高中生物新课标人教版课件PCR技术

Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数。
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特别说明： 1、荧光探针和荧光染料：
分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高， 后者操作简单。
TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’
端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能 量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。
GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 物二聚体。 5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 6、primer 5.0 7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl）
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PCR类型：
普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR
循 环
56℃ 72℃
退火 延伸
目的：引物先与模板匹配 1-2 min 目的：聚合酶在引物3’端加
核苷酸，合成新链
12℃ 保存
特异性强、灵敏度高、快速、简便
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循环次数 1 2 3 20 30
DNA数量 2 4 8
1048576 1073741824
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特殊说明：
1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性， 不
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原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如
Taqman探 针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，
再 通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。

模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性

（多选）科学家将含人的α一抗胰蛋白酶 基因的DNA片段，注射到羊的受精卵中，该 受精卵发育成的羊能分泌含α一抗胰蛋酶 的奶。这一过程涉及 A．DNA按照碱基互补配对原则自我复制 B．DNA以其一条链为模板合成RNA C．RNA以自身为模板自我复制 D．按照RNA密码子的排列顺序合成蛋白质
ABD
（多选）科学家将控制某药物蛋白合成的 基因转移到白色来亨鸡胚胎细胞的DNA中， 发育后的雌鸡就能产出含该药物蛋白的鸡蛋， 在每一只鸡蛋的蛋清中都含有大量的药物蛋 白，而且用这些鸡蛋孵出的鸡，仍能产出含 该药物蛋白的鸡蛋。据此分析 A．该过程运用了胚胎移植技术 B．这些鸡是转基因工程的产物 C．该种变异属于定向变异 D．这种变异属于可遗传的变异 BCD
单子叶植物中常用的一种基因转化方法 是 A．农杆菌转化法 B．基因枪法 C．花粉管通道法 D．显微注射法
D
（浙江）下列关于基因工程的叙述，错 误的是 A.目的基因和受体细胞均可来自动、 或微生物 B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两 类常用的工具酶 C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达 的胰岛素原无生物活性 D.载体上的抗性基因有利于筛选含重 组DNA的细胞和促进目的基因的表达 D
第39讲 基因工程
第39讲 基因工程
一、DNA重组技术的基本工具 由图可知， DNA重组技
术的工具有 哪些？
抗虫棉
第39讲 基因工程
一、DNA重组技术的基本工具 限制酶
由图你可想 到限制酶的 特点吗？
黏性末端 平末端
第39讲 基因工程
一、DNA重组技术的基本工具 限制酶 DNA连接酶
阅读教材回答： 1、连接酶的种类？ 2、两者的差别？ 3、连接的化学键？
第39讲 基因工程
一、DNA重组技术的基本工具 限制酶 DNA连接酶 运载体

引物二聚体
总结词
引物二聚体是指引物之间形成的二聚体，影响PCR扩增效率。
详细描述
引物二聚体的形成可能由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度过低等原因 导致。为解决这一问题，可以优化引物设计，降低引物浓度，适当提高退火温度 等措施。
05
PCR 实验设计
选择合适的引物
引物长度
根据基因序列选择合适的引物长度， 通常为18-30bp。
设置PCR 仪温度循环
设置变性温度
将PCR仪温度设置为95℃，进 行变性处理，使DNA双链解开
成单链。
设置退火温度
根据引物特异性，设置适当的 退火温度，使引物与单链DNA 结合。
设置延伸温度
设置适当的延伸温度，使DNA 聚合酶从引物起始合成DNA链 。
设置循环数
根据实验目的和DNA片段大小 ，设置适当的循环数，确保目
PCR PPT课件教程
目录
• PCR 简介 • PCR 原理 • PCR 实验步骤 • PCR 常见问题与解决方案 • PCR 实验设计 • PCR 数据分析
01
PCR 简介
PCR 定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA的分子生物学技术，通过DNA聚合酶的作用，以一对寡核苷酸引 物定向导引下完成特定DNA的片段扩增。
在PCR中，DNA的复制是通过特定的引物和聚合酶，在特定的温度和循环次数下完 成的。
引物与模板DNA结合后，聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链。
聚合酶与引物
聚合酶是生物体内负责DNA复 制的酶，具有耐高温的特性。
在PCR中，常用的聚合酶有Taq 酶和Tfl酶等。
引物是人工合成的短片段DNA ，能够与目标DNA特异性结合 ，为聚合酶提供起始点。

