冰冻切片切片RNA FISH方法及详细步骤

冰冻切片技术各流程常用方法和试剂下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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冰冻切片步骤很全面冰冻切片是一种常用的实验技术，在生物学、医学研究、组织学观察等领域有着广泛应用。

以下是一份详细的冰冻切片步骤，旨在提供全面的指导。

注意，不同的实验目的可能会有一些差异，因此请根据实际需求调整步骤。

1.準备1.1获取你所需的样本。

这个样本可以是活体动物的组织，也可以是固定处理后的组织。

1.2准备冷冻介质。

通常使用的冷冻介质包括液氮、干冰和冷冻套。

液氮是一种非常冷的液体，可以迅速冻结样本。

干冰是固态二氧化碳，可以提供较低的温度。

冷冻套是一种装置，可以通过循环冷却剂来维持全套工具的较低温度。

1.3准备工具和设备。

这些工具和设备通常包括切片机、切片模具、刀片、显微镜片和刷子。

1.4调整工作环境。

确保实验室温度适宜、空气流通，并消毒工作台和其他工具。

2.样本取样和固定2.1根据实验目的，选择合适的样本区域。

例如，在动物研究中，你可能需要选择大脑的特定区域。

2.2切下样本。

使用手术器械，例如手术剪刀和手术刀，在样本区域周围切下足够大小的组织块。

2.3快速固定样本。

使用适当的固定液将样本固定。

常用的固定液包括10%缓冲福尔马林和4%聚乙二醇。

将样本完全浸没在固定液中，确保完全固定，避免其损伤。

3.冷冻3.1冷冻样本。

将固定的样本迅速置于冷冻介质中。

如果使用液氮，直接将样本放入液氮中。

如果使用干冰，将样本放入常温下事先准备好的干冰盒中，并立即放入冷冻套中。

3.2冷冻条件。

根据样本的性质和实验要求，选择适当的冷冻条件。

通常情况下，液氮的温度低于-150°C，而干冰的温度大约为-78°C。

3.3冷冻时间。

样本的冷冻时间取决于其大小和固定液的穿透性。

通常情况下，较小的样本需要较短的冷冻时间，而较大的组织块需要较长的冷冻时间。

一般而言，冷冻时间为几个小时到几天。

4.切片4.1为切片做准备。

在切片之前，将切片模具放在切片机上，并冷却至所需的温度。

同时，将刀片插入切片机。

4.2取出样本。

冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。

因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。

冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。

将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。

2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。

3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。

4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。

将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。

-20°保存备用。

注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。

液氮适用于组织化学，较安全。

缺点：组织块易发生龟裂。

2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。

但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。

故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。

3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。

这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。

冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。

它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。

在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。

同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。

1.取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。

2.速冻：为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。

液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。

具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。

