Halo Tag

2022版 CTM694原英文技术手册TM694中 文 说 明 书适用产品目录号：E5911和E5912FuGENE ®4K TransfectionReagent普洛麦格(北京)生物技术有限公司Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd 地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909电话：************网址：技术支持电话：400 810 8133技术支持邮箱：*************************CTM 6942022制作1所有技术文献的英文原版均可在/ protocols 获得。

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电子邮箱：*************************1. 描述 (2)2. 产品组分和储存条件 (2)3. 一般注意事项 (2)3. A. 转染试剂与DNA的比例 (3)3. B. DNA (3)3. C. 时间 (3)3. D. 血清 (3)3. E. 细胞培养条件 (3)3. F. 稳定转染 (3)4. 推荐操作步骤 (4)4. A. 细胞铺板 (5)4. B. FuGENE® 4K Transfection Reagent准备 (5)4. C. 一般转染操作步骤 (6)4. D. 稳定转染操作步骤 (8)4. E. 转染优化 (9)4. F. 报告基因活性和细胞健康的多重检测方案 (11)5. 疑难解答 (12)FuGENE® 4K Transfection Reagent普洛麦格(北京)生物技术有限公司Promega (Beijing) Biotech Co., Ltd 地址：北京市东城区北三环东路36号环球贸易中心B座907-909电话：************网址：技术支持电话：400 810 8133技术支持邮箱：*************************CTM 6942022制作21. 描述FuGENE® 4K Transfection Reagent是一个多组分，非脂质体试剂，用于将DNA高效、低毒地转染至多种哺乳动物细胞系中，无需在加入试剂-DNA复合物后更换培养基。

蛋白表达载体系统重组蛋白表达技术和重组蛋白表达载体现已广泛应用于生物学各个具体领域,尤其是体内功能研究和蛋白质的大规模生产。

GeneCopoeia的蛋白表达载体按照表达宿主的不同分为3类:B类，M类和Lv 类。

B类的表达宿主为大肠杆菌，M类的宿主为哺乳动物细胞，Lv类是慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞或原代细胞。

除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体按荧光蛋白标签、多功能标签、促溶解度标签和抗体免疫共沉淀标签四种，先将几种主流的标签功能初步介绍如下：eGFP/eCFP/eYFP/mCherry分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白标签,具有不同的激发波长和发射波长，均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。

就eGFP而言，相对于GFP，其荧光强度更强、荧光性质更稳定。

同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白，可以和GFP系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。

这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：1.不用破碎组织细胞、不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。

2.其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。

3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测效果更快速、简便、灵敏度高而且重现性好。

4.其低消耗、高灵敏度检测的特性，十分适用于高通量的药物筛选。

现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。

随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。

目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。

美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。

以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。

TrxHISHis6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。

当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。

组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。

使用His-tag有下面优点：标签的量小，只有~，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能;His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性;His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究;His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。

可应用于多种表达系统，纯化的条件温和;可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

Flag标签蛋白Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

靶向EZH2-EED相互作用抑制剂的发现及抗肿瘤机制研究表观遗传(Epigenetics)是指基因的DNA序列没有改变的情况下,基因功能却发生可遗传的变化,最终导基因表型的变化。

表观遗传调控方式形式多样,过程可逆,控制细胞命运,调控个体正常生长发育有序进行,并与肿瘤,糖尿病,心脏病,肠道疾病等多种疾病的发生发展也密切相关。

因此表观遗传和基于表观遗传的药物开发近年来一直是研究的热点。

表观遗传主要的研究内容包括:DNA的甲基化,组蛋白的各种修饰,非编码RNAs等。

目前已上市的表观类抑制剂有8个,分属三个靶点,分别为2个DNA甲基化酶抑制剂,5个组蛋白去乙酰化酶抑制剂和1个异柠檬酸脱氢酶抑制剂(Isocitrate Dehydrogenase,IDH)。

多梳抑制复合物2(Polycomb Repressive Complex 2,PRC2)是表观遗传中一颇受关注的组蛋白甲基转移酶(Histone Methyltransferases)。

它是由EZH2(Enhancer of zeste homolog 2),EED(Embryonic Ectoderm Development),SUZ12(suppressor of zeste 12)和RbAp46/48等亚基构成的复合物,主要催化H3K27甲基化,导致靶基因启动子区H3K27的高度甲基化,继而使该基因转录沉默,影响细胞的多种生物学效应,如多个调控细胞分化过程的基因皆受该甲基转移酶的调控。

越来越多的研究表明EZH2与多种肿瘤的发生发展密切相关。

如在淋巴瘤,胰腺癌,黑色素瘤,乳腺癌,膀胱癌,胃癌等肿瘤中,都发现EZH2的异常表达和/或突变。

因此抑制PRC2复合物的活性被认为可能成为治疗肿瘤的新兴手段,很多科学家为此投入大量精力。

目前靶向PRC2的抑制剂多为针对EZH2的酶活抑制剂,数个正进行临床试验,但暂时没有药物上市。

EZH2既可以作为PRC2酶活催化亚基,通过H3K27me3依赖的形式抑制靶基因的表达,也可以直接激活一些非组蛋白,如直接甲基化Actin,激活GATA4(GATA binding protein 4),AR(androgen receptor)和ER(estrogen receptor))等。

