ctDNA与克隆进化

肿瘤的进化与异质性及其在转移中的意义魏金旺;盛媛媛【摘要】肿瘤转移是恶性肿瘤最主要的生物学特性之一,也是导致患者死亡的主要原因.肿瘤的转移潜能是肿瘤异质性的表现之一,而异质性则起源于肿瘤细胞本身及宿主微环境在进化上的差异.这些进化上的差异除了传统理论所认为的基因突变之外,还包括表观基因组学调控、蛋白质修饰等非基因水平方面的改变.本文将结合“种子与土壤”理论,从肿瘤进化与异质性的角度,综述肿瘤细胞自身和癌周环境对肿瘤转移的影响,以期推动肿瘤转移的研究及拓展诊疗思路.【期刊名称】《复旦学报（医学版）》【年(卷),期】2016(043)001【总页数】5页(P122-126)【关键词】肿瘤转移;进化;异质性【作者】魏金旺;盛媛媛【作者单位】复旦大学生物医学研究院上海200032;复旦大学附属华山医院普外科上海200040;复旦大学肿瘤转移研究所上海200040;复旦大学生物医学研究院上海200032;复旦大学附属华山医院普外科上海200040;复旦大学肿瘤转移研究所上海200040【正文语种】中文【中图分类】R73-37恶性肿瘤是威胁人类健康最严重的疾病之一[1],而具有局部浸润和远处转移的能力是恶性肿瘤最主要的生物学特性之一,也是导致患者死亡的主要原因[2]。

肿瘤侵袭转移过程是肿瘤细胞与宿主微环境之间相互作用的动态连续过程,这个过程是复杂的、多步骤的,对其机制的研究也经历了漫长的过程[3]。

Paget提出的“种子与土壤”经典转移理论已经在基础和临床研究中得到充分验证[4-5]。

基于这一理论,本文将从“种子”和“土壤”两个方面,重点介绍进化和异质性与肿瘤转移的关系,对恶性肿瘤转移的相关机制进行综述,以期推动恶性肿瘤转移的研究及拓展诊疗思路。

肿瘤进化和异质性的起源:两种假说在从正常细胞发展到肿瘤细胞的过程中,进化和异质性是一直互相伴随的。

在正常细胞中就存在异质性,表现为各个体之间遗传背景的差异,以及同一个体不同器官之间的分化状态差异[6-7]。

ctDNA检测在结直肠癌临床诊疗中的应用进展谢英超; 周春莲; 徐伟文【期刊名称】《《分子诊断与治疗杂志》》【年(卷),期】2019(011)002【总页数】7页(P73-78,90)【关键词】结直肠癌; 液体活检; 肿瘤标志物; 循环肿瘤DNA; 临床应用【作者】谢英超; 周春莲; 徐伟文【作者单位】南方医科大学检验与生物技术学院广东广州510515【正文语种】中文结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的消化道肿瘤之一，据2018年全国最新癌症报告显示，CRC发病率、病死率在恶性肿瘤中均位居前5位且保持上升趋势[1]。

CRC起病隐匿，早期病变位于黏膜层及黏膜下层，且病情发展缓慢，直至中晚期才会出现明显临床症状[2]。

其发生发展是一个多因素、多基因、多过程综合作用的结果，既有多种基因突变、缺失和杂合子丢失，又涉及表观遗传学改变如基因的甲基化以及组蛋白的修饰。

当前CRC临床诊疗难点主要在于以下几个方面：①CRC在早期很难被及时发现；②组织活检有创，具有肿瘤异质性且反复获取不实际；③常规肿瘤标志物存在灵敏度低、特异性差等缺点；④不能随时对诊疗效果进行监测评估；⑤肿瘤的异质性使得对个体化用药的指导以及耐药性监测手段受限等。

早诊断早治疗、实时监控、靶向用药以及个体化治疗是提高肿瘤远期生存率、降低死亡率的关键，而无法准确捕捉具有时空特异性的肿瘤是当前癌症临床诊疗面临的最大难题，循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）检测被公认为是目前解决此问题的最佳方案。

ctDNA作为液体活检的生物标志物之一，具有较高的特异性，相较于传统诊断手段，ctDNA检测表现出诸多优势：①无创，实时，多次；②能够反映肿瘤基因组信息；③假阳性率低，灵敏度高，准确度高；④能够对肿瘤的演化和适应性改变进行监控；⑤能够对肿瘤病人的治疗效果进行实时监控（尤其在追踪肿瘤转归、转移、复发等方面），为个性化治疗提供指导（如个性化靶向用药、个性化治疗等）。

