15生物化学实验琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用

实验2 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察（一）原理琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定三羧酸循环途径是否存在。

琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢，产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水。

在缺氧的情况下，若有适当的受氢体也可显示出脱氢酶的作用。

如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。

这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。

琥珀酸+ 甲烯蓝琥珀酸脱氢酶延胡索酸+ 甲烯白无氧条件丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。

若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。

如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。

（二）试剂1．1.5%琥珀酸钠溶液：称取琥珀酸钠1.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。

如无琥珀酸钠可用琥珀酸配成水溶液后，以氢氧化钠溶液中和至pH7~8。

2．1%丙二酸钠溶液：称取丙二酸钠1g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。

3．0.02%甲烯蓝溶液。

4．1/15mol/LNa2HPO4溶液：取Na2HPO4 · 2H2O 11.8g，用蒸馏水溶解并稀释至1 000ml。

5．液体石蜡。

（三）操作1．猪心脏制备液：称取新鲜猪心1.5~2.0g放组织捣碎机中，加入等体积的石英砂及1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml，捣碎成浆，再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液，放置1小时，不时摇动，离心取上清液备用。

2．取4支试管，编号并按下表操作：试管心脏制备液 1.5%琥珀酸钠溶液1%丙二酸钠溶液蒸馏水0.02%甲烯蓝溶液（滴）（滴）（滴）（滴）（滴）1 5 5 －10 22 5 5 －10 2（先煮沸）3 5 5 5 5 24 5 10 5 5 23．各管溶液混匀后，每管各加液体石蜡一薄层（约5~10滴）。

3、丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂
浓 度
4、本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，
以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢
酶活性的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
延胡索酸ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FAD
FADH2
三、操作步骤：
1、酶提取液的制备 1 g 兔肌肉、剪碎＋海沙（研磨成糜状）
＋12 ml 1/15M磷酸盐缓冲液 (区别于0.1mol/L) （两次，研成糊状）；纱布过滤
２、酶促反应及竞争抑制作用
试剂（滴） １ ２ ３ ４ ５
酶提取液
20 20 20 20 -
0.2 mol/L琥珀酸 4
4
4
-
4
0.02mol/L琥珀酸 -
-
- 4-
0.2 mol/L丙二酸 -
4
-
4
-
0.02mol/L丙二酸 -
-4--
蒸馏水
4
-
-
- 24
0.02%甲烯蓝
2 2 2 22
3、 各管混匀，加石蜡5滴隔绝空气， 37℃水浴
保温，观察褪色情况。（斜执试管，沿壁缓慢加， 不要产生气泡）
四、结果、讨论： 阴性对照
编号 １
２
３
４
５
时间
10min
20min
30min 40min 50min 60min
褪色快
不褪色 褪色缓慢 不褪色 不褪色
五、注意事项：
1 、充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清 洗，注意回收。
2 、滴加液体石蜡。(实验结束,试管用洗衣粉刷净) 3 、观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧
实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制[原理]肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。

反应中生成的FADH2可使蓝色的甲烯蓝还原为无色的甲烯白(还原型甲烯蓝)。

丙二酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心。

丙二酸与琥珀酸脱氢酶结合后，酶活性受到抑制，则不能再催化琥珀酸的脱氢反应。

抑制程度的大小，随抑制剂与底物两者浓度的比例而定。

本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔绝空气的条件下，通过甲烯蓝的褪色程度来判断琥珀酸脱氢酶的活性，并籍此观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。

CH2COOHCH2 COOH FAD MB•2H（甲烯白）琥珀酸琥珀酸脱氢酶CHCOOHHOOCCH FADH2MB（甲烯蓝）延胡索酸[试剂]1．0.2mol/L琥珀酸: 取琥珀酸钠(MW:270.14)27克加水至500ml。

2．0.02mol/L琥珀酸: 取1液稀释10倍。

3．0.2mol/L丙二酸: 取丙二酸钠(MW:166.05)16.7克加水至500ml。

4．0.02mol/L丙二酸: 取3液稀释10倍。

5．1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲: 1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO419.2ml 混合即成。

（1）1/15mol/LNa2HPO4溶液: 取Na2HPO4.12H2O （MW：358.14）23.876 克, 加水至1000ml。

（2）1/15mol/LKH2PO4溶液:取KH2PO4（MW：136.09）1.814克,加水至200ml.6．0.02％甲烯蓝溶液7．液体石蜡[主要器材]1．新鲜猪心2．玻璃研钵3．漏斗4．手术剪5．棉花6．恒温水浴箱[操作步骤]1．心肌提取液的制备取新鲜猪心约6g，用蒸馏水清洗后剪成碎块，置于研钵中，加入适量净沙，研磨成糜状。

