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实验一显微镜油镜的使用和细菌的革兰氏染色陈宝莲2010级生态学040212010002一、实验目的1 学习显微镜油镜的使用方法2 学习微生物的无菌操作技术3 学习细菌的革兰氏染色法二、实验原理1 显微镜及油镜物镜的使用原理1) 油镜头的标志油镜头上常刻有OI（oil immersion）或HI（homogeous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记。
在低倍物镜、高被物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numerical aperture）最大，而工作距离最短。
2 ) 显微镜的分辨率显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它的分辨率的大小。
分瓣率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。
D值愈小表明分辨率愈高。
D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比：D=λ/2NA从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。
数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积：NA=n×Sinα/2影响数值孔径大小的因素－是镜口角，二倍介质的折射率。
当物镜与玻片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.0）与玻璃（n=1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。
当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃的相近，光线经过玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。
2 细菌的革兰氏染色原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。
作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类.G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
微生物的实验实验一油镜的使用方法与革兰氏染色实验目的:掌握油镜的使用方法与革兰氏染色的方法实验原理: 革兰染色法⑴革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，脂质含量多，乙醇易透入。
⑵革兰阳性菌等电点（pI 2~3）比革兰阴性菌（pI 4~5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。
⑶革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。
实验步骤: 1.涂片取洁净载玻片1张，用接种环取1～2环生理盐水放于载玻片上，用灭菌的接种环在固体培养基上挑取少许细菌与盐水混合，涂布成直径１cm左右的菌膜（可视挑取菌落的多少涂片范围相应变化）。
若采用液体培养物，可直接取1～2环菌液涂布。
接种环须经火焰灭菌方可放回原处，以免造成污染。
2.干燥涂片最好在室温中自然干燥，或将标本接种面向上，置酒精灯火焰高处慢慢烘干，切勿在火焰上烤。
3.固定干燥后的标本面向上迅速通过火焰3次，这样既可杀菌，又能将细菌固定在玻片上，以免玻片上细菌在染色过程中被水冲洗掉。
2.染色(1)初染：滴加结晶紫染液2～3滴于涂布细菌处，覆盖菌膜，1min后以细水漫过轻洗，将积水甩干。
(2)媒染：滴加卢戈碘液同上，1min后水洗，并将标本片上的积水甩净。
(3)脱色：加95%乙醇数滴于标本片上，轻轻摇晃数秒，斜持玻片使乙醇流掉，再滴加乙醇直至无紫色脱下为止（约30s，灵活掌握时间），细水冲洗，甩干。
(4)复染：滴加石炭酸复红染液，30s～1min后水洗，用吸水纸吸去积水。
3. 镜检用油镜观察，并判断细菌的染色性。
记录实验结果。
4.实验后处理擦干油镜镜头，整理、清洁显微镜，把显微镜放回原处，把标本片放入消毒缸中。
注意事项: 1.标本片涂的太薄或太厚，菌体分散布不均匀，都可影响染色结果。
实验一显微镜油镜的使用和革兰氏染色法A.显微镜油镜的使用实验目的和内容目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
内容：1．学习油浸系物镜的使用方法。
2．用油镜观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。
操作步骤(一)观察前的准备1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。
坐正，练习用左眼观察。
2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。
转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。
观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。
(二)低倍镜观察染色装片首先上升镜简，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。
移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。
(三)高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相懂。
再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。
用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。
将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。
不要移动装片位置，准备用油镜观察。
(四)油镜观察1．提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。
在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。
2．从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。
3．将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。
如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。
仔细观察并绘图。
