ATCC菌种保藏方法

实验室菌种保藏的方法菌种是主要的生物资源，也是食用菌生产首要的生产资料。

一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。

因此，菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。

各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。

一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。

下面介绍几种常用的菌种保藏方法：1斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4。

C左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。

此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。

放线菌、霉菌和有芽匏的细菌一般可保存6个月左右，无芽抱的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。

如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4。

C冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。

这一改进可使菌种的保藏期延长。

此法由于采用低温保藏，大大减缓了微生物的代谢繁殖速度，降低突变频率；同时也减少了培养基的水分蒸发，使其不至于干裂。

该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。

其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。

2石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端IC明使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4。

C冰箱内保藏。

使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150〜170。

C烘箱内灭菌Ih;或121。

C高压蒸汽灭菌60〜80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。

国内外菌种保藏机构目录中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)(液氮)中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)(液氮)中国林业微生物菌种保藏管理中心( CFCC)(液氮)中国药用微生物菌种保藏管理中心(CPCC)(液氮)中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)(液氮)台湾生物资源保存及研究中心(BCRC)(液氮)ATCC (American Type Culture Collection)美国典型菌种保藏中心(液氮)UKNCC (The United Kingdom National Culture Collection ) 英国国家菌种保藏中心(-140℃下低温保存)NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心(液氮)CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生物菌种保藏中心(液氮)NCIMB (National Collections of Industrial, Food and Marine Bacterial) 英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心(液氮)NCTC (National Collection of Type Cultures) 英国典型菌种保藏中心(液氮)BCCM (Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms) 比利时微生物保藏中心(冷冻干燥)DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ) 德国微生物菌种保藏中心(冷冻干燥)NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心KCTC (Korean Collection for Type Cultures) 韩国典型菌种保藏中心VKM (Russian Collection of Microorganisms) 俄罗斯微生物菌种保藏中心(液氮)国内外菌种保藏机构简介中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)中国农业微生物菌种保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China 英文缩写ACCC),成立于1979年,设在中国农业科学院农业资源与农业区划研究所(1979-2003挂靠中国农业科学院土壤肥料研究所管理,2003年以后挂靠中国农业科学院农业资源与农业区划研究所管理)。

保藏菌种的方法
在微生物研究中，保藏菌种是非常重要的一环。

保藏菌种可以保证菌种的纯度和活力，并且方便长期保存和传递。

以下是一些常见的保藏菌种的方法：
1. 冷冻保藏法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用生理盐水或甘油溶液混合菌体，制成菌悬液，然后用干燥冰或液氮冷冻保存。

2. 真空干燥法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌水将菌体洗净，然后在真空条件下干燥保存。

3. 常温干燥法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌纸片或无菌土壤将菌体均匀涂抹在上面，然后在阴凉通风处晾干保存。

4. 液氮保藏法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌水将菌体洗净，然后用液氮冷冻保存。

在保藏菌种过程中，需要注意以下几点：
1. 保证菌株的纯度和活力，避免杂菌和死菌的混入。

2. 在保存菌种前，要对菌株进行鉴定和存档。

3. 在保存过程中，要保证温度、湿度、氧气和光照等环境条件
的稳定和适宜。

4. 定期检查保存的菌种，确保其纯度和活力。

综上所述，保藏菌种是微生物研究中不可或缺的一环。

通过选择合适的保藏方法和严格的管理，可以确保菌种的纯度和活力，方便长期保存和传递。

菌种保存方法a.常用有以下方法：1 半固体保存法：将菌落穿刺接种在半固体中，4度存放，一般可以管3－6月2 低温冻存法：接种菌落的肉汤加20％灭菌甘油，置－20或－70度，可存放一年以上。

3 真空冻干法：试最理想的保存方法，但需要特殊仪器b.基因工程菌：1：30%的灭菌甘油与培养好的菌悬液按照1：1的比例混合，分装到1.5ML的离心管中，每关1ML，存于--20度，但仅保存半年就不太好了，最好保存到——70度的低温冰箱中。