再加1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液12ml，研成糊状，用棉花过滤，滤液即为猪心提取液。

丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用按抑制类新艺术语
酯酶的抑制作用：二乙酰丙二酸的作用机制
琥珀酸脱氢酶(EC 1.1.1.35)是酯酶系列中一种重要的蛋白酶，其主要作用是将脂肪酸酯(如甘油酯)和羧酸酯(如肌酸酯)脱氢，以合成其对应的醇和酸。

而二乙酰丙二酸(Ki)是一种具有重要抑制作用的有机酸，它能够有效抑制琥珀酸脱氢酶活力，从而减缓或阻止脂肪酸的脱氢作用。

二乙酰丙二酸的功效机理主要是因为它能够和蛋白质酶特异性结合，抑制酶的活性。

它能够和蛋白质酶中的硫氨基酸残基特异性结合，形成二酰丙二酸硫酰亚铁羧酸复合体，其大小与聚醚聚丙烯酰胺第1聚类似，这样就造成蛋白质酶活性位点的变化，达到抑制作用。

另外，由于二乙酰丙二酸具有很高的抑制效果，因此它也可以用于控制药物的渗透、吸收和分解，从而提高药物的疗效。

综上所述，可以得出结论，二乙酰丙二酸是一种可抑制琥珀酸脱氢酶的有效机制。

它可以通过特异性结合蛋白质酶中的硫氨基，形成二酰丙二酸硫酰亚铁羧酸复合体，从而抑制脂肪酸脱氢作用，有效提高药物的疗效，从而达到降低脂肪含量的目的。

五．实验结果记录
试管1 试管2 试管3 试管4 试管5 试管6 [I]/[S] 0 0.1 1 10 0 0 褪色时间（分钟）
六．注意事项




1、酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降 低。 2、加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气 中的氧气对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要 倾斜，注意不要产生气泡。 3、37℃水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空 气中的氧气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重 新氧化成蓝色。 4、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各试管 的褪色情况。 5、实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体 石蜡。
二、实验原理
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀 酸竞争，而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶 已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种 现象称为竞争性抑制。如相对地增加琥珀酸的浓度， 则可减轻丙二酸的抑制作用。
三．器材与试剂


1. 器材 大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、 量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、 恒温水箱、电热水浴锅 2. 试剂 0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶 液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L丙二 酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）、 0.02％甲烯蓝、液体石蜡
四.操作步骤

2.取试管6支，编号，再按下表步骤操作：
0.2mol/L 0.02mol/ 0.2mol/L 0.02mol/L 蒸馏水 甲烯蓝 琥珀酸溶 L琥珀酸 丙二酸溶 丙二酸溶液 （滴） （滴） 液（滴） 溶液（滴） 液（滴） （滴） 8 8 4 8 8 3
酶提 磷酸缓 取液 冲液 (ml) (ml) 试管1 2 试管2 2 -

试剂试管编号2煮沸002moll丙二酸钠溶液ml002moll琥珀酸钠溶液ml将各试管摇匀倾斜试管沿管壁滴加液体石蜡5滴盖在液面以隔绝空气
生物化学实验之－－
实验五 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
山东师范大学生命科学学院
【实验目的】
了解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 作用。

【实验原理】
由于丙二酸与琥珀酸结构相似，可以竞争性 地抑制琥珀酸脱氢酶对于琥珀酸的脱氢作用。 在生物体内，肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶， 能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸，同时放出大 量能量供肌体利用。
【思考题】
1. 为什么酶液的提取要在冰浴中进行？ 2. 各管中美蓝的褪色情况有何不同？为什么？
氧化型（蓝色）
【器材与试剂】
（一）器材 1. 恒温水浴锅 3. 研钵 5. 试管架 7. 漏斗 9. 脱脂棉 2. 手术剪 4. 试管 6. 刻度吸管 8. 小白鼠的肌肉 10. 吸水纸
（二）试剂 1. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） 2. 0.02mol/L丙二酸钠溶液 3. 0.02mol/L琥珀酸钠溶液 4. 0.01%美蓝溶液 5. 生理盐水 6. 液体石蜡
—
1 2 5
1
— 2 5
—
1 2 5
3. 将各试管摇匀，倾斜试管，沿管壁滴加 液体石蜡5滴，盖在液面，以隔绝空气。置于 370C水浴中保温，随时观察各管中美蓝的褪色 情况，并记录时间，解释结果。
【要点提示】
1. 提取酶液需在冰浴中进行，以防酶失活。 2. 实验过程中，需快速加入试剂，摇匀后迅 速加入液体石蜡。 3. 加液体石蜡的目的是为了使反应液与空气 隔绝，因此加液体石蜡时需斜执试管，沿管壁 加入，不要产生气泡。 4. 加完液体石蜡后，在观察结果的过程中， 不要摇动试管，以免溶液与空气接触而使美蓝 重新氧化变蓝。