Analysis of ESR1 mutation in circulating tumor DNA demonstrates evolution during therapy for metastatic breastcancerSci Transl Med, 2015IF：16.26摘要获得性ESR1突变是芳香化酶抑制剂（AIs）耐药的主要机制。

作者运用多重数字PCR检测了171例晚期乳腺癌患者的ctDNA中ESR1突变状态，并探讨其与临床结果的相关性。

1.ctDNA中的ESR1突变状态与配对的组织活检结果具有高度一致性；2.ESR1突变仅能在ER阳性且接受过AI治疗的患者中检测到；3.含有ESR1突变的患者在随后的AI治疗中显示出更短的无进展生存期（PFS）；4.与首次在辅助治疗时行AI治疗的患者相比，转移后才行AI治疗者的ctDNA中检测到ESR1突变的患者比率更高（36.4% vs. 5.8%, P=0.0002）。

意义ctDNA分析能够成功检测ESR1的突变状态并预测AI的耐药情况，从临床角度证明检测ctDNA中ESR1突变的临床实用价值。

ER+乳腺癌患者ctDNA中的ESR1突变检出情况●多重数字PCR对ctDNA中ESR1突变的检出具有高度灵敏性和准确性(A图)；●比较了31例患者ctDNA与组织活检中ESR1的检出情况，一致性高达97% (30/31)，ctDNA中的ESR1阳性预测值达到100% (B图)；●EDTA管和Streck管收集的血液样本的检出率具有100%的一致性，检出结果(copies/ml)也高度一致(C,D)。

可见，运用多重数字PCR检测ctDNA中ESR1的突变状态具有临床分析价值。

血浆中ESR1突变检出提示AI耐药●ESR1突变仅能在ER阳性的晚期乳腺癌患者血浆中检测到(A);●79%的ESR1突变以单克隆的形式存在(B);●含有ESR1突变的患者在随后的AI治疗中显示出更短的无进展生存期（PFS）。

Distinct biological subtypes and patterns of genome evolution in lymphoma revealed by circulating tumor DNASci. Transl. Med . Nov 2016IF: 16.3背景1.弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B Cell Lymphoma, DLBCL) 是非霍奇金淋巴瘤(NHL) 中最为常见的类型。

治愈率高，但是30-40%的患者仍会复发；2.目前缺乏有效方法对患者进行风险分级评估并指导治疗。

COO分类法的临床应用潜力巨大，但是基于组织的分子表达水平检测具有局限性；3.对于由滤泡淋巴瘤(Follicular Lymphoma, FL)转化而来的DLBCL，缺乏准确的转化预测指标。

ctDNA：无创连续方法1. Panel 设计:recurrent SNV, Indel;breakpoints (BCL2, BCL6, MYC IGH);重链可变区IgVH & 重链连接簇IgJH2. 样本信息患者92例: 76 DLBCL (初诊/复发) + 12 FL + 4 其它组织活检76份: 76 DLBCL血浆144份: 45 治疗前+ 99 治疗后结果——技术表现●100%的肿瘤组织中检测到体细胞变异，中位突变个数为134；●与Fish相比，translocation的检出灵敏度为89%。

●血浆中能检出组织中91%的driver突变；●52%的组织Non-driver突变能在血浆中检测到；●检出率与分期和ctDNA浓度(黑色三角)有关：当ctDNA浓度大于5hGE/mL时，血浆中能检出至少一个SNV；基于CAPP-seq的ctDNA检测能够反应肿瘤组织的分子特征结果——监测对三例服用依鲁替尼的患者进行疗效监测，其中2例患者的ctDNA检测到BTK的耐药突变，相邻的BTK突变显示趋同的进化方式基于CAPP-seq的ctDNA检测能够实时监测肿瘤的克隆进化和分子耐药结果——预后ctDNA可以作为一个独立的预后指标结果——复发对来自11名患者的30个CR期血浆和8个复发血浆进行CAPP-seq检测●73%（8/11）的患者复发前能检测到ctDNA；●首次检测到MRD距离临床复发平均时长188天；●CAPP-seq的MRD检出率高于IgHTS两倍；●疗后ctDNA阳性患者的PFS显著短于ctDNA阴性患者基于CAPP-seq的ctDNA能够改善MRD检测和提前预测复发结果——分型从以往研究中筛选出23个基因以及该基因在不同类别中的突变频率根据样品的突变频谱，通过Bayesian方法分别计算归属ABC和GCB类别的可能性并完成分类。