若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。

3．固定：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min 让OCT胶浸透组织。

取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。

组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。

4.切片：恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。

切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。

切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。

PBS洗5min×3。

进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。

可用3%H2O2孵育5~10min，消除内源性过氧化物酶的活性。

冰冻切片制作方法与注意事项冰冻切片是一种常见的制备生物组织切片的方法，其原理是将生物组织迅速冷冻并切割成极薄的切片，用于研究组织的形态结构和组织学变化。

下面是冰冻切片的制作方法和注意事项。

一、冰冻切片的制作方法：1.组织采集：选择需要研究的组织，如动物器官或植物部位，通常用组织固定剂进行固定处理，以保持组织的形态结构。

2.组织预处理：将固定的组织转移到含有蔗糖或蔗糖与聚乙二醇的冰冻液中，浸泡一定的时间使组织与冷冻液充分均匀接触，便于组织快速冷冻。

3.冰冻：使用液氮或刀片冷冻架等快速冷冻设备，将组织迅速冷冻至-20℃以下，使组织中的水分迅速形成冰晶，避免组织的形态结构变化。

4.切割：将冷冻的组织置于切片机或切片微波机上，用冷冻刀片将组织切割成薄片，通常厚度为10-30μm。

5.将切割好的切片用刷子或微型镊子移至载玻片上，通常用蛋白质固定剂或聚甲醛进行固定处理，以保持切片的形态结构。

6.干燥：将固定好的切片置于干燥器中，用适当的温度和时间干燥切片，使其充分固定在玻片上。

7.染色：根据需要可对切片进行染色处理，常见的染色方法有HE染色、银染色、免疫组化染色等。

二、冰冻切片的注意事项：1.快速冷冻：为了保持组织的形态结构和避免变形，必须采用快速冷冻的方法，将组织迅速冷冻至-20℃以下。

液氮和刀片冷冻架是常用的设备。

2.切片设备：选择适合的切片设备，如切片机或切片微波机。

刀片的选择也十分重要，常见的冰冻刀片有钢刀、玻璃刀和蜡刀，选择合适的刀片可以提高切片质量。

3.切片厚度：切割时要控制好切片的厚度，通常为10-30μm。

切片太薄容易导致组织切面不完整，切片太厚则不能得到清晰的显微镜图像。

4.切片技巧：切片技巧也很重要，需要稳定的手部技巧和耐心。

在切割时要保持刀片的稳定，避免划伤或碎裂组织。

5.切片保存：切好的切片需要妥善保存，可以用普通干燥器或冷冻干燥器进行干燥，避免切片变形和水分损失。

6.染色方法：根据需要选择合适的染色方法。

冰冻切片步骤很全面1.标本采集：标本采集是制备冰冻切片的第一步，要确保标本的新鲜度和完整性。

采集时需注意使用无菌器械，避免受到外界污染。

对于细胞切片，可采用细胞培养技术培养的细胞；对于组织切片，采集适量的组织，尽量保持其原有结构。

2.固定：在采集后，为了防止细胞或组织的结构和形态发生变化，需要进行固定处理。

常用的固定方法有：a.4%的硫酸镁：使用4%的硫酸镁固定剂，固定15-30分钟。

b.4%的甲醛：使用4%的甲醛固定剂，固定15-30分钟。

c.10%的缓冲福尔莫林：使用10%的缓冲福尔莫林固定剂，固定4-24小时。

3.包埋：包埋是将固定的细胞或组织进行预处理，以便后续的冷冻切片。

常用的包埋方法有：a.脱水：使用不同浓度的乙醇进行脱水处理，通常有70%、80%、95%和100%四个浓度。

b.渗透剂：使用溶解在脱水剂中的渗透剂，如氯仿、苯酚、醋酸酯等，以提供组织切片的硬度和稳定性。

c.包埋剂：将脱水后的组织切片放入包埋剂中，如石蜡、冻脂等；对于细胞切片，可直接在载玻片上进行包埋。

4.冰冻：冰冻是制备冰冻切片必不可少的步骤，它能够保持细胞或组织的原有形态和结构。

常用的冰冻方法有：a.冷冻板法：将包埋好的标本放置在预冷冻的金属冷冻板上，然后放入液氮中进行快速冷冻。

b.冷冻微才法：将包埋好的标本进行逐步冷冻，在每一步冷冻前都将标本表面的水分吹干。

c.冷冻机法：使用专用的冷冻机进行冷冻，通常温度在-20至-30°C。

5.切片：切片是冰冻切片的核心步骤，需要使用显微切片机或冰冻切片机进行操作。

切片前需将冷冻的标本块取出，等待恢复到适宜切片的温度（一般为-20至-30°C）。

然后，使用坚硬的切片刀或切片刀片切取薄片，通常厚度为5-20微米。

切片时需注意保持刀片的锋利度和角度，以保证切片的质量。

总结：冰冻切片是一种常用的生物学实验和临床诊断技术，它通过对细胞和组织进行固定、包埋、冰冻和切片等步骤，帮助研究人员观察和分析样本的结构。

划重点！冰冻切片流程和注意事项都在这了！快快get起来~冰冻切片定义冰冻切片是指新鲜组织不经过任何固定、脱水、透明等处理，不需要石蜡包埋，直接在冰冻切片机上进行切片的一种方法。

