实验四、普通显微镜的使用及细菌的简单染色法

细菌一般染色方法细菌染色是一种常用的实验技术，通过染色使细菌在显微镜下能够更清晰地观察和分析。

细菌染色通常分为简单染色、阴性染色和阳性染色三种方法。

一、简单染色方法：简单染色是最基础的细菌染色方法，主要是用一种染色剂来染色所有类型的细菌。

常用的染色剂有墨汁、甲基蓝、伊红等。

简单染色的步骤如下：1.取一片细菌涂片，将其干燥。

2.在涂片上滴加染色剂，覆盖整个片面。

3.将染色剂置于片上一分钟，用水冲洗。

4.用纸巾将涂片上的多余水份吸干。

5.镶片并观察。

简单染色可以使细菌呈现出斑点或条纹状，并能够区分一些基本形态和结构，但不能提供更多细菌信息。

二、阴性染色方法：阴性染色可使细菌显现为透明，而背景呈色的方法。

常用的阴性染色剂有阿里兹红、印度墨等。

阴性染色的步骤如下：1.将涂片上的细菌涂片均匀涂抹于载玻片上，使其成薄层。

2.滴加阴性染色剂到涂片上，使其均匀覆盖涂片表面。

3.用水冲洗染色液，并用纸巾擦干涂片。

4.镶片并观察。

阴性染色使背景呈色，使细菌透明，从而可以更清晰地观察其形态特征。

三、阳性染色方法：阳性染色可以使细菌显现为有色的圆点或杆状，常用的阳性染色剂有甲基蓝、伊红等。

阳性染色的步骤如下：1.将涂片上的细菌涂片均匀涂抹于载玻片上。

2.将染色剂滴加到涂片上，使其完全覆盖涂片。

3.置片5-10分钟，然后用水冲洗染色剂。

4.用纸巾将涂片上的多余水份吸干。

5.镶片并观察。

阳性染色可以染色细菌，使其呈现有色的形态，便于观察和鉴定。

此外，还有一些特殊染色方法，如革兰氏染色法、氢酒精酸快速染色法等。

革兰氏染色是一种经典的细菌染色方法，通过不同细菌细胞壁的染色性质来将其分为革兰阳性细菌和革兰阴性细菌。

该方法使用革兰紫染色剂和碘液，以及酒精和碳酸盐条件溶液进行染色处理。

氢酒精酸快速染色法是一种常用的快速染色方法，将细菌用甲基蓝染色液处理一段时间后，用酒精和酸性酒精进行洗涤和脱色，最后用伊红染色液着色。

这种方法可以快速地将细菌分为两种主要类型：革兰阳性细菌和革兰阴性细菌。

实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。

2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。

3.巩固显微镜油镜的使用方法。

4.学习无菌操作技术。

二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。

当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。

2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。

革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。

另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。

如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。

三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。

2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。

3、干燥：涂片后待其自然干燥。

4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。

5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。

微生物学实验内容实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色实验二 . 细菌的革兰氏染色实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别实验四 . 酵母菌的数量测定实验五 . 酵母菌的大小测定实验六 . 微生物菌落的观察实验实验七 . 霉菌的形态观察实验八 . 培养基的制备与灭菌实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察实验十 . 微生物的纯种分离培养实验一 . 普通光学显微镜的使用一、目的要求1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。

2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。

二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。

它们由机械装置和光学系统两大部分组成。

在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。

而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。

与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：1. 增加照明亮度油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。

从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。

所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52）。

2. 增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。

从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式 P16 ）式中λ= 光波波长；NA=物镜的数值孔径值。

光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA=n × sin α式中α为光线最大入射角的半数。

实验二普通显微镜的使用及细菌的简单染色法一、实验目的1.学习并掌握油镜的原理和实使用方法。

2.复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。

二、实验原理（一）.普通显微镜普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。

它们由机械装置和光学系统两大部分组成。

在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。

而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大。

使用油镜时，需在载玻片与镜头之间加滴油，原因：1.增加照明亮度。

2.增加显微镜的分辨率。

（二）.简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

它适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色，因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带有负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。

经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更容易于识别。

常用做染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。

三、实验器材1.菌种细菌营养琼脂平板培养物。

2.染色剂结晶紫染液。

3.仪器或其他用具显微镜，酒精灯，接种环，擦镜纸，生理盐水等。

四、操作步骤1.涂片取两块载玻片，各滴一滴生理盐水于玻片中央，用接环以无菌操作从细菌平板上挑取少许菌体于水滴中，混匀并涂成薄膜。

2.干燥室温自然干燥。

3.固定涂面朝上，通过火焰2~3次。

此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。

4.染色将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上。

5.水洗倒去染液，用自来水冲洗，直至图片上流下的水无色为止。

6.干燥自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。

7.镜检涂片干燥后镜检。

（1）在低倍镜下观察。

（2）在高倍镜下观察。

（3）在油镜下观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。

微生物学实验报告实验一普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察第一部分：显微镜的使用一、目的要求1．熟悉普通光学显微镜的构造、油镜的使用原理和显微镜的维护方法。