1.琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察2.紫外分光法测定核酸含量本实验分组为15组，如果为16组，相应材料要增加。

需要的试剂配制方法注意事项1.5%琥珀酸钠溶液7.5g琥珀酸钠→500ml→15小瓶没有琥珀酸钠则用琥珀酸代替后用NaOH调和至PH7.01%丙二酸钠5g丙二酸钠→500ml→15小瓶没有丙二酸钠则用丙二酸代替后用NaOH调和至PH7.00.02%甲稀蓝0.1g甲稀蓝→500ml→15小瓶（棕色瓶）甲稀蓝别名亚甲酰蓝1/15mol/L Na2HPO4 23.6g Na2HPO4 →2000ml→15大瓶石蜡油可以不用分装每个房间在水浴锅前放1个核酸称一定量的小牛胸腺DNA融入0.1%的NaOH5-50ug/mL浓度羊的心脏切碎成小块大约2g左右提前购买，将皮、脂肪处理掉分割后放在冰箱里石英砂均匀的撒在上面注：每三个人一组，分为15组。

如果人数多可以适当多分几瓶试剂。

所需仪器所需数量40ml试剂瓶4560ml试剂瓶15试管4x152x15 共90个移液管（优先10ml的本次用5ml移液管）15研钵15种类数量心脏提取液151.5%琥珀酸钠151%丙二酸钠150.02%甲稀蓝15蒸馏水15液体石蜡 2胶头滴管共77个紫外吸收法测定核酸含量1、实验目的：1.掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理2.掌握利用紫外线分光度计测定核酸含量二、实验原理：DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处紫外线吸收是嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C 一），能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。

等书上112页三、实验试剂与器材DNA样品紫外分光光度计四、实验步骤1.取DNA样品5ml，于紫外分光光度计上测定260nm与280nm处的OD值按下式按下式计算核酸浓度计算核酸浓度 DNA的质量浓度(mg/l)=OD260nm/0.020xL x稀释倍数计算核酸纯度=OD260nm/OD280nm2.取DNA样品5ml，沸水浴中加热5min于紫外分光光度计上，测260nm处的OD值比较DNA前后吸光度OD的差异。

丙二 酸对琥 珀 酸脱 氢酶 活性 的 抑制 程 度闭 。该实 验 的具 体操
作 见表 １
表 １ 经 典丙 二 酸 对 琥 珀 酸 脱 氢 酶 的 竞 争 性 抑 制 作 用（ 滴 “ ，， ４ 表 示 试 管 号 １２ ３，”
加好 后 摇匀 ，滴 加 石 蜡 隔绝 氧 气 ，７ ３ ℃水 浴 随 时 比较各 管 颜色 退色 顺序 。 果 同前 ， 释 同前 ， 这样 的改 进 可让 学 结 解 但
２经典竞 争 性抑 制验 证 实验 的缺 陷及 改进
通 过 加 入大 量 底物 ， 高 底物 的 竞争 力 ， 除 竞 争 性 抑制 剂 提 消
的抑制 作用 。
１传 统 的 竞 争 性 抑 制 作 用 的 验 证 实 验
经典 实 验 中 ２号 管 加入 的正 常 底 物琥 珀 酸 钠 的 滴数 和 加入 的抑 制 剂丙 二 酸钠 的滴 数相 同 。 管 溶 液丙 二 酸钠 的百 尽 分 比浓度 比琥珀 酸钠 的 百分 比浓 度 低 ， 这 种等 滴数 加 入 的 但
了抑 制剂 的抑制 作用 ， 以退 色速 度 比 ２号 管快 。 见 ， 个 所 可 这
实 验确 实 验证 了竞 争 性抑 制 作 用 的 部 分性 质 ， ： 争性 抑 即 竞 制作 用 的抑 制程 度取 决 于抑 制剂 与 底物 浓 度 的相 对 比例 ， 当 抑 制 剂浓 度 不 变时 ， 加底 物 浓 度 。 减 弱抑 制 剂 的 抑 制程 增 可 度。
情况 下 ， ４号管 底 物 浓度 比 ２号管 增 大 一倍 。因此 部 分 减弱
以通过 透析 、 滤 等物 理方 法 除去 抑制 剂 而恢 复 酶 的活 性 的 超 现象 ： 争性 抑制 作用 是在化学 结构 上 与底 物类 似 ， 与底 物 分子 竞争 性 与酶 分 子 的 能 活性 中 心非 共 价结 合 ， 占据 酶 的活 性 中心 ， 底 物 分 子 无法 使 与酶 的活性 中心 结合 ． 从而 抑制 酶 的活性 『 竞 争性 抑制 剂 的 Ｉ 】 。 抑制程 度取 决 于抑制 剂 与底 物 浓度 的相 对 比例 闭 。当抑 制剂 浓度 不 变时 ， 制程 度 随底 物 浓 度 的增 加 而 减 弱 。 终 可 以 抑 最

