引物设计具体步骤

引物设计是一小段单链DNA或RNA，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延

伸的出发点而起作用的多核苷酸链。

引物设计原理及详细步骤：

1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同

一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列

就是该基因的保守区。

2、引物长度一般在15-30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延

伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，

即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5-10℃。若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4、引物3'端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并

，会影响扩增的特异性与效率。

5、引物3'端不能选择A，最好选择T。

引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在

错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，

G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。

6、碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致

错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的 分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不应超过3个连续的G或C

一、引物设计step by step

1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。

2、用Primer Premier5搜索引物

①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。

②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300～500bp.

③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。

1 qPCR引物设计原则及具体操作步骤 1. 找基因（DNA） 1) 通过英文名称查找 通过查看文献或者百度搜索查找到对应基因的准确的英文名称 →进入NCBI官网 →点击网页右下角GenBank，进入GenBank界面 →在搜索框中输入准确的英文名称，点击Search搜索即可 2) 通过序列号查找 通过查找文献，找到相应基因在GenBank上的登录号，直接输入上面的搜索框进行查找即可。 例如：犬冠状病毒(canine coronavirus，CCV)基因保守片段序列号为KT222978。 3) 通过引物查找 通过查找文献，找到别人用过的对应的引物 →在NCBI官网右下角点击Primer-BLAST →输入正、反向引物序列 →设置对应参数 →点击“Get Primers”进行搜索即可 4) 找到对应的基因后点击“FASTA”，进入相应界面，再点击“Send to”选择相应格式，保存序列。 2 2. qPCR引物和TaqMan探针的设计 1) 引物设计注意事项 a) 引物长度17bp-25bp为佳。太短的引物容易导致扩增效率降低；太长的引物会导致出现引物高级结构的几率增加。两者都会干扰定量结果的准确性 b) 扩增片段长度为：90-150 bp（最低不能超过70，最高不能超过180） c) 引物的Tm值为：最小57℃，最大63℃，最适为60℃，两条引物之间退火温度得差距不超过1℃，推荐使用 Primer Premier 5进行Tm值计算； d) 引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域。 e) 引物设计时请尽量避开TC或者AG的连续结构。 f) 3’端不能超过3个以上碱基互补，自互补碱基数不超过3；3’端最后一个碱基绝对不能搭上 g) 特异性要有保证，与非特异模板3’端互搭碱基数不超过3，不连续出现4个及以上的GC互搭 h) 引物3’端最后五个碱基不能包含超过2个以上的G或者C i) 引物的GC含量控制在40%-60%之间为好，最佳为45%-55%之间 j) 正向或者反向引物应尽量接近探针序列但是不能和探针序列有重合区域 k) 在Primer-BLAST设计时，在Organism 处选择相应物种 l) 需跨外显子设计，避免基因组污染 2) TaqMan探针设计指南 a) 探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域；一般相隔1~5个碱基（一般10个以内，最好是1个碱基）。 b) 应避免连续相同的碱基出现，特别是要避免GGGG或者更多的连续G出现。 c) 探针5’端应避免使用碱基G，因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用 d) 3’端应避免使用碱基A 3 e) 如果序列中包含多态性位点，应使其位于探针序列中间。 f) 保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A因为A、T为双键，而G、A为三键。 g) 探针长度：Taqman探针的长度最好在25-32bp之间（一般为18-40bp），且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃（至少要5℃），这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。GC含量在40%-70%。 3) 利用软件Primer Premier 5进行设计 打开软件，点击File→New→DNA Sequence→复制粘贴基因序列→点击Primer →点击Search→设置对应参数（可调整）→点击OK 4 →查看系统推荐的正、反向引物，在此基础上可点击“Edit Primers”进行自主调整（增删碱基，移动位置等），直至筛选出最优的正、反向引物。 4) 利用NCBI官网的Primer-BLAST进行设计 在Primer-BLAST网页左上边框粘贴基因序列，设置相应参数，点击网页左下角的“Get 5 Primers”进行搜索即可。（方便直接看到引物可能扩增的其他物种序列） 3. 质量鉴定 1) 利用软件PrimerSelect对引物和探针进行评估 打开软件PrimerSelect（在软件DNASTAR里面可以找到）→新建日志 →输入要进行比对的引物和探针序列→选择要比对的序列→点击Report即可输出相应的比对数据 （因为部分序列已经在Primer Premier 5比对过了，所以只要在此处比对正向探针和反向引物，或者反向探针和正向引物即可） 6 3’端尽量不要搭上 2) 利用Primer-BLAST查看引物可能扩增的序列（重要！） 在Primer-BLAST网页输入设计好的正、反向引物序列→点击“Get Primers”进行搜索即可（若不止出现目的病毒序列，还出现了检测物种身上的其他病毒序列，则引物需要重新设计） 4. 引物和探针的合成 1) 设计合成基因序列所需的引物 （若需要检测多个病毒，合成阳性模板，可将需要检测的病毒的扩增序列拼接在一起，最7 好不超过500bp） 百度搜索DNAWorks，进入基因合成的网站 →填写名称（必须包含大写字母、小写字母和数字，不能加横杆或其他字符） →填写网易邮箱 →选择相应的物种（做真核表达时需尤其注意，其他可根据需要进行选择） →设置相应的参数 →粘贴需要合成的基因序列→点击“Design Oligos”，等待邮件（一般几分钟即可收到） →打开收到的邮件，查看引物评分，评分尽量保证在“5”以下，越趋近于“0”越好 8 →复制粘贴引物序列，送往引物合成公司进行合成即可 2) 合成引物 a) 普通PCR引物用脱盐纯DSL即可 b) qPCP引物用PAGE纯，探针用HPLC纯 c) 探针5’端荧光基团选择顺序“FAM→HEX→ROX, CY5”，3’端猝灭基团选择顺序“BHQ→TAMRA→Eclipse”

EST-SSR 引物开发步骤

1、首先计算机安装PC 版perl 程序，然后从GenBank/dbEST （http：//www.ncbi.nlm.nih/entrez） 中以FASTA 格式下载该种中所有的EST 序列，共29830 条。

2、利用Blastclust（v.2.2.10；http：//www. /web/newsltr/spring04/blastlab.htm）软件，对这些EST 序列进行冗余性查找，利用CD_HIT（http：//

/cd-hit/）快速批量去冗余序列。

3、利用est_timmer（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）去除EST 序列中过短的序列（<100bp）和过长的序列（>700bp）以及mRNA 的“帽子”和“尾巴”(A或T)。

4、利用misa.pl（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）识别和定位SSR，其中配置文件misa.ini 用来设置识别SSR 标记的标准。

5、利用primer3 模块批量设计SSR 引物， 引物设计的主要参数是， 引物长度20～26bp； 退火温度Tm 值48℃～65℃；（G+C）含量30%～70%；PCR 扩增产物长度大于150bp。

6、利用MacVector7.0 软件对所设计的引物进行验证，引物由上海生工生物技术有限公司合成。

Genome-SSR 的引物开发步骤

1、通过Genbank数据库，检索相近种的全基因组序列。保存成FAST格式。

2、利用SSRHunter1.3搜索基因组序列中的简单重复序列信息位点。

3、选取信息位点核苷酸重复基序为2～6个的序列为靶标序列，利用软件Primer Premier

5.0设计SSR引物，引物设计的主要参数是， 引物长度20～26bp； 退火温度Tm 值48℃～65℃；（G+C）含量30%～70%；PCR 扩增产物长度大于150bp。并用Oligo 6.65验证引物各项指标的适合度，看有没有引物二聚体、发卡结构等。