等。

因此，准确测定多糖和寡糖的含量对于理解其生物学作用以及评估其在食品、医药等领域的应用价值具有重要意义。

传统的苯酚硫酸法是一种常用的多糖和寡糖含量测定方法，但由于其存在的一些局限性，如灵敏度低、抗干扰能力差等，使得该方法在实际应用中受到一定的限制。

因此，本文旨在研究改良的苯酚硫酸法，以提高其测定多糖和寡糖含量的准确性和稳定性，为多糖和寡糖的研究和应用提供更为可靠的分析方法。

本文首先将对传统的苯酚硫酸法进行详细的介绍和分析，阐述其原理、操作步骤以及存在的问题。

在此基础上，本文将详细介绍改良的苯酚硫酸法的具体实施方案，包括试剂的选择、反应条件的优化、干扰物质的排除等方面。

随后，本文将通过一系列的实验验证改良后的方法的可行性和准确性，包括标准曲线的绘制、精密度和稳定性的考察、实际样品的测定等。

本文将对改良的苯酚硫酸法的应用前景进行展望，探讨其在多糖和寡糖研究以及相关领域的应用价值。

通过本文的研究，期望能够为多糖和寡糖含量的准确测定提供一种更为可靠的分析方法，为相关领域的研究和应用提供有益的参考。

二、材料与方法本实验所使用的主要试剂包括苯酚、硫酸、多糖标准品（如葡萄糖、果糖等）以及待测的多糖和寡糖样品。

所有试剂均为分析纯，购自国内知名试剂供应商。

实验所需设备包括电子天平、水浴锅、分光光度计、离心机等。

苯酚硫酸法是一种基于多糖和寡糖在浓硫酸作用下与苯酚发生显色反应的原理来测定其含量的方法。

在酸性条件下，多糖和寡糖会被硫酸水解成单糖，随后与苯酚发生缩合反应，生成有色化合物，其颜色深浅与多糖和寡糖的含量成正比。

（1）标准曲线的绘制：准确称取适量多糖标准品，用蒸馏水配制成不同浓度的标准溶液。

分别取各浓度标准溶液与苯酚硫酸试剂混合，于沸水浴中加热一定时间后冷却，用分光光度计测定各溶液在特定波长下的吸光度。

苯酚-硫酸比色法测定多糖含量
苯酚-硫酸法是常用的多糖含量测定方法之一。

该方法基于多糖在硫酸的作用下，与苯酚产生颜色反应的原理，利用光度计测定反应产物的吸收值，从而计算出多糖的含量。

步骤如下：
1. 取样品0.1g，在50ml锥形瓶中加入5ml去离子水，振荡
20min溶解。

2. 加入2ml 5%苯酚水溶液，振荡均匀。

3. 加入5ml浓硫酸，使用磁力搅拌器搅拌1-2min。

4. 将混合物放置在冷水中冷却10min。

5. 用紫外分光光度计在490nm处测定吸光度A，同时以含有相同试验液体积的去离子水为对照。

6. 计算样品中多糖含量。

该方法测定简便，精度高，适用于多糖含量较高的样品。

但此法不能区分多糖的种类及其组成，不能应用于含非多糖的样品中。

硫酸苯酚法测多糖原理
硫酸苯酚法测多糖是一种常用的多糖测定方法，其原理基于多糖与硫酸苯酚反应产生显色化合物的特性。

在测定中，首先将待测样品中的多糖加入到试管中。

然后，向试管中逐渐加入浓硫酸，并快速而彻底地混合。

硫酸的加入会引发多糖与硫酸之间的酸水解反应，生成大量的醛基。

随后，加入苯酚试剂，苯酚与醛基反应生成的有色化合物会根据多糖的种类和含量而呈现出不同的颜色。

颜色的深浅可以通过分光光度计进行测量，从而得到多糖样品中多糖含量的定量结果。

该方法的优点是简单、快速，且对多糖具有较好的选择性。

然而，需要注意的是，在进行测定时应严格控制硫酸和苯酚试剂的加入量和混合程度，以避免反应过程中的误差产生。

总结起来，硫酸苯酚法是一种常用的测定多糖含量的方法，通过多糖与硫酸和苯酚的反应生成有色化合物来实现多糖的测量。

随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。

目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。

该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。

１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。

其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。

２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。

２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。

２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。

精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。

２．４　测定条件选择２．４．１　反应温度选择　精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。

分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。

一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。

另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。

取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。

２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择　分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。