实验十六:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用【实验名称】：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用09救援一班第三大组李岚宇2009222336室温：25℃（一）实验目的：1、学习和掌握竞争性抑制作用的特点。

2、观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。

（二）实验原理：化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与底物竞争结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚至丧失，这种抑制作用称为竞争性抑制作用。

琥珀酸脱氢酶是机体内参与三羧酸循环的一种重要的脱氢酶，其辅基为FAD，如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。

这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。

丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。

若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。

如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。

（三）实验材料与仪器：1器材大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、恒温水箱、电热水浴锅2试剂0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L 丙二酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液、0.02％甲烯蓝、液体石蜡。

（四）实验步骤:1、酶提取液的制备：去大白鼠的肝脏、心脏、肾脏，用冷水洗3次，加入1/15mol/L磷酸缓冲液pH 在7.4。

在匀浆器中进行匀浆，然后用纱布过滤，用干净的烧杯收集过滤的备用。

2、取试管6支，编号，在按图步骤操作，酶提取液（ml）磷酸缓冲液（ml）0.2mol/L琥珀酸（滴）0.02mol/L琥珀酸（滴）0.2mol/L丙二酸溶液（滴）0.02mol/L丙二酸溶液（滴）蒸馏水（滴）甲烯蓝（滴）褪色时间（分钟）试管1 2 - 8 - - - 8 3 3分33秒试管2 2 - 8 - - 8 - 3 5分30秒试管3 2 - 8 - 8 - - 3 6分04秒试管4 2 - - 8 8 - - 3 7分28秒试管5 - 2 8 - - - 8 3 无限大试管6 2 - 8 - - - 8 3 无限大试管6，在酶提取液先在100℃的水浴加热煮沸5min。

琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用【目的】1 ．把握琥珀酸脱氢酶作用及丙二酸抑制作用的实验技术与原理。

2 ．深化明白得酶的竞争性抑制作用的特点。

【原理】肌肉组织含有的琥珀酸脱氢酶是一种结合蛋白酶，以FAD 为辅基。

它能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，FAD 同意氢生成FAD·2H 。

体外实验以美蓝( 甲烯蓝) 为受氢体，使美蓝还原生成美白( 甲烯白) 。

其反映如下：琥珀酸脱氢酶活性越高，美蓝脱色所需的时刻越短，由于美白易被空气中的氧氧化成美蓝。

故实验需在无氧条件下进行，可加一层液体石蜡以隔间空气。

丙二酸与琥珀酸的化学结构很相似，能和琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酶结合，从而抑制琥珀酸的脱氢作用。

其抑制程度与抑制剂和底物二者的浓度有关。

本实验通过不同浓度的琥珀酸和丙二酸来观看丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用。

【器材】1 ．研钵与剪子2 ．漏斗3 ．纱布4 ．恒温水浴【试剂】1 ．0.2mol/L 琥珀酸溶液2 ．0.02mol/L 琥珀酸溶液3 ．0.2mol/L 丙二酸溶液4 ．0.02mol/L 丙二酸溶液以上四种溶液均先用5mol/L NaOH 溶液调至pH7.0 ，再用0.01mol/L NaOH 溶液调至pH7.4 。

直接用琥珀酸钠或丙二酸钠配制亦可。

5 ．1/15mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4 ）1/15mol/L Na 2 HPO 4 80.8ml 与1/15mol/L KH 2 PO 4 19.2ml 混匀即可。