好多刚接触肿瘤研究的小伙伴们傻傻的分不清楚cfDNA和ctDNA，搞不明白什么是SNP 和SNV，不知道什么是融合基因和易感基因。

不怕不怕，今天小编汇总了一些肿瘤研究领域的常见词汇。

有了这篇肿瘤词汇大全，看文献搞科研妥妥的~1. cfDNA (cell free DNA)cfDNA即血液中游离的自身DNA，这类DNA多是从身体的细胞或者白血球破裂释放出来的，这基本都是无害的，会被自身清理掉。

2. ctDNA (circulating tumor DNA)ctDNA即循环肿瘤DNA，是一种来自肿瘤细胞的游离DNA，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中。

因为ctDNA和由正常细胞产生的游离DNA碎片是混合在一起的，只占所有游离DNA （cell-free DNA，cfDNA）含量的0.1%-1%之间，因此准确检测出ctDNA的难度相当的大。

3. CTCs (circulating tumor cells)CTCs即循环肿瘤细胞，是从原发肿瘤或转移形成的新肿瘤上掉落，并且进入到患者的外周血循环系统中的恶性肿瘤细胞。

因自发或诊疗操作会从实体肿瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，只有少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶。

而近年来的大量文献证明，CTC与早期癌症的不良预后相关，涵盖乳腺癌、膀胱癌、头颈癌、睾丸生殖细胞癌与结直肠癌等多种癌症。

4. 体细胞突变(somatic mutation)体细胞突变是指除生殖细胞外的体细胞所发生的变异，如发生在器官和组织的变异。

这些变异是肿瘤样品所特有的，其并不来源于父母，也不会传递给后代，往往跟肿瘤的发生和发展有着密切关系，是肿瘤研究中的重点，对于揭示肿瘤发生发展机制有着重要作用。

5. 生殖细胞突变生殖细胞突变，是指来源于精子或卵子的细胞的突变，会传递给后代。

6. SNP (single nucleotide polymorphism)SNP即单核苷酸多态性，是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

叶绿体基因组的结构现在已知道，叶绿体DNA(ctDNA)是双链环状分子，大小约为120～160kb。

大多数植物的ctDNA分子中有两段反向重复的核苷酸序列，是大多数植物ctDNA 所共有的特征，大小约在6～76kb之间，不同植物ctDNA大小的差异主要是由于反向重复序列大小的不同而引起的。

但在有些植物如蚕豆、豌豆并未发现有两段对称的反向重复序列，而在眼虫藻等却发现有3段正向重复序列。

Shinozaki等于1986年分别发表了烟草和地钱的ctDNA全序列，Hiratsuka也于1989年报道了水稻ctDNA的全序列，这些均显示ctDNA含有编码叶绿体rRNA和tRNA的基因以及100个左右的蛋白质结构基因。

同时发现大多数植物的ctDNA含有2个rDNA 拷贝，眼虫藻中有3个紧邻的rDNA拷贝，豌豆和蚕豆却仅含有一个rDNA拷贝，所以一般认为rDNA存在于ctDNA反向重复序列中。

埃内亚斯(Eneas Filho)等发现豌豆叶绿体中核糖体的60种不同蛋白组分中，有1/3是由ctDNA编码。

现在已公认在叶绿体的所有蛋白质中既有叶绿体基因组编码的(约占总种类的30％，例如光合作用反应中心的蛋白等)也有核基因组编码的(约占总种类的70％，例如类囊体膜的一些蛋白等)，还有一些功能性寡聚蛋白质，其组成亚基分别是由两个基因组编码的，例如叶绿体中的可溶性蛋白Rubisco，其大亚基是由自身基因组编码，而小亚基则由核基因组编码。