冰冻切片特点：操作简单，耗时短，对组织抗原损伤小，对环境污染小。

冰冻切片流程（10-15min内即可完成）：取材→包埋（<30s）→冷冻（1-3min）→切片（2-5min）→固定（10-15s）→染色（4-5min）→封片（<1min）1、取材（1）新鲜组织取材不能遇水，如果组织自身带水较多，可用滤纸吸干（目的是为了防止冰晶空洞等现象在切片过程中产生）；（2）取材的工具也要保持干燥，取材时所取的范围应尽量避开出血坏死区域及脂肪区域；（3）取材组织大小要合适，厚度尽量在3mm，最多不要超过5mm（组织过大切片时阻力加大，易产生刀痕和褶皱）。

2、包埋（1）包埋机一般使用OTC或普通胶水，OTC包埋剂质感细腻，对刀片损伤小，有利于切片；（2）包埋时要将包埋剂涂抹均匀，确定好组织的包埋方向，例如管腔、皮肤、囊壁等要竖立包埋；（3）包埋体积较小的组织，可以先挤压少许的包埋剂形成一个平台，再放入小组织进行包埋。

3、冰冻温度与时间（1）冰冻温度与时间是冰冻切片的关键步骤，要根据组织的类型和大小来调节；（2）冰冻温度过低，会造成组织过硬，切片碎裂；温度过高会造成组织硬度不够，难以切片；（3）不同组织冰冻切片适宜温度：4、切片（1）在组织和包埋剂冷冻到发白后即可开始切片；（2）切片时右手摇动手轮要力道均匀、柔和、缓慢，切片厚度控制在5um左右，左手持毛笔在切片形成时轻按住组织边缘，使其不发生卷曲；（3）将切片展平粘贴在干净的载玻片上，应立即放入固定液中固定，如果固定不及时，会发生细胞退变，切片中细胞核模糊不清呈雾状。

5、染色流程：固定（95%乙醇）→苏木素→水洗→盐酸乙醇分化（0.5~1%）→水洗→温水返蓝→伊红→梯度酒精→二甲苯透明→封片6、注意事项（1）纤维及结缔丰富的组织，应顺着纤维纹理切片，否则容易崩裂；（2）较硬较脆的组织应尽量切的薄一些；（3）选择合适的固定液（95%乙醇、甲醛、甲醇、丙酮），且固定液要保持新鲜，及时更换固定液；（4）组织尽量快速冷冻，组织间隙的自由水易冷冻凝结形成冰晶，组织冷冻越缓慢，冰晶形成的数量越多，体积越大。

细胞RNA FISH1.24孔板接种细胞爬片（根据实验需求，确定RNA FISH的时间）；2.预冷PBS清洗1-2次后，用4% RNase-free PFA常温固定15分钟；3.PBS洗3×5min，0.2-0.5% Triton X-100室温通透5min；4.PBS洗3×5min，80%-90%-100%酒精梯度各2-3min；5. 50% formamide（混合后）和2×SSC（按1:1体积混合？是混合前甲酰胺是50%，混合后应该是25%？还是混合前是100%，混合后成了50%?是否可以写成“将甲酰胺和2×SSC按1:1体积混合”可以这样写）中室温下10 mins；6. PBS 洗3×5min，每孔加入25ul杂交液，50℃杂交炉中保持4-8h；7.每孔加入60 μl含有探针的变性杂交液（按每片加入30-60ng地高辛标记的lncRNA反义链探针），50℃杂交炉中过夜。

8.使用0.1×SSC+0.1% SDS +50% formamide（配10ml—5ml formamide+0.01g SDS+5ml 0.1×SSC，此处的甲酰胺是100%的？--是的，甲酰胺是100%。

加入后成了50%?）在50℃下洗2×30min；50℃下再使用0.2×SSC+50% formamide（按5ml formamide+5ml 0.2×SSC配制）洗30 mins；9. 每孔加90μl 20%绵羊血清（50μl绵羊血清+200μl B1溶液），室温下1h；10.每片加入60μl(按0.1μl抗地高辛抗体+250μl 10%绵羊血清配制）混合液，4℃过夜。

11.PBS 洗3×5min后，每片加入10μl 200μg/ml DAPI，室温下10min；12.PBS 洗3×5min，加入10ul抗猝灭剂，反盖在载玻片上并用rubber cement封片，镜检观察并拍照。