6 ．0.02% 美蓝溶液7 ．液体石蜡【操作】1 ．肌肉提取液的制备取用蒸馏水清洗过的新鲜动物肌肉组织约10g ，置于研钵（或匀浆器）中，研磨成糜状，然后每克肌肉组织加4 倍体积的冰凉的pH7.4 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液，混匀，用双层纱布过滤，取滤液备用。

2 ．酶促反映取试管5 支，编号，按下表操作。

将上述各试管液混匀后，沿各管壁加入液体石蜡5 ～10 滴，使其在液面形成一薄层以隔间空气。

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制实验报告的心得体会
琥珀酸脱氢酶（SDH）是一种酶,参与生物体内的三羧酸循环。

SDH的主要功能是将琥珀酸氧化为富能的丙酮酸和二氧化碳,为细胞提供能量。

SDH的活性受到一些物质的影响,例如甲肝灵等药物就可以抑制SDH的活性。

竞争性抑制实验是在SDH的底物琥珀酸中加入不同浓度的抑制剂,观察SDH的活性变化。

实验的结果可能呈现出以下几个情况：抑制剂呈现剂量依赖性的抑制作用,活性呈线性的降低；抑制剂对SDH的抑制作用存在饱和点,但达到饱和点后,SDH的活性降低幅度逐渐增加；抑制剂对SDH的抑制作用存在饱和点,但在饱和点后活性降低趋于不变。

实验者可以通过这些结果,得到抑制剂的半数抑制浓度（IC50）,进而评价抑制剂的效果。

在实验中,我们观察到抑制剂呈现剂量依赖性的抑制作用,且具有饱和点。

这说明抑制剂与SDH结合的速度是有限的。

从实验结果中可以看出,IC50值比较低,这表明抑制剂的效果比较好。

实验结果为我们提供了有关SDH的一些基本信息,也有助于我们更好地理解如何控制相关疾病,比如心肌缺血。

在这个实验中,我深刻认识到了科学研究的重要性,同时也学会了如何进行实验和如何分析实验结果。

这些经验对于我的学习和未来的研究都有一定的启示作用。

1.酶的提取液的制备：将大白鼠处死，取骨骼肌， 切成碎片后，放入研钵中，每组取8g左右，加入 1/15mol/L的Na2 HPO4溶液5ml研成糊状后，再加 入5ml1/15mol/L的Na2 HPO4溶液，混匀后，用纱 布过滤，用干净的烧杯收集备用。
2.取试管5支，按照下列表格操作：
3.各管混匀后，沿试管的内壁加入石蜡油（隔绝空 气），放置到37℃水浴中保温，观察各管甲烯蓝的 褪色情况，并记录褪色的所需要的时间，解释其现 象。
1、酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降低。 2、加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气中的氧气 对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要倾斜，注意不要 产生气泡。 3、37℃水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空气中的氧 气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重新氧化成蓝色。 4.、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各试管的褪色 情况。 5、实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体石蜡。
各管混匀后沿试管的内壁加入石蜡油隔绝空气放置到37水浴中保温观察各管甲烯蓝的褪色情况并记录褪色的所需要的时间解释其现1酶提取液的制备应操作迅速以防止酶活性降低
1. 掌握竞争性抑制的概念和特点。 2. 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。 3. 分析实验现象。
• 化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与底物竞争 结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚至丧失，这种抑制 作用称为竞争性抑制作用。琥珀酸脱氢酶其辅基为FAD， 如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱 氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色 的甲烯白。这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。 丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和 琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则 不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。如相 对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。

实验五琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制【实验目的】1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。

2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。

【实验原理】存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。

反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。

若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。

本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。

【实验用品】1、试剂（1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）:0.1mol/L NaH2PO419ml 加0.1mol/LNa2HPO481ml。

（2）0.093mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。

（3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。

（4）0.02%甲稀蓝溶液。

（5）液体石蜡。

2、器具（1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：0.1mol/L NaH2PO419ml加0.1mol/LNa2HPO481ml。

（2）0.93mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。

（3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1.5g溶于100ml蒸馏水中。

（4）0.02%甲烯蓝溶液。

（5）液体石蜡。

2、器具（1）恒温水浴箱（2）研钵或组织匀浆机【实验操作】新鲜免肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7.4的0.10mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200g/L的肝匀将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。

【思考题】1、抑制的分类及其特点？2、本实验中液体石蜡起什么作用?3、各管中的反应体系配好后为什么不能再摇动?4、制备肝浆时用磷酸缓冲液，可否换用蒸馏水，为什么？。