通量PCR检测。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基 因组测序、单核苷酸多态 性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病 、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分 析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如 血液、组织等，以便后续 实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增 效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓 度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理 的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等 试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设 定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或 荧光定量PCR等检测方法，确定目标 基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使 用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常 运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。

凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下 被检测出来。
DNA分子电泳
琼脂糖凝 胶电泳
二、材料用具
（一）仪器：
PCR仪
自动控温， 实现DNA 的扩增
微量离心管
实际上是进 行PCR反应 的场所
微量移液器
用于向微量离 心管转移PCR 配方中的液体
电泳装置
包括电泳仪、 电泳槽等
二、材料用具
PCR 的产物一般通 过琼脂糖凝胶电泳
来鉴定。
PCR仪
一、实验原理 （二）DNA片段电泳鉴定原理：
电泳鉴 定原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带 上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它 所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小 和构象等有关。
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离 心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离 心管的底部（提高反应速率）
扩增
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有 反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性
复性
延伸
预变性 94℃,5min
/
/
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
注意事项
探究.实验 DNA片段的扩增及电泳鉴定
为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头 和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。

D.两种限制酶在载体上识别的序列可能相同
跟踪训练
根据图示可知，200 bp的DNA分子量小， 800 bp的DNA分子量较大，200 bp的 DNA移动速度快，所以在电泳时，核酸 的移动方向是从负极到正极的，A错误； 当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生 一种长度的DNA片段，因此该载体最有 可能为环状DNA分子，B正确；
蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理 D.电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶，以免凝胶加样孔中的电泳样液流
PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程 中起作用，B错误； 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪 头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高 压灭菌，C错误； 电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜，D错误。
跟踪训练
例7. 为优 化目 的 基因(700 bp)的 PCR条件，研究者设计不同的复 性温度进行实验，产物的琼脂糖 凝胶电泳结果如图。据图分析， 下列有关说法错误的是 A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同
√B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关
C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度
跟踪训练
例6.下列有关电泳的叙述，不正确的是 A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电
泳中的迁移速率
√C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电 极移动，C错误。
例2 用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电 泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入 的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是

缓冲溶液：维持反应的pH值不变
课题2
多聚酶链式反应（PCR) 扩增DNA片段
温故知新1
组成DNA分子的基本单位是什么? 这些基本单位是如何连接成DNA
分子的? DNA分子结构有什么特点？
脱 氧 磷酸
脱氧
核 苷
核糖 脱氧核苷
腺嘌呤（A） 嘌呤
酸
含氮
鸟嘌呤（G）
碱基 嘧啶 胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
5 4
3
1 2
OH HO P O
利用了DNA的热变性原理，通过控 制温度来控制双链的解聚与结合。
PCR反应的条件
DNA母链：提供复制的模板
8解0—旋1酶00：℃ 打开DNA双链
4种脱氧核苷酸：合成子链的原料
耐DN热A聚的合DN酶A聚：合酶 催化合成DNA子链
ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开
始连接脱氧核苷酸
DNA母链：提供复制的模板 解旋酶：打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开
始连接脱氧核苷酸
一、PCR原理：
PCR（多聚酶链式反应）技术
是一种体外迅速扩增DNA片段的技 术，它能以极少量的DNA为模板， 在几小时内复制出上百万份的DNA 拷贝。
碱基
O
O
OH OH
HO P O
O 碱基
O
OH
5’
碱基
脱氧核糖
OH HO P O
O 碱基
磷酸基团 碱基
脱氧核糖
O
磷酸二酯键 O
HO P O
碱基
O
O

dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，一般将其PH调节到7.0～7.5， 小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L， 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏 低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物 的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓 度降低。
PCR反应的特点
②灵敏度高：过去酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射 免疫分析（RIA）其灵敏度分别为ng和pg级，而PCR检 测灵敏度可达fg级，理论上可检出一个细菌或一个真 核细胞的单拷贝基因的存在；
PCR反应的特点
③简便快速：操作试剂盒时只需将样品简单处理和加 样后即可进行扩增，许多PCR检查项目在两小时左右即 可出报告；④对样品要求低：几乎所有的临床标本都 可用于PCR扩增。
PCR条件的选择
引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所 选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。
引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好， 引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引 物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板 的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。
PCR技术的用途
科研使用 临床医学 法医学 农业 考古学 人类学 环境保护
个体识别与亲子鉴定 GMO
PCR应用类型
一、不对称PCR(asymmetric PCR)
不 对 称 PCR 的 目 的 是 扩 增 产 生 特 异 长 度 的 单 链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结 果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物 浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单 链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。

