培养基概述及细胞培养

肝癌细胞培养

一、 培养基

1、 RPMI-1640+ 10%胎牛血清培养基

2、 DMEM+ 15%胎牛血清培养基

成分表

二、 实验前准备工作:

操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。

1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：

（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。

（2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。

（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。

（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。

（5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。

2、橡胶制品清洗消毒：

0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用

3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）：

使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。

培养基概述及细胞培养

体外培养包括：组织培养、细胞培养、器官培养。顾名思义，就是将活体结构成分从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的方法。广义组织培养与体外培养同义。

体外培养已经历了约一百年的发展历史，但发展初期进程比较缓慢，没有引起很多学者的重视。直到上世纪50年代后期，体外培养技术才广泛应用于生物学研究的各个领域，使这项技术得到飞速发展。现在体外培养已成为细胞工程、基因工程、抗体工程的重要组成部分。

细胞培养指从生物机体取出部分组织分散成单个细胞或直接从机体取出单个细胞，也可把体外培养细胞分散成单个细胞在体外条件下培养，细胞能继续存活与增殖。培养过程中细胞不再形成组织。

细胞培养目的与用途

科学研究

(1)药物研究开发，如新药筛选，疫苗、基因工程药物、细胞工程药物

研究与开发、单克隆抗体制备等。

(2)基础研究，如药物作用机理、基因功能、疾病发生机理等研究。

生物制药

(1)疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)，多肽疫苗(肿瘤疫苗)等。

(2)基因工程药物生产：如EPO等。

(3)抗体药物、基因治疗药物生产。

(4)细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等。

(5)利用细胞法体外测定生物活性物质的活性;并预测其在体内的药效和替代体内法检测其成品的生物活性。

细胞培养基

人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质,它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。

1.天然培养基

来自动物体液或利用组织分离提取的一些培养基，如动物血浆、胚胎浸出液、血清和人血清，水解乳蛋白等。

2.合成培养基

人工设计、配制的培养基。

动物细胞培养技术

动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一，并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。蛋白治疗药物如糖蛋白、抗体和多肽药物仅仅只是刚刚开始进入市场，预计在下一个10年或20年会有更为快速的发展。蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求将远远超过全世界的生产能力。

同细胞系适用的培养基

细胞系 细胞类型 种 组织 培养基

293 成纤维细胞 人 胚胎肾 MEM, 10% 热灭活马血清

IMR-90 成纤维细胞 人 肺 MEM, 10% 胎牛血清和 NEAA

W1-38 成纤维细胞 人 胚胎肺,3月妊娠 MEM, 10% 胎牛血清

A549 上皮细胞 人 肺癌 F-12K, 10%胎牛血清

A431 上皮型 人 表皮细胞癌 DMEM, 10% 胎牛血清

BHL-100 上皮细胞 人 乳房 McCoy'5A, 10% 胎牛血清

BeWo 上皮滋养层 人 绒毛癌 F-12K, 15%胎牛血清

Caco-2 上皮细胞 人 结肠腺癌 MEM, 10% 胎牛血清和 NEAA

Chang 上皮细胞 人 肝脏 BME, 10% 小牛血清

HCT-15 上皮细胞 人 结肠直肠腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清

HeLa 上皮细胞 人 子宫颈癌 MEM, 10% 胎牛血清和 NEAA(in suspension,

S-MEM)

HEp-G2 上皮细胞 人 肝细胞癌 MEM, 10% 胎牛血清和 NEAA

HEp-2 上皮细胞 人 喉癌 MEM, 10% 胎牛血清;或RPMI-1640, 10% 胎牛血清

HT-1080 上皮细胞 人 纤维肉瘤 MEM, 10% HI 胎牛血清和 NEAA

HT-29 上皮细胞 人 结肠腺癌 McCoy'5A, 10% 胎牛血清

精心整理

DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识

培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。

一、基础培养基

绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`sMEM的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`sF12也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。

在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。

原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`sL15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。