实验十琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制一、实验目的1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。

2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。

二、实验原理存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。

反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。

若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。

本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。

这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。

三、实验仪器、材料和试剂1、仪器：恒温水浴锅，研钵或组织匀浆机2、材料和试剂（1）新鲜兔肝（2） 0、10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7、4）：0、1mol/L NaH2PO419 ml 加0、1mol/LNa2HPO481ml。

（3）0、093 mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1、5g溶于100 ml蒸馏水中。

（4）0、10 mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1、5g溶于100 ml蒸馏水中。

（5）0、02%甲稀蓝溶液。

（6）液体石蜡。

四、实验操作新鲜兔肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7、4的0、10 mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200 g/L的肝匀浆液备用。

取五支试管分别编号，按下表配制反应体系：试剂管号0、093 mol/l琥珀酸钠0、10 mol/l丙二酸钠0、10mol/l(pH7、4)磷酸缓冲液肝匀浆液0、02%甲烯蓝11ml2ml1ml3滴21、5ml0、5ml1ml1ml3滴31ml1ml2ml3滴42ml1ml1ml3滴51ml1ml1ml1ml3滴将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。

对酶活性的抑可逆性抑制作用 非竞争行抑制作用 反竞争性抑制作用
抑制剂(I)与底物(S)的结构相似，能与底 物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复 合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制 作用称为竞争性抑制作用。 E+S ES E+P
• 反应模式
竞争性抑制作用
2、取试管5支，按照下列表格操作：
3、各管混匀后，沿试管的内壁加入 石蜡油（隔绝空气），放置到37℃ 水浴中保温，观察各管甲烯蓝的褪 色情况，并记录褪色的所需要的时 间，解释其现象。
五、结果与分析：（Results and Analysis
）
根据实验的现象，观察得到的结果，并解释 其相关的实验现象。为什么滴石蜡油？
四、操作步骤（Operating Procedure）
1 酶的提取液的制备：将兔子处死，取出肝 脏，切成碎片后，放入乳钵中，每组取8g 左右，加入1/15mol/L的Na2 HPO4溶液 5ml研成糊状后，再加入5ml1/15mol/L的 Na2 HPO4溶液，混匀后，倒入离心管中， 2000转/分钟离心4分钟，取上清液转入其 它试管备用。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
FAD
COOH CH2 COOH
丙二酸
延胡索酸
COOH
FADH2
无 氧
甲烯蓝（MB） 甲烯白（MBH2） +FAD
三、实验材料、主要仪器和试剂 （Equipments , Materials and Agents）
• • • • • • • • • （一）主要仪器：离心机、恒温水箱。 （二）主要试剂： 1．0.2mol/L 琥珀酸 2．0.02mol/L 琥珀酸 3．0.2mol/L 丙二酸 4．0.02mol/L 丙二酸 上述四中溶液调节pH值为7.4。 5．0.02%甲烯蓝 6．1/15mol/L的Na2 HPO4

实验五琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制【实验目的】1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。

2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。

【实验原理】存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。

反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。

若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。

本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。

【实验用品】1、试剂（1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）:0.1mol/L NaH2PO419ml 加0.1mol/LNa2HPO481ml。

（2）0.093mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠 1.5g溶于100ml蒸馏水中。

（3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠 1.5g溶于100ml蒸馏水中。

（4）0.02%甲稀蓝溶液。

（5）液体石蜡。

2、器具（1）0.10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：0.1mol/L NaH2PO419ml加0.1mol/LNa2HPO481ml。

（2）0.93mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠 1.5g溶于100ml蒸馏水中。

（3）0.10mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠 1.5g溶于100ml蒸馏水中。

（4）0.02%甲烯蓝溶液。

（5）液体石蜡。

2、器具（1）恒温水浴箱（2）研钵或组织匀浆机【实验操作】新鲜免肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7.4的0.10mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200g/L的肝匀浆液备用。

取五支试管分别编号，按下表配制反应体系：试剂管号0.093mol/L琥珀酸钠0.10mol/L丙二酸钠0.10mol/L(pH7.4)磷酸缓冲液肝匀浆液0.02%甲烯蓝1 —1ml 2ml 1ml 3滴2 1.5ml 0.5ml 1ml 1ml 3滴3 1ml 1ml 2ml —3滴4 2ml —1ml 1ml 3滴5 1ml 1ml 1ml 1ml 3滴将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。