PCR技术的应用
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1、PCR技术在分子生物学中 的应用
.
一：基因克隆
基因的克隆和分离是分子生物学和细胞生 物学研究中必不可少的手段。运用PCR技 术进行基因克隆和亚克隆比传统的方法具有 更大的优点。由于PCR可以对单拷贝的基 因放大上百万倍，产生微克(pg)级的特异 DNA片段，从而可省略从基因组DNA中克 隆某一特定基因片段所需要的DNA的酶切 步骤。
.
二：重组PCR
在分子生物学研究中常常需要将两个不同的 基因融合在一起。通过PCR反应可以比较容 易地实现这一目的。
.
三：DNA序列的测定
目前广泛采用的DNA测序方法有化学法和双脱氧 法两种，它们对模板的需要量比较大。传统的模 板制备方法是将含目的基因的DNA片段进行酶切 ，建立基因库，筛选克，并亚克隆到M13噬菌体 载体上，经噬菌体产生单链DNA。这是一项比较 复杂的工作。利用PCR方法可以比较容易地测定 位于两个引物之间的序列。
●
由于PCR技术具有高特异性、高灵敏度、
操作快速、简便、对样本要求低等特点，加之它
能与多种分子生物学技术配合使用，PCR技术日
益成为遗传病诊断、发病机理的研究等方面最有
效、最可靠的方法之一。PCR技术的出现为快速
、准确地检测人类遗传病开辟了新途径
●
.
5、PCR在骨髓移植HLA-D位点配型中的应用
● HLA—DRp位点配型方法，即PCR指纹图，该技术是的 DNA经PCR扩增HLA—DR卢区基因的高度多态区域，在 分别扩增后将供、受者产物混合，混合后进行2个PCR循 环，扩增产物经12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，照相后分析 不同个体的指纹图型。当HLA-DRfl基因相合时，其基因 产物在聚丙烯酰胺凝胶中可产生一致的带型，这种多条带 型的产生是由于各种HLA单倍体中的HLA-DRfl基因的不 同亚型以及假基因上的多态性所致。当PCR最后两个匹配 循环退火时，这些基因的单链DNA复性，DRfl基因相同 的个体形成同型双链，而不同的DRfl基因之间的不同序列 形成异型双链，因此，混合匹配可进一步证实HLA—DRfl 是否相合。

PCR技术的创建
Kary B. Mullis（穆利斯（美））
• Khorana(1971)等提出在体外 经DNA变性,与适当引物杂交,再 用DNA聚合酶延伸,扩增DNA的 设想。
• 1983年,Mullis发明了PCR 技术,使Khorana的设想得到实 现。
• 1988年Saiki等将耐热DNA 聚合酶（Taq）引入了PCR技 术
• 最后是采用热启动的方法使耐热DNA聚合酶仅在反 应体系到较高的温度是才发挥作用，消除非特异性的 扩增，提高PCR反应的特异性和敏感性。
梯度PCR仪
PCR仪器
PCR荧光分析系统
二PCR 技术在食品微生物检测中的应用
• （1）啤酒腐败菌的鉴定：众所周知，啤酒花中的异a 酸对 大多数革兰氏阳性菌有一定的抑菌作用，但是有一些乳酸 菌，特别是乳杆菌对异a 酸有抗性，可以在含酒花物质的 啤酒中生长，从而造成啤酒的腐败。从抗酒花菌株短乳杆 菌ABBC45 的质粒上鉴定得到抗酒花基因horA。，凡是能 引起啤酒腐败的乳杆菌，均含有似horA基因，这证明了 horA基因与酒花抗性有关。根据horA 的部分基因顺序人 工合成2 段特异性引物，使用TaqDNA 聚合酶，从一系列 乳杆菌中提取DNA溶液，加人含特异性引物的反应混合物 中，进人热循环，最终的反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测。 研究者通过检测微生物中的似horA基因的存在与否来预言 其对啤酒的腐败特性。horAPCR技术对腐败菌的检测大约 需要6h左右，比基于生长现象的传统平板培养方法要快捷 得多，因此受到各国广泛应用。
• 模板：就是需要扩增序列的核苷酸，来源很广，几乎所有 形式的DNA和RNA都能作为PCR反应的模板。
• 引物：是与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的核苷酸片段， 是决定PCR特异性的关键。

在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后

一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增 技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
.
2
DNA扩增的传统方法： 一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基 因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛 选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针 杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂， 需数周到数月的时间，且不利于普及。
.
6
3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物 的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本 中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新 一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
.
28
四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓 度进行核算。
.
29
10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
.
5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):