冷冻切片法流程冷冻切片法可是个很有趣的实验方法呢！让我来给你讲讲它的流程吧。

一、准备工作。

咱得先把要用的东西都准备好。

像冷冻切片机得提前检查好，确保它能正常工作。

还有载玻片、盖玻片，这些小物件可不能少。

冷冻剂也得备足了，这就像是给咱们的切片准备的“小冰箱”呢。

另外，取材工具也很重要，像手术刀之类的，要锋利又干净。

标本也是关键，要选取合适的组织，这个组织得具有代表性，就像选演员一样，得挑个能把整个故事讲清楚的“主角”组织。

二、取材。

这一步可不能马虎。

要快速地把组织取出来，为啥要快呢？因为时间一长，组织可能就会发生变化啦。

就像新鲜的水果放久了会烂一样，组织放久了结构可能就不那么准确了。

取出来的组织大小也要合适，不能太大也不能太小。

太大了放不进切片机，太小了又可能切不到想要的结构，就像穿衣服一样，得不大不小刚刚好。

而且在取材的时候，要尽量减少对组织的损伤，这组织可是很“娇弱”的呢。

三、冷冻。

把取好的组织放到冷冻切片机里面冷冻。

这个过程就像是把食物放进冰箱速冻一样。

冷冻的温度得调好，不能太冷也不能不够冷。

太冷了可能会让组织变得太硬，容易碎掉，就像冰块掉地上容易裂一样。

不够冷呢，组织又切不好，软趴趴的怎么能切出漂亮的切片呢。

在冷冻的时候还要注意观察组织的状态，就像看着锅里的菜有没有熟一样。

四、切片。

等组织冷冻好了就可以切片啦。

切片的时候手要稳，就像绣花一样。

切片的厚度也很有讲究，太厚了看不清楚细胞结构，太薄了又容易切坏。

这就需要不断地练习，找到那种恰到好处的感觉。

而且切出来的切片要完整，不能缺边少角的，不然就像漂亮的拼图少了几块，多可惜呀。

五、贴片。

切好的片子要贴到载玻片上。

这个时候要小心操作，就像把小宝贝轻轻地放在床上一样。

要确保片子贴得平平整整的，不能有褶皱，要是有褶皱就像衣服没熨平一样，看着就不舒服，而且还会影响观察呢。

六、染色。

贴片完成后就可以染色啦。

染色剂就像给组织穿上不同颜色的衣服，这样我们就能更清楚地看到不同的结构啦。

冰冻切片法详细步骤冰冻切片法是组织化学，特别是酶组织化学最常用的切片技术，固定或未固定的组织样品均可进行冰冻切片，新鲜组织冰冻切片对组织细胞内酶类保存最佳，尤其对热、酸、碱、有机溶剂等耐受能力弱的酶和化学物质更加适用。

冰冻切片也是免疫细胞化学研究中常用的切片方法，能够较完好地保存多种抗原，尤其是表面抗原的抗原性。

在冰冻切片中，组织中水分易形成冰晶，往往影响酶和抗原的定位。

一般认为冰晶少而大时，影响较小；冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织脏器如脑、心肌、骨骼肌中上述现象更易发生。

冰晶形成的主要原因是冷冻速度缓慢，温度偏高，细胞内冷冻不均匀所致，常采取以下措施以减少冰晶的形成。

1. 骤冷通常采用骤冷、速冻(1~10°C/s 的冷冻速度）的方法可减少冰晶形成。

(1) 干冰－丙酮（乙醇）法。

将150~200 ml 丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70°C ，用一小烧杯(50~100 ml) 装上异戊烧约50 ml, 再将烧杯缓慢置入干冰－丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烧温度达-70°C 时即可使用。

将组织块（大小为1 cmX0. 8 cmX0. 5 cm) 投入异戊烧内速冻30~60s 后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80°C低温冰箱内贮存。

(2) 液氮法。

将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2 cm) ，如组织块小可适抵加 OCT 包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保待原位切勿浸入液氮中， 10~20 s 组织即迅速冰结成块。

取出组织冰块立即置入-80°C 冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。

2. 冷冻保护加入冷冻保护物质以防止冻害，并在冷冻情况下保持细胞和组织的活性。

防止冻害的物质有甘油、二甲亚砜(DMSO) 、蔗糖、甘露糖、聚乙烯吡咯烧酮(PVP) 等。

细胞爬片RNA FISH具体说明及步骤一、检测原理RNA荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization），简称为RNA FISH，是一种重要的非放射性原位杂交技术。