但也有例外，Reith等就曾在灰藻和红藻中发现Rubisco的大小亚基皆由叶绿体自身基因组编码，且大小亚基的基因共同组成一个操纵子。

Turmel等于1978年报道在衣藻ctDNA的23SrDNA中发现有一个内含子(intron)的存在，这是第一次在ctDNA中发现的与真核生物核基因类似的断裂基因。

后来，Koch等在玉米ctDNA的trnI和trnA基因中也发现有内含子。

高等植物叶绿体DNA的内含子主要在tRNA基因中发现，很少在蛋白质结构基因中发现，但在绿藻中却发现大量的蛋白质结构基因也存在有内含子。

遗传学中国大学mooc课后章节答案期末考试题库2023年1.基因组测序策略包括鸟枪法测序和克隆重叠群法。

克隆重叠群法的优点是速度快、简单易行、成本低，而鸟枪法测序更准确，但成本高。

参考答案:错误2.基因组物理图谱的构建主要有4种途径，即限制酶作图、基于克隆的基因组作图、荧光标记原位杂交和顺序标签位点。

参考答案:正确3.基因组学的重要组成部分是基因组计划。

进行基因组计划大体可分为5步：即①构建基因组的遗传图谱；②构建基因组的物理图谱；③测定基因组DNA的全部序列；④构建基因组的转录本图谱；⑤分析基因组的功能。

参考答案:正确4.N值是指生物体所含有的DNA总量。

参考答案:错误5.遗传学的重要作用包括：参考答案:提供生物进化的理论基础；_治疗遗传疾病_研究生命现象的本质；_指导新品种选育；6.遗传学研究的对像是遗传和变异。

参考答案:正确7.囊性纤维化病是一种常染色体隐性遗传病。

某对正常夫妇均有一个患该病的弟弟，但在家庭的其他成员中无该病患者。

问他们的孩子患该病的概率有多大？参考答案:1/98.大麦的三级三体的保持属于（）。

参考答案:染色体非整倍体的应用9.人类镰刀形贫血病的遗传为不完全显性。

参考答案:错误10.多因一效指多个基因影响同一性状的表现。

参考答案:正确11.每个核小体的核心是由H1，H2B、H3、H4四种组蛋白各以两个分子组成的八聚体。

参考答案:错误12.每个物种具有相对恒定的染色体数目，染色体数目改变可导致生物发生遗传变异。

参考答案:正确13.转基因生物分子检测的方法有PCR检测、Southern杂交、Northern杂交和Western杂交。

其中Western杂交是检测目的基因在转录水平是否表达。

参考答案:错误14.B血型的男人与O血型的女人婚配可能有O血型的孩子。

参考答案:正确15.10个大孢子母细胞可形成20个极核，20个助细胞和30个反足细胞。

参考答案:正确16.在玉米中，配子体雄性不育类型的育性杂合体（Rr）与易位杂合体的半不育表现形式是相同的。

专家共识：液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识液体活检(liquid biopsy)在肿瘤临床诊断治疗领域的应用日益广泛，是实现对肿瘤"个体化精准医疗"的重要手段。

为科学规范液体活检技术在临床检验中的应用，中华医学会检验医学分会、国家卫生健康委员会临床检验中心共同制定了《液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识》。

本专家共识围绕CTC和ctDNA两种靶标，综合近年来发表的液体活检领域重要研究成果、结合我国肿瘤液体活检的临床实践需求，就相关的临床常用检测技术的实施和质量管理提供常规指导原则。

液体活检技术的选择(一)ctDNA检测技术的选择目前，实验室常用的ctDNA检测技术包括扩增受阻突变体系(amplification refractorymutation system，ARMS)、二代测序(next－generation sequencing，NGS)、数字PCR(digital PCR，dPCR)和核酸质谱检测等。

ARMS方法是目前获得中国食品药品监督管理局(China Food and DrugAdministration，CFDA)批准可用于临床ctDNA检测的方法，在临床实践中应用相对普及。