也可用10%的灭菌甘油从斜面上洗下保存。

2：菌悬液中加甘露醇和人血白蛋白c.目前菌种的保存方法主要有以下几种:1.传代培养保存法:一般来说,这是最基本的保存法,用斜面,穿刺或其他方法培养的传代菌种,一般要保存在5度,但因类而异,如霍乱,淋球,脑膜炎,厌氧菌,钩体等要保存于37度为宜.2.液体石蜡覆盖保存法:这是传代培养的变相方法,可以适当地延长保存时间,主要适用于霉菌,酵母菌,放线菌,需氧性细菌等的保存.3.载体保存法1)土壤保存法:主要用于形成孢子回孢囊的微生物的保存,特别适用于真菌和放线菌不改变性状的长期保存.(2)砂土保存法:常用于梭状芽孢杆菌和一部分霉菌的保存,可保存数年.(3)硅胶保存法:本法对保存链孢霉菌较有效,对酵母菌的保存也较有效(4)磁珠保存法:用本法保存根瘤菌在室温下至少可保存2年半(5)滤纸保存法:适用于对干燥抵抗力较强的微生物,如油芽孢细菌和葡萄球菌.另外噬菌体,放线菌和丝状菌也可用本法.4.悬液保存法1)蒸溜水保存法:霉菌,酵母菌和放线菌的大部分,使其悬浮于蒸馏水中,可在室温下保存数年,青枯病假单孢杆菌也可用本法.(2)糖液保存法:过去用于保存酵母菌,但现在已不常用.(3)其他悬液保存法:如乳链球菌可用PBS保存,放线菌可用0.125%稀琼脂液保存.5.寄主保存法:一些微生物如一部分病毒,立克次氏体,螺旋体.原虫和少量丝状菌目前只能使活着的动物,昆虫,植物体和寄生微生物等感染并传代,否则不能保存.6.冷冻保存法1)低温冰箱保存法:多说微生物在-20度保存效果良好,(2)干冰保存法:-70度保存,(3)液氮保存法:保存温度克达到-196度,本法可说是使用范围最广的微生物保存法.7.冷冻干燥保存法:使微生物在冷冻状态下,在减压下利用升华现象除去水份,使细胞的生理活动事实上停止,从而长期维持生活状态,本法适用于大多数细菌和放线菌,另外病毒,噬菌体,立克次氏体,霉菌和酵母菌再多数情况下用本法保存.8.冷冻干燥以外的干燥保存法1)常压干燥保存法,(2)菌片封袋干燥保存法,(3)Stamp干燥保存法,(4)Sordelli干燥保存法,(5):L-干燥保存法(真空干燥保存法)d.我们实验室保存菌种的方法是:1 将菌落穿刺接种在半固体中，如加有琼脂的肉汤培养基，4度存放，保存时间较短一般3－4月2 接种菌落的肉汤0.9ml加100％灭菌甘油0.1ml，置－20度冰箱中可以保存一年左右,－70度冰箱或液氮中可放置N年，细胞的保存我们放了近十年，仍然复苏的很好3 基因工程菌的保存：1：为防止基因工程菌质粒丢失或不稳定，保存菌种加入甘油的量应该不大于10%，一般0.9ml的菌液加0.1ml80％高压灭菌甘油－70度冰箱保存e.菌种的保藏:菌种是一个国家所拥有的重要生物资源，菌种保藏（preservation）是一项重要的微生物学基础工作。

菌种保藏的方法菌种保藏是指将某一特定的菌种保存在适当的条件下，以确保其生活和活力，并能够长时间保存下去的过程。

菌种保藏的方法主要有冷冻法、干燥法、液氮法、乳酸法和多核隔离法等。

下面将逐一介绍这些方法及其适用范围。

冷冻法是一种常见的保藏菌种的方法之一。

它是将菌种培养物以低温冷冻保存的方法，常见的保存温度为-80°C或更低。

冷冻法适用于大多数细菌和许多真菌，但对于某些特殊的真菌菌种可能效果不佳。

干燥法是将菌种培养物完全或部分脱水后保存的方法，常见的干燥方法有冻干和真空干燥。

干燥法适用于许多细菌、真菌和酵母菌，而且保存时间较长，但对于一些需较高水分条件的菌种可能不适用。

液氮法是将菌种保存在液氮中的方法，常见的保存温度为-196°C。

液氮法适用于大多数菌种，包括细菌、真菌和病毒。

液氮法的优点是保存时间长，可以达到数十年甚至更长的时间，并且菌种的生活力相对较好。

乳酸法是一种利用乳酸细菌的代谢产物来保藏菌种的方法。

这种方法适用于一些较难保存的菌种，如肠道菌和一些微嗜酸性菌。

乳酸法的原理是将菌种和乳酸细菌一起培养，乳酸细菌产生的乳酸可以降低培养物的pH值，从而模拟菌种在肠道内的环境，达到保藏菌种的效果。

多核隔离法是将菌种分离成不同的细胞核并分别保存的方法。

这种方法适用于一些证明难以保存的菌种，如高度依赖特定环境条件或具有复杂生命周期的菌种。

多核隔离法可以通过分离不同的菌落或以体细胞核和生殖细胞核分离的方式来保存菌种。

以上是几种常见的菌种保藏方法。

不同的方法适用于不同的菌种，选择适合的保藏方法可以确保菌种的长期保存和维持生活力。

在进行菌种保藏时，需要严格控制培养物的纯度和保存条件，以确保保存的菌种的准确性和可用性。

实验室菌种的保藏方法一、甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。

保藏温度若采用-20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可达10年。

将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。

基因工程菌常采用本法保藏。

二、冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。

它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。

并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。

常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。

由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。

除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。

但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。

保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。

三、液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。

它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。

其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。

美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。