传统的RNA FISH，直接在oligos上标记荧光素，根据碱基互补配对原则，与待检测的RNA特异结合，通过荧光显微镜以检测荧光信号，该方法一般需要20个oligos以上，以便检测到较强较多的荧光信号点。

本系统中SA（链霉亲和素蛋白）是一类四聚体蛋白，大小为66KDa，每一分子SA能够与四分子生物素进行高度特异性的结合，且两者之间的亲和力较强。

应用该原理，我们将染料Cy3偶联到SA蛋白上，一分子SA能偶联上6个Cy3；同时在探针上标记生物素，将两者在体外进行亲和连接，大约每个SA能与4条oligo-Biotin结合，每个SA上有6个Cy3，也就是每一条探针上连接了6个Cy3，因此该方法具有一定的放大信号的作用二、实验方法贴壁细胞（以48孔板为例）1.按照1×104细胞/孔的密度将贴壁细胞接种于48孔板（孔内提前放入已处理好的且大小合适的盖玻片）中（建议事先铺在Confocal专用培养皿中），于培养箱中培养过夜；2.吸弃培养基，PBS洗两次，每次5min；3.吸弃PBS，每孔加入100μl 4%多聚甲醛，室温固定15min；4.吸弃4%多聚甲醛，每孔加入100μl 0.5% Buffer A（现用现配）室温处理细胞15min（细胞通透）；5.吸弃0.5% Buffer A，PBS洗两次，每次5min；6.每孔加入100μl 1×封闭液，37°C孵育30min；7.吸弃1×封闭液，每孔加入100μl 2×Buffer C，37ºC培养箱放置30min；8.Buffer E提前在73ºC水浴锅孵育30 min，至澄清透亮；探针稀释：可参看标签或报告单上所示参数：nmole/OD260，例如：nmole/OD260= 4.17，则在每OD探针干粉制品中加入41.7μl灭菌DEPC水，混匀后即得浓度约为100μmol/L的储存液，建议进行分装后避光储存于-20°C，避免多次冻融操作；10.配制探针工作液：将探针储存液稀释至1μmol/L，放入75°C水浴锅变性10min，然后与SA-Cy3按比例加入到PBS，（以10μl体系为例，即1μl 1μmol/Lbiotin-probe+1μl1μmol/LSA-Cy3+8μl PBS），37度孵育30min（可做预实验确定探针和SA-Cy3的比例，例如1:1，2:1，4:1，8:1等）；11.将上述10μl探针工作液和90μl Buffer E混匀；12.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl变性后的探针混合液，采取避光措施后置于37ºC培养箱中杂交过夜（12-16h）；13.杂交次日，将样本从37ºC培养箱取出，吸弃探针混合液，每孔加入100μl0.1% Buffer F于37ºC洗涤10min；14.吸弃0.1% Buffer F，每孔加入100μl的2×Buffer C，60ºC洗涤10min，洗涤3次；15.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl 的2×Buffer C，37°C洗涤10min，洗涤3次；（如果背景深时，建议适当提高洗涤温度及次数）16.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl稀释后的DAPI工作液，避光染色10 -20min；17.吸弃DAPI工作液，PBS洗涤2次，每次5min；18.滴加甘油或抗淬灭剂，盖上盖玻片，封片胶封片于荧光显微镜下观察。