由于NGS方法在技术与成本方面存在瓶颈，使得ARMS在检测诸如EGFR等已知突变中具有明显优势。

针对未知突变的发掘，NGS方法则具有其他方法无可比拟的技术优势。

包括Nature Medicine、Lancet Oncology 及New England Journal of Medicine在内诸多顶级期刊所报道的多项临床试验结果证实NGS在耐药监测中具有重要的临床价值：通过NGS监测可有效发掘耐药新突变，及时调整干预措施，切实提高靶向治疗疗效。

dPCR和基于质谱的核酸检测方法尽管可应用于已知突变ctDNA的检测，但仅限于实验室自建，尚缺乏高等级循证医学证据的支持，目前仍难以进入临床实践。

DNA的克隆过程概述DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。

DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。

一目的DNA片段的获得DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。

由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。

若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。

如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DN A 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。

二载体的选择基因工程的载体应具有一些基本的性质：1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。

2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。

同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。

3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。

4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。

若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。

DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNA phage ），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。

dna 克隆的基本过程DNA克隆的基本过程DNA克隆是指通过人工手段将一个DNA分子复制成许多完全相同的DNA分子的过程。

这一技术的应用非常广泛，可以用于基因工程、医学研究、生物学研究等领域。

下面将介绍DNA克隆的基本过程。

第一步：DNA提取DNA克隆的第一步是从细胞中提取DNA。

细胞可以来自任何生物体，包括人类、动物、植物等。

DNA提取可以通过多种方法进行，常用的方法是利用细胞裂解酶和蛋白酶将细胞膜和细胞核膜破坏，释放出DNA分子。

第二步：DNA片段的制备在DNA克隆中，需要将待克隆的DNA分子切割成较小的片段。

这可以通过限制性内切酶进行，限制性内切酶能够识别特定的DNA序列并切割DNA链。

切割后的DNA片段可以是几百到几千个碱基对长。

第三步：载体的选择在进行DNA克隆时，需要选择一个合适的载体来携带待克隆的DNA 片段。

常用的载体包括质粒和噬菌体。

质粒是一种环状的DNA分子，可以在细菌中自主复制。

噬菌体是一种病毒，可以感染细菌并将其DNA插入到细菌染色体中。

第四步：DNA连接将DNA片段和载体进行连接是DNA克隆的关键步骤。

这一步骤需要使用DNA连接酶，该酶能够将DNA片段的末端与载体的末端连接起来，形成一个完整的DNA分子。

连接后的DNA分子被称为重组DNA。

第五步：转化将重组DNA引入到宿主细胞中是进行DNA克隆的下一步。

转化可以通过多种方法进行，包括热冲击法、电穿孔法和化学法等。

这些方法都能够使宿主细胞吸收外源DNA，并将其整合到细胞染色体中。

第六步：筛选和鉴定为了确定哪些细胞成功地转化了重组DNA，需要进行筛选和鉴定。

常用的筛选方法是将转化后的细胞培养在含有特定抗生素的培养基上，只有带有重组DNA的细胞才能生长下来。

鉴定可以通过PCR扩增和DNA测序等方法进行。

第七步：扩增成功鉴定后，可以通过培养和扩增来获得大量的重组DNA。

重组DNA 可以在细胞中自主复制，从而得到足够多的DNA分子。

循环游离肿瘤 ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）测序技术是液体