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。

随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。

目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。

美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag™、Halo Tag™、AviTag™、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。

以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询克隆产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。

TrxHISHis6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。

当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。

组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。

使用His-tag有下面优点：标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能;His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性;His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究;His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。

可应用于多种表达系统，纯化的条件温和;可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

Flag标签蛋白Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

肿瘤自身抗体的研究进展程文婷【摘要】随着肿瘤的发病率日益增高,人们越来越重视肿瘤的早期筛查,但目前应用于临床的肿瘤标志物(癌胚抗原、甲胎蛋白及糖类抗原199等)大多特异性和敏感性不够高.由于机体的免疫监视作用而产生的针对肿瘤相关抗原的肿瘤自身抗体,因其出现时间早、特异性高、检测手段容易等优势而受到了越来越多研究者的关注.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2015(021)022【总页数】3页(P4095-4097)【关键词】肿瘤;自身抗体;血清学标志物【作者】程文婷【作者单位】南京市高淳人民医院检验科,南京211300【正文语种】中文【中图分类】R392.7近年来，癌症已悄然成为发达国家居民的首要致死因素和发展中国家的第二大致死因素[1]。

对于发展中国家来说，癌症的负担越来越重。

早期诊断和治疗能够有效降低癌症的病死率，而目前早期检测的手段主要有痰细胞学、肿瘤标志物及医学影像技术，但都各有利弊。

研究发现，肿瘤抗原能够诱导产生针对肿瘤的自身抗体，因为免疫应答能够在癌症早期起到生物信号放大的作用，如同抗原作为模板的聚合酶链反应一样，所以血清抗体在肿瘤抗原还没有被发现之前就已经能够被检测到[2]。

由此认为，肿瘤自身抗体有望代替肿瘤抗原成为非常有前景的肿瘤标志物。

现就肿瘤自身抗体的产生及目前的研究进展予以综述。

肿瘤自身抗体的产生机制目前尚未完全阐明，一些研究认为，这种免疫反应是由于肿瘤产生及恶化过程中对肿瘤相关抗原不断增加的免疫原性的一种自我免疫过程，如p53的免疫原性来自于其发生点突变、过表达及在肿瘤细胞内和细胞核内不断大量的积累[3]。

过量表达会增加抗原的负载，从而引发机体产生抗体。

还有研究认为，一些经过翻译后修饰(如糖基化、磷酸化及氧化等)的肿瘤抗原会被机体免疫系统识别为外来物质而产生新的抗原表位，或者增加自体抗原表位的呈递和对组织相容性复合物及T细胞受体的亲和性，引发免疫反应，产生自身免疫抗体[4]。

重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域。

特别是体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。

美国GeneCopoeia的蛋白表达载体按照表达宿主的不同新推出3类，分别为表达宿主为大肠杆菌，哺乳动物细胞的，以及慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞和原代细胞。

除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体分别按照功能标签的不同确定种类并将个标签的功能初步介绍如下：His6：His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。

当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。

组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。

使用His-tag有下面优点：1.标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能；2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；3.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；4.His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；5.可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

Flag:Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：1.FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。

