第二章微生物的纯培养和显微技术

第二章微生物的纯培养和显微技术第二章微生物的纯培养和显微技术第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术。

1、微生物培养的常用器具及其灭菌（1）试管、玻璃烧瓶、培养皿。

（2）高压蒸汽灭菌，杀灭所有的微生物，包括休眠体，同时可保持培养基的营养成分不被破坏。

（3）高温干热灭菌。

2、接种操作无菌条件下，用接种环在火焰附近进行操作，或在无菌操作箱或操作室内进行。

二、用固体培养基获得纯培养1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。

菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。

2、涂布平板法3、稀释倒平板法4、平板划线法5、稀释摇管法对氧气更加敏感的厌氧型微生物。

先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化后冷却，将微生物进行梯度稀释，冷凝后，在琼脂表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基隔开。

三、用液体培养基获得纯培养对一些个体大的细菌、许多原生动物、藻类。

稀释法。

接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。

经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。

只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。

四、单细胞（孢子）分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。

较大的微生物较容易，个体较小的较难。

对较大微生物，用毛细管提取个体，在低倍显微镜下操作；对较小微生物，采用显微操作仪。

五、选择培养根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，培养一段时间后，通过平板稀释等方法进行纯培养分离。

1、选择平板培养2、富集培养制定特定的环境，使仅适应于该条件的微生物生长。

第二章：微生物的纯培养与显微技术1、微生物学基础实验技术—分离、培养与显微技术对建立微生物学的意义；微生物由于个体微小，绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。

由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和保证结果的可重复性，因此，把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。

相应地，微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。

2、如何理解过大、过小的（微）生物其生长速度都较慢？答疑的时候老师也没完全说明白3、常见光学显微镜、电子显微镜的种类以及它们的特点、应用范围？常见光学显微镜有普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜等。

●普通光学显微镜：利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，放大倍数最高只能达到1000~1500倍。

最小可分辨距离（，，分别表示光源波长、介质折射率、物镜镜口角的半数）。

观察经染色的细胞。

●暗视野显微镜：利用聚光器实现斜射照明，光线由样品反射或折射后进入物镜，因此视野是暗的而样品是亮的，样品与背景反差增大。

主要用于观察生活细菌的运动性，看不见内部细微结构。

●相差显微镜：细胞各部分的折射率及厚度差异→光程差→相位差→环状光阑和相差板→振幅差（明暗差）。

用于观察在普通光学显微镜下不易看到的活细胞和细胞内的细微结构。

N。

●荧光显微镜：紫外线照射下，发荧光的物体在黑暗背景下表现为光亮的有色物体。

可观察特异的细胞，应用于免疫学、环境微生物学、分子生物学。

常见电子显微镜有透射电子显微镜、扫描电子显微镜等。

●透射电子显微镜：以波长比可见光短得多的电磁波取代可见光来成像，可提高分辨能力。

电镜镜筒中为高真空，采用电磁圈来汇聚光线，用荧光屏来观察或用胶片记录影像。

N。

●扫描电子显微镜：电子束被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出二次电子。

第二章微生物的纯培养和显微镜技术2．纯培养和显微技术一、纯培养技术1、无菌技术包括两方面的内容：（1）用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；(2)在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身也不污染环境；2、分离纯化技术（1）固体培养基分离纯培养技术微生物个体微小，常以群体混合状态存在，将单个细胞从群体中分离出来，即纯培养。

菌落：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。

菌苔：众多菌落连成一片。

获得纯培养的方法有：倾注平板法：操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！涂布平板法：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！平板划线法：厌氧微生物的分离：（2）液体培养基分离纯培养稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。

（3）选择培养分离：抑制大多数其它微生物的生长；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。

使待分离的微生物生长“突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。

3、单细胞分离技术用显微操作仪，在显微镜下进行。

难度与细胞或个体的大小成反比，局限于高度专业化的科学研究中。

4、选择培养分离选择平板：抑制大多数微生物不能生长，或具区别特征的直观结果。

富集培养：造成有利于某种菌生长的环境。

（1）利用选择平板进行直接分离高温培养分离嗜热菌，培养基中不含有N，分离固氮菌；培养基中含有抗生素分离抗生菌。

牛奶培养基分离产蛋白酶菌株。

（2）富集培养利用不同微生物之间的生长特性不同，制定特定的环境条件，使仅适合条件的微生物旺盛生长，从而使其在为生物群落中的比率大大增大，易于从群落中间将墓地君主分离出来。

5、二元培养物培养物中只含有二种微生物，而且有意识地保持二者之间的特定关系的培养物。

如病毒与宿主；蛭弧菌与和E.coli.6、微生物的保藏技术影响微生物菌种稳定性的因素：a. 变异；b. 污染；c. 死亡基本要求：在一定时间内使菌株不死，、不变、不乱基本方法生活态：培养基传代培养（斜面、平板、半固体），多见于冰箱4℃培养。