第四章DNA分子的克隆
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DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术):在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接,转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括:制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接,制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体(vecors)在细胞内自我复制,并带动重组的分子片段共同增殖,从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝,有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆,就可以深入分析基因的结构与功能,随着引入的DNA片段不同,有两种DNA库,一种是基因组文库(genomic library),另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA,分子大小为1-20kb,对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体,其含有感光趣的基因片段的重组子,可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来,所得到的克隆经过纯化和扩增,可用于进一步的研。
其主步骤包括:(1)构建基因库迅速的载体;(2)DNA片段的制备;(3)DNA片段与载体DNA 的连接;(4)包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段,是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库,不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有:(1)克隆筛选即探针筛选法;(2)抗体检测法,检测其分泌蛋白质来筛选目的基因;(3)放射免疫筛选法,查出分泌特异抗原的基因;(4)免疫沉淀法,进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性,DNA序列分析(测序,sequencing)是分子生物学重要的基本技术。