2．学会正确使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造。

3．了解各种显微镜的主要特征。

二、实验原理（一）光学显微镜的构造微生物实验室中最常用的是普通光学显微镜，它的构造可分为机械部分和光学部分。

1、机械部分普通复式光学显微镜的机械部分通常包括以下几个部分：目镜、镜筒、基座回转器、物镜、载物台、光圈、聚光器、光源、镜臂、细调节器、粗调节器等。

2、光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、光源。

（二）放大倍数标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。

总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。

物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短，这时光圈就要打开得愈大。

显微镜的性能受物镜的分辨距离或分辨力所限制。

分辨距离即透镜所能分辨的两个物点之间的最小距离，分辨距离愈小，透镜的分辨力愈高，物像也就愈清晰。

因此常以分辨距离来衡量显微镜的分辨力。

R=0.61λ/N.A式中：R-----分辨距离；λ------作用光的波长；N.A------数值口径。

一些介质的折射率介质折射率空气水玻璃香柏油1 13 55 1.56三、实验内容（一）材料：显微镜，香柏油，擦镜纸。

（二）方法：细菌很小，须使用油镜方可观察到。

油镜是显微镜上最重要的部件之一，观察时与玻片非常接近，稍不小心即可压碎玻片，更严重的是损坏镜头，故必须极其仔细地学习油镜的使用方法：1、为使低倍镜取得最适之光源，可将低倍镜头调节到离载物台约1cm的高度，将聚光器提高，光圈完全打开，然后调节电压旋钮至视野最合适。

2、滴一滴香柏油，固定于载物台上，用推动器调节到载物台正中。

在双目侧视下，下旋粗调节器，使油镜头浸入油中几乎与标本片相接触。

然后眼睛从目镜观察（如光线不足，可适当增大电源电压），徐徐上旋粗调节器至看到模糊物像之后，再用细调节器调节以使物像清晰。

实验一普通显微镜的使用和细菌形态观察1 目的(1)学习并掌握油镜的工作原理和使用方法。

(2)复习光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。

2 原理微生物的最显著特点是个体微小，必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构。

熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。

实验将介绍目前微生物学研究中最常用的普通光学显微镜的结构和样品制作。

的在于使同学们通过实验，对光学显微镜有比较全面的了解，并重点掌握明视野通光学显微镜中油镜的使用。

3 材料3.1 菌种金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)染色玻片标本。

链霉菌(Streptomyces sp .)及青霉菌(Penicillium sp.)的水封片。

3.2 溶液或试剂香柏油、二甲苯。

3.3 仪器及其他用品显微镜、擦镜纸等。

4 流程安置一＞调光源一＞调目镜一＞调聚光器一＞镜检(低倍镜一＞高倍镜一＞油镜)一＞擦镜一＞复原5 步骤5.1 观察前的准备5.1.1 显微镜的安置置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约l0cm。

镜检时姿势要端正。

5.1.2 光源调节安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，若使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。

5.1.3 双筒显微镜的目镜调节根据使用者的个入情况，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。

5.1.4 聚光器数值孔径值的调节正确使用聚光镜才能提高镜检的效果。

聚光镜的主要参数是数值孔径，它有一定的可变范围，一般聚光镜边框上的数字是代表它的最大数值孔径，通过调节聚光镜下面可变光阑的开放程度，可以得到各种不同的数值孔径，以适应不同物镜的需要。

5.2 显微观察在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。

细菌的简单染色法和革兰氏染色法1细菌的简单染色法和革兰氏染色法陈慧霞食品13102班0201一引言1.学习并掌握细菌简单染色法的原理和方法。

2. 掌握革兰氏染色法的原理和操作技术,进一步巩固显微镜(油镜)的使用方法和无菌操作技术。

二实验原理1.简单染色法用单一染料进行细菌染色,操作简便,适于菌体一般形状和细菌排列的观察。

一般情况下,细菌细胞通常带负电荷,易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。

因此,常用碱性染料进行简单染色。

常见的碱性染料有亚甲蓝、甲基紫、结晶紫、碱性复红、中性红、孔雀绿和番红等。

2.革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

革兰氏染色的原理主要是因为两类细菌的细胞壁成分和结构不同。

革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了番红的颜色,因此呈现红色。

而革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖的含量多且交联度大,类脂质含量少,当用乙醇处理时,肽聚糖层的孔径变小,通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易着色,因此,细胞仍保留初染时的颜色即呈现紫色。

细菌先经碱性染料结晶紫染色,再经碘液媒染(以增加染料与细胞的亲和力)后,用乙醇脱色,再用番红染色。

不被脱色而保持原颜色者为革兰氏阳性菌(G+);被脱色后又被染上复染剂的颜色者为革兰氏阴性菌(G-)。

三实验材料1简单染色法菌种:枯草芽孢杆菌试剂与器材:复红,接种环,酒精灯,打火机,载玻片,吸水纸。

2革兰氏染色法菌种:大肠杆菌,金黄色葡萄球菌染液:结晶紫染液,碘液,95%乙醇,番红染液,香柏。

器材和试剂:洗净的载玻片,显微镜,酒精灯,接种环,擦镜纸,吸水纸,镊子,玻璃废液缸,蒸馏水等。

四实验步骤1.无菌操作:1.关闭窗户和风扇2.用酒精棉双手表面消毒3.接种环取菌前后焚烧灭菌4.棉塞靠近火焰不离手5.实验在酒精灯附近进行6.少说话2.简单染色法:●准备玻片:取清洁干净的载玻片。