冰冻切片的步骤要求和作用环境要求：冰冻切片是一种常用的实验技术，在生物学研究、组织学以及免疫组织化学等领域中广泛应用。

它的作用是在保持组织的形态和结构的同时，为后续的研究提供高质量的样品。

下面是冰冻切片的步骤要求和作用的详细介绍。

步骤要求：1.样本选择：选择适合冰冻切片的样本，例如组织的大小适中且不易破裂的组织。

2.固定样本：使用适当的固定剂对样本进行固定，以保持组织的形态和结构。

3.处理样本：用缓冲液对样本进行洗涤处理，去除细胞液和外源性污染物。

4.冻结样本：将样本在低温条件下冻结，最常用的方法是使用液氮或酒精浴。

5.切片样本：使用切片机将冻结的样本切成薄片，通常为10-50微米的厚度。

6.挂片或贴片：将切片移至载玻片或切片笼中，并在玻片上做相应的标记。

作用：1.保持组织形态和结构：冰冻切片可以保持组织的天然形态和结构，避免固定和染色等过程对组织产生的变性和变形。

2.提供高质量的样品：因冰冻切片的快速切割过程，可以获得高质量、无伤害的组织样品，适合各种形态和形状的组织切片。

3.便于固定和染色：冰冻切片可以便于进一步固定和染色处理，以进行组织学、免疫组织化学等研究。

4.保存组织信息：冰冻切片可以有效保存组织的蛋白质、核酸和其他生物大分子的信息，保留了研究的全面性和综合性。

5.实时观察组织结构：冰冻切片可以随时进行观察和实时分析，不需要特殊的染色处理，有利于实验结果的快速获取。

总结：冰冻切片是一种常用且重要的实验技术，在生物学研究中发挥着重要的作用。

它的步骤要求和作用都与保持组织形态和结构、提供高质量样品、便于进一步处理和观察等方面密切相关。

通过冰冻切片技术，我们可以更好地理解和研究生物体内部的结构和功能，为生物学研究的进展提供有力支持。

冷冻切片方法及注意事项冷冻切片是一种常用的组织学研究方法，它能够帮助研究人员观察和分析生物组织的结构和功能。

下面将详细介绍冷冻切片的方法及注意事项。

1.组织采集：首先需要选择适当的生物组织样本，可通过手术切取、尸检或动物献体等方式获得。

2.组织处理：取出组织样本后，应立即进行处理，以防止样本脱水和坏死。

可将组织放入理化盐水或生理盐水中，避免干燥、坍塌或变形。

3.固定组织：使用适当的固定剂对组织进行固定，以保持组织结构的完整性。

常用的固定剂有福尔马林、戊二醛、乙醛等。

固定时间应根据组织大小和厚度进行调节，较小的组织可以固定2-4小时，而较大的组织可能需要24小时以上。

4.预冷冻：固定后的组织应在冷冻前进行预冷冻处理，以提高冷冻切片的质量。

预冷冻的方法包括放入冷冻剂中（如液氮、干冰等）或将其放入冰盒中进行冷藏，使组织完全冷却。

5.冷冻切片：使用冷冻切片机将预冷冻的组织切成薄片。

为了获得更好的切片结果，刀片的角度和厚度需要进行适当的调整。

同时，切制时需要快速而轻柔地移动切片机，以防止组织被拉伸或损坏。

6.切片收集：将切片收集在玻片上，通常使用细长形的切片夹或切片板来收集切片。

确保切片不受损并保持平整。

7.切片保存：将切片放入适当的保存溶液中，如PBS（磷酸盐缓冲液）或甘油等，以防止切片干燥和变形。

可以根据需要选择冷藏或冷冻保存。

冷冻切片需要注意以下事项：1.样本质量：选择新鲜、完整的组织样本，避免坏死、变性或损伤的组织。

2.固定剂选择：选择适当的固定剂进行组织固定，以保持组织结构的完整性。

3.冷冻速度：组织应尽快冷却，以避免组织脱水或破坏。

冷冻速度过慢可能会导致晶体形成，影响切片质量。

4.切片机状态：保持切片机的良好状态，定期检查刀片的锋利度和调整角度，以确保切片的质量。

5.切片技巧：需要轻柔、均匀地切片，避免组织被拉伸或扭曲。

同时，切片过程中需要快速操作，以减少冰晶对组织的破坏。

6.切片收集：收集切片时要避免切片叠加或悬浮，以免影响切片的观察和分析。