1.2.3 单因素试验设计以100μg/mL 葡萄糖标准溶液200μL 为研究对象，酶标仪检测波长为490nm 时的OD 值作为评价指标，分别考察苯酚用量(100、200、300、400、500μL)、浓硫酸用量(600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500μL)、反应温度(30、40、50、60、70、80、90、100℃)、反应时间(5、10、15、20、25、30、40、50、60min)等因素对OD 490nm 值的影响[6]。

1.2.4 正交优化试验在1.2.3单因素试验结果的基础上，选择苯酚用量(A)、浓硫酸用量(B)和反应温度(C)3个因素为自变量，以OD 490nm 值为评价指标，进行L9(33)正交试验，试验因素及水平见表1。

表1 正交试验因素水平表2200700803300800901.2.5 标准曲线制作以蒸馏水为空白，分别精密吸取浓度为0、20、40、60、80、100μg/mL 的葡萄糖标准品溶液各200μL 加入2mL 具塞塑料离心管中，在每支离心管中加入5%苯酚溶液200μL 、浓硫酸700μL 后，迅速摇匀，80℃水浴10min 后，冷水浴5min 终止反应，精密吸取各反应液加入96孔酶标板，每个样品加3个孔，每孔200μL ，采用酶标仪在490nm 波长下测定OD 值，以葡萄糖浓度为横坐标，OD 490nm 值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 酶标仪测定多糖的可行性分析精密吸取浓度为40、60、80、100μg/mL 的葡萄糖标准品溶液各200μL 加入2mL 具塞塑料离心管中，按照1.2.5的操作方法加入苯酚、浓硫酸反应后，酶标仪测定OD 490nm 值，并根据标准曲线计算多糖含量。

2 结果与分析2.1 酶标仪检测波长的确定采用苯酚-硫酸法对葡萄糖标准品进行测定，于紫外可见分光光度计上，在400～600 nm 波长范围内进行扫描，结果如图1所示，葡萄糖标准品在490nm 处有最大吸收峰，故可选择490nm 作为酶标仪检测波长。

一、硫酸苯酚法测多糖含量1、试剂配制1. 浓硫酸：分析纯，95.5%2. 5%苯酚：取苯酚5 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用。

3. 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。

准确称取20m g经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容。

2、制作标准曲线准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，然后加入5%苯酚1ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以1.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

1 2 3 4 5 6 7 8 00.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 标准葡萄糖溶液（mL）蒸馏水（mL）0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 5%苯酚（mL）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5葡萄糖标准曲线y = 54.353x + 0.0018R 2 = 0.999400.10.20.300.0010.0020.0030.0040.0050.006葡萄糖浓度（mg/ml）吸光值3 注意事项（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。

（2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正μg 数。

（3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算（4）测定时根据光密度值确定取样的量。

光密度值最好在0.1——0.3之间。

实验一硫酸苯酚法测多糖含量The pony was revised in January 2021实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求? 测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．2．方法原理3．糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。

4．3．主要实验仪器及材料5．浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。

6．４．掌握要点7．硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。

8．５．试剂配制9．1）葡萄糖标准液的配制10．准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。

11．2）90%苯酚液的配制12．?准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。

6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤7.管号 0? 1 2 3 4 5 6 78.葡萄糖9.10.苯酚液11.浓硫酸?12.取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。

以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。

用exceL 软件求得回归方程13.2）待测样品多糖的测定与计算14.将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。

苯酚-硫酸法测多糖含量原理多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。

再以比色法测定。

试剂1．浓硫酸：分析纯，95.5%2． 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3． 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。

（每次测定均需现配）4．标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。

5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

7． 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

8． 6mol/L 盐酸操作1．制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2．样品含量测定：①取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。

最后一次将残渣一起到入离心管。

注意：总的溶液不要超出10毫升。

（既不要超出离心管的容量）。

②离心，转速3000转/分钟，共三次。

第一次15分钟，取上清液。

后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。

最后滤液保持18毫升左右。

（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。

因为其脂肪含量大容易夹带残渣。

）③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。

④定容取样。

水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。