Halo Tag 蛋白序列1. 引言Halo Tag（Halo标签）是一种研究蛋白质和基因的工具，用于标记目标蛋白质的表达和纯化。

本文将介绍Halo Tag蛋白序列的相关信息，包括其发现背景、结构特征、应用领域等。

2. 发现背景Halo Tag蛋白序列是由Haloferax volcanii这种古菌中发现的一种特殊蛋白质序列。

Haloferax volcanii是一种存在于高盐环境中的古菌，具有耐受极端环境的特性。

研究人员在对该古菌进行基因组测序时，发现了一段与传统蛋白质序列不同的序列，这便是Halo Tag蛋白序列。

3. 结构特征Halo Tag蛋白序列具有一些特殊的结构特征。

首先，它含有一个特定的氨基酸序列，该序列在Haloferax volcanii的细胞膜上具有极强的亲和力，能够非常牢固地与细胞膜结合。

其次，Halo Tag蛋白序列还包含了一段柔性的多肽链，这使得其在结构上更加灵活，方便与其他蛋白质相互作用。

4. 应用领域由于Halo Tag蛋白序列具有独特的结构特征和亲和力，因此它在许多生物学研究中得到了广泛的应用。

4.1 蛋白质表达和纯化Halo Tag蛋白序列可用于标记目标蛋白质的表达和纯化过程。

通过将Halo Tag蛋白序列与目标蛋白质序列融合，研究人员可以利用其亲和力特性，将目标蛋白质高效地从复杂的细胞提取物中进行纯化。

4.2 细胞成像Halo Tag蛋白序列还可以用于细胞成像。

研究人员可以通过将Halo Tag蛋白序列与荧光蛋白序列融合，将其转染到感兴趣的细胞中。

由于Halo Tag蛋白具有很强的亲和力，因此可以很容易地与细胞膜结合。

利用荧光显微镜等成像技术，可以直接观察和跟踪Halo Tag蛋白在细胞中的分布和运动情况，从而揭示其功能和调控机制。

4.3 基因工程Halo Tag蛋白序列在基因工程中也具有重要的应用。

研究人员可以利用Halo Tag蛋白序列的特殊结构特征，将其与其他蛋白质序列进行融合，从而改变目标蛋白质的性质或增加其功能。

Halo Tag® TMR Ligand
HaloTag® Interchangeable Labeling hnology(a,b,c)(HaloTag®-可交换标记技术)是一种用于表达HaloTag®蛋白或融合蛋白的活细胞或固定的哺乳动物细胞成像的新型工具，可用来分析标记融合蛋
白的翻译后修饰，并用于分离蛋白质及蛋白复合物。

该技术以报告蛋-白与其配基之间形成高效的共价键为基础，报告蛋白是经过特别设计的，由HaloTag® pHT2(a,b,c)载体或pFC8A及pFC8K (HaloTag®) CMVFlexi®载体编码(a-d)；这种共价结合可以发生在活细胞内、溶液内，或在固相支持物上。

HaloTag®载体包含有HaloTag®蛋白的开放阅读框(ORF)，是一种水解酶基因的基因工程衍生物。

对于哺乳动物细胞来说，HaloTag®蛋白无内源性表达，使得其标记具有高特异性。

HaloTag®配基(a,b,c) 可支持多种功能，包括荧光标记，亲和处理，并可粘附于固相上。

在一般的生理条件下，共价键可迅速形成，具有高度的特异性，该反应基本不可逆，其产生的复合物即使在严苛-条件下也能保持稳定。

该技术的开放式设计可适用于不同的配基。

目前，我们提供可穿透细胞膜的、分别带有红色、绿色或蓝色荧光标记物质的配基，以及穿膜能力不同的2种生物素配基。

HaloLinkTM-Resin(b) (Cat.# G1911)是一种固相支持物，可使HaloTag®融合蛋白直接粘附于Sepharose®表面。

第二章蛋白质结构基础1·名词解释蛋白质分子的构象：蛋白质分子中所有原子在三维空间中的排布2·填空氨基酸结构中有一个不对称的α碳原子，这就表示它有不同构型的两种立体结构L型和D 型。

3·判断β发夹结构属于二级结构（X）4·简答什么是基因表达的中心法则答：DNA转录成RNA，再翻译成蛋白质序列5·论述蛋白质的结构层次是如何界定的？答：1.蛋白质所含有的由遗传密码决定的标准氨基酸共有20种天然蛋白质大多是L型的，D型非常少（正确）2.简述氨基酸的基本组成氨基酸是由一个氨基、一个羧基、一个氢原子和一个称为侧链的R基团组成的。

组成蛋白质的氨基酸是一类特殊的氨基酸，氨基和羧基都在碳原子上，不同的氨基酸有不同的R基团3.名词蛋白质的二级结构，是指多肽链在氢键的作用下，沿一维方向排列成为具有周期性的结构的构象，它是肽链中局部肽段的构象，是完整肽链构象的结构单元，是蛋白质复杂构象的基础。

4.简述蛋白质都有哪些二级结构二级结构的类型有α螺旋、β折叠、回折和无规则卷曲。

一填空生命遗传中的中心法则是从DNA到RNA，再到蛋白质。

二名词解释卷曲：在蛋白质构象中，有一些有序但不重复的构象，它与仪螺旋、β折叠和转角等规则而重复的构象不同，仍是氢键，这种构象称之为卷曲。

三简答简述蛋白质的二级结构类型（二级结构的类型有α螺旋、β折叠、回折和无规则卷曲。

）四判断蛋白质的二级结构并不是一成不变的，一些因素可以引起蛋白质二级结构的改变。

（正确）五论述试论述蛋白质初级结构与高级结构的关系（答案略）1；名词解释pI定义：在某一pH值溶液中，Pr酸性基团和碱性基团的解离程度相当Pr分子所带正负电荷相等，净电荷为零此时溶液的pH值称为Pr的pI。

2；蛋白分子在溶液中形成稳定胶体的原因：表面形成水化层，表面同种电荷的斥力。

3；判断题：变性Pr不一定凝固凝固的Pr不一定变性。

（错误）准确答案：变性Pr不一定凝固凝固的Pr一定变性4；蛋白质分子引起280nm光吸收的最主要成分是｛D｝A.肽键B.半胱氨酸的-SH基C.苯丙氨酸的苯环D.色氨酸的吲哚环E.组氨酸的咪唑环5；H+、CO2和BPG对血红蛋白结合氧的影响1》.H+、和CO2促进氧的释放（Bohr效应）2》.ＢＰＧ降低Hb 对氧的亲和力第三章蛋白质的功能特性与改性加工一、名词解释1.吸湿平衡法2.乳化能力3.起泡能力4.蛋白质凝胶化5.化学改性二、填空题1.影响蛋白质溶解性的主要因素是-------和----------。