冷冻切片操作指南在医学、生物学和食品科学等领域中，冷冻切片是一种重要的技术，用于将样品冷冻固化后，切割成薄片以供进一步观察和研究。

本文将为读者提供一份冷冻切片操作指南，介绍冷冻切片的基本原理、实验室操作步骤和注意事项。

一、冷冻切片的基本原理冷冻切片是将样品通过快速冷冻技术使其迅速固化，然后使用切片机或显微切片机将固化的样品切割成薄片。

冷冻切片的目的是保留样品的形态和结构，避免切片过程中的伤害和变形。

冷冻切片一般适用于需要保留细胞和组织结构的实验。

二、实验室操作步骤1. 样品准备：将待切割的样品准备好，可以是细胞、组织或食物等。

样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性。

2. 冷冻固化：将样品放置在冷冻剂中，例如液氮或冷冻盒中的冰水混合物中，进行快速冷冻固化。

冷冻时间需要根据不同样品的特性进行优化，一般在几分钟至数小时之间。

3. 选用切片仪器：根据实验需求，选择合适的切片仪器，可以是手动的切片机或半自动/全自动的显微切片机。

4. 切片调整：根据实验需求，调整切片仪器的切割参数，例如切片厚度和速度等。

通常，薄片的厚度在几微米至数十微米之间。

5. 切片过程：将冷冻固化的样品放置在切片仪器的切片台上，固定好，并且调整好切割参数。

使用手动或电动操作切片仪器，将样品切割成所需的薄片。

6. 切片收集：将切割好的薄片收集起来，可以使用切片刷或显微镊子等工具进行操作。

注意保持薄片的完整性和干燥，避免受到污染和损坏。

7. 切片处理：根据实验需求，进行切片的进一步处理，例如染色、免疫组化等。

三、注意事项1. 样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性，避免样品受到损伤和变性。

在样品处理过程中，可以使用缓冲液或甘油等物质进行保护。

2. 冷冻固化的时间和温度需要根据不同样品的特性进行优化。

过长或过短的冷冻时间都可能导致样品质量下降。

3. 在选择切片仪器时，需要根据实验需求和预算等因素进行权衡。

手动切片机相对便宜，但操作较为繁琐；半自动/全自动的显微切片机操作更为方便，但价格较高。

冰冻切片的步骤要求和作用冰冻切片是一种常用于生物学研究的技术，用于制备组织切片以供光学显微镜观察。

冰冻切片的步骤要求和作用如下：一、步骤要求：1.标本固定：首先，需要选择适合的标本进行固定。

常见的标本包括动植物组织、器官、细胞等。

固定常采用的方法有乙醛定型法、福尔马林定型法等，目的是保持组织的形态和结构。

2.干燥：将固定好的标本进行干燥处理，常用的方法有空气干燥、醋酸解脂等。

干燥的目的是使细胞固定在组织中，减小切片过程中的移位和变形。

3.冰冻：将固定好且干燥的标本进行冰冻处理，通常使用低温冷冻机或液氮进行冰冻。

冰冻的目的是使细胞和组织速冻，保持其原有的结构和形态。

4.切片：使用显微切片机或冰冻微浪切片机将冰冻标本切割成薄片。

切片的要求是薄且均匀，通常在10-50微米之间。

5.捕获：用切片夹将切片移入载玻片上，并注入缓冲液或显微镜密封液，以保持切片的湿润和结构稳定。

6.染色：根据需要可以对切片进行染色，常用的染色方法有苏木精-伊红染色、姜黄染色等，目的是突出组织结构和细胞器。

二、作用：1.结构观察：冰冻切片制备的组织切片可以提供高分辨率、立体感强的结构信息，可以观察细胞和组织的形态、结构和排列方式。

2.免疫组化：冰冻切片可以被用于免疫组织化学染色和免疫荧光染色等技术。

这些技术可以用来检测特定的蛋白质和其他分子在组织中的分布和表达程度。

3.分子定位：通过使用特定的探针或荧光标记物，冰冻切片可以用于分子定位实验，可实现对特定分子在组织中的定位和可视化。

4.病理学研究：冰冻切片可以提供病理学诊断的信息。

医学领域常用冰冻切片技术进行快速病理诊断，如冷冻切片法可以在手术中实时检测并确定肿瘤的范围和边界。

5.遗传学研究：冰冻切片被广泛用于研究组织和细胞的遗传变异、突变和表达差异等。

如原位杂交和原位PCR技术可以用于检测特定基因在组织中的分布和表达。

6.药物筛选：冰冻切片可以用于药物的筛选和效果评估。

通过给予切片不同的药物处理，可以观察药物在组织中的作用和效果。

冷冻切片操作指南
随着科学技术的进步，冷冻切片技术被广泛应用于多个领域，包括生物学、医学和材料科学等。

冷冻切片技术可以帮助研究人员了解物质的微观结构和特性，为相关研究提供有力的支撑。

本文将为您介绍冷冻切片的操作指南。

一、准备工作
1. 准备好所需材料
在进行冷冻切片之前，您需要准备好以下材料：
- 组织样本：可以是动物组织、植物组织或其他材料。

- 冷冻切片仪：根据需要选择适当型号的冷冻切片仪。

- 切片刀：保持切片刀的锋利度，以确保切片质量。

- 冷冻剂：例如液氮或乙醇。

- 切片架：用于放置切片。

2. 样本固定和冷冻
首先，您需要对样本进行固定和冷冻。

固定样本的方法根据研
究目的的不同而有所差异。

对于生物组织，常用的固定剂包括甲醛、乙酸乙酯等。

接下来，将固定的样本放入冷冻剂中进行冷冻。

确保
样本充分冷冻，以提高切片质量。

二、冷冻切片操作步骤
1. 准备切片仪
根据切片仪的使用说明准备切片仪，确保各项设置都正确。

如
有需要，调整刀片的角度和速度，以获得最佳的切片效果。

2. 切片样本
将冷冻的样本置于切片仪的切片架上，并将切片架放入切片仪中。

调整刀片的位置，使其与样本接触。

启动切片仪，开始切片操作。

切片时应保持手部稳定，以避免切片变形或切片质量下降。

3. 收集切片
使用显微镜观察切片，将切片以适当的方式收集起来。

可以使
用刷子、针头或切片网格等工具收集切片。

注意切片的顺序和位置，以便后续的实验操作和图像分析。

冰冻切片的步骤要求和作用冰冻切片是一种常见的组织切割技术，它使用低温冷冻样品，然后使用切片机将样品切成非常薄的切片。

冰冻切片技术是生物学研究和医学诊断中不可或缺的重要工具。

它可用于观察许多样品的内部结构，如细胞、组织和器官等，进一步了解它们的功能和形态。

下面将详细介绍冰冻切片的步骤要求及其作用：1.样品固定：在进行冰冻切片前，样品需要进行固定以保持其形态、结构和细胞凝胶状态。

常见的固定方法包括乙醛固定和冷凝固定。

选择适当的固定方法取决于待测样品的特性和研究目的。

2.固定样品冷冻：在进行冰冻切片前，固定的样品需要在低温下冷冻。

冷冻操作的关键是控制冷冻速度和温度，以防止样品在冷冻过程中发生损伤。

常见的冷冻方法包括液氮冷冻和冷冻板冷冻。

液氮冷冻可以实现更快的冷冻速度，而冷冻板冷冻则可以更好地控制冷冻温度和速度。

3.制备切片：冷冻后的样品需要进行切片。

切片机通常用于切割样品。

在切片机工作之前，需要将切片刀冷却到适当的温度，以防止冻结的样品在切割过程中解冻。

然后，将冷冻样品放在切片机上，并调整合适的切片参数，包括切片厚度和速度等。

4.收集切片：完成切割后，收集切片并放置在适当的载玻片或载片上。

注意不要损坏或弄丢切片，同时避免切片之间的交叉污染。

将切片放置在载片上后，可以进行染色、免疫染色或其他实验处理。

5.形态学检查：切片制备完成后，可以使用显微镜对切片进行形态学检查。

通过观察切片，研究者可以进一步了解样品的内部结构，如细胞、组织或器官的形态、形状、大小、有丝分裂状态、细胞排列、器官的血供和微观解剖结构等。

6.免疫组化处理：冰冻切片的一个重要应用是免疫组化染色。

可以使用适当的抗体来标记感兴趣的分子，从而确定其在样品中的存在和定位。

这种技术可以帮助研究者确定一些蛋白质的表达情况、定位和数量，并进一步揭示其在生物学过程中的功能。

7.其他实验处理：除了免疫组化处理外，冰冻切片还可以在其它实验中应用。

例如，可以在切片上进行蛋白质或核酸的杂交实验，研究蛋白质表达的变化或基因表达的调控。