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中国临床保健杂志 ２０１６年 １０月第 １９卷第 ５期 ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＨｅａｌｔｈｃ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２０１６，Ｖｏｌ．１９，ＮＯ．５
第一代基因测序技术出现于 ２０世纪 ７０年代， 标志性技术是由 Ｓａｎｇｅｒ和 Ｇｉｌｂｅｒｔ等人发明的链终 止法和化学降解法，已广泛应用于生命科学研究中， 如人类基因组计划即是采用第一代测序技术，总共 测量了人类基因组中约 ３０亿个碱基对，发现大量与 疾病有关的基因，为疾病的诊断与治疗提供了大量 信息［５７］。第一代基因测序技术方法简便快捷，但测 序通量低，操作过程复杂且费用高，在大样本测序上 也存在诸多困难。
活检的一种，与现有的组织活检技术不同，其通过检 测外周血或体液标本中 ｃｔＤＮＡ可以在疾病早期检 出肿 瘤 。 ［１６］ 早 在 １９９８年 就 有 研 究 证 实 了 利 用 ｃｔＤＮＡ诊断 癌 症 的 可 行 性。在 结 肠 癌、胰 腺 癌、肺 癌、肝癌、膀胱癌和头颈部癌等癌症中，ｃｔＤＮＡ中包 含 ＤＮＡ点突变、甲基化、微卫星不稳定性等诸多变 异信息［１７］。但由于传统检测方法的局限性，只能针 对某一个或几个特定的基因进行检测，从而限制了 其在癌症诊断领域的应用。高通量测序技术的发展 使得研究者能够 对 ｃｔＤＮＡ进 行 全 基 因 组 测 序［１８］。 Ｄａｗｓｏｎ等［１９］证实采用基因测序技术检测 ｃｔＤＮＡ在 监测肿瘤负荷的敏感性和动态性方面均优于传统的 肿瘤标记物检测和循环肿瘤细胞检测。该研究提示 利用基因测序技术检测 ｃｔＤＮＡ有望成为肿瘤患者 早期诊断的有力手段。 ２．２ 肿瘤个体化治疗 个体化治疗一直是肿瘤治 疗过程中的热点问题，高通量基因测序技术的出现 推动了肿瘤个体化治疗的进展。部分肿瘤患者基因 组存在特征性的改变，如甲基化水平的改变，ＫＲＡＳ、 ＥＧＦＲ、ＴＰ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２基因突变等［２０］。通过 高通量测序技术可以精确检测出这些变异，从而帮 助制订个体化的治疗措施，包括分子靶向药物或通 路靶向药物的使用和放化疗的应用［２１］。同时，采用 高通量测序技术比较肿瘤原发灶与复发灶基因序列 的差异，可以帮助评估化疗效果和了解耐药的潜在 机制 ［２２］。既往肿瘤患 者 的 基 因 测 序 取 材 手 段 主 要 为组织活检，但该方式的有创性会影响对基因状况 的实时观察，同时由于肿瘤存在异质性，单一部位的 活检并不能反映肿瘤的全貌；采用高通量测序技术 无创性检测 ｃｔＤＮＡ将会很好地解决上述问题［１６，２３］。 Ｕｃｈｉｄａ［２４］和 Ｓｏｂｅｒ等［２５］证实对肺癌患者 ｃｔＤＮＡ进 行深度测序可确定其表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）分 型，从而决定是否使用酪氨酸激酶抑制剂（ＴＫＩｓ）进 行靶向治 疗。 Ｌｉａｏ等［２６］采 用 高 通 量 测 序 技 术 检 测 肝癌患者 ｃｔＤＮＡ，证实其可预测无复发生存期，并可 克服肿瘤异质性的限制。通过高通量测序技术监测 编码免疫球蛋白受体的 ｃｔＤＮＡ片段可比影像学检 查更早发现弥漫性 Ｂ淋巴瘤的复发，同时还可提供 肿瘤异质性、克隆演变进程和耐药机制方面的信息， 从而指导淋巴瘤的个体化治疗 。 ［２７］ 由于基因测序 技术在取材手段和方式方法的不断更新，其必将在 肿瘤个体化治疗中发挥举足轻重的作用，从而开启 精准医疗疾病之 一。由 于 其 发 病 隐 匿、治 疗 方 法 局 限、多 数 预 后 不 良，且分子生物学特征复杂多变，因而肿瘤的预防、 早期筛查与诊断、个体化治疗、预后评估一直是临床 医生致力于解决的关键问题。研究已证实，肿瘤多 存在基因的改变，随着分子生物学技术的发展，基因 测序技术取得长足进步，这对上述难题的解决起到 巨大的推动作用［１４］。本文就基因测序技术在肿瘤 诊疗中的应用进行综述。 １ 基因测序技术的概述

707欢迎关注本刊公众号·综　述·《中国癌症杂志》2020年第30卷第9期 CHINA ONCOLOGY 2020 Vol.30 No.9项目基金：国家自然科学基金（81772263，81972000，81902139）；2019厦门市医疗卫生重点项目（YDZX20193502000002）； 复旦大学附属中山医院临床研究专项基金（2018ZSLC05）；上海市临床重点专科建设项目（医学检验科）。

通信作者：郭　玮 E-mail: guo.wei@ 克隆性造血（clonal hematopoiesis ，CH ）是一种与年龄相关的生物学状态［1］。

随着对这一问题探索的深入，研究人员逐渐摸索出CH 的大致突变谱，对其发生、发展的机制也有了初步了解。

相关研究［1］也揭示了CH 与恶性血液肿瘤及非恶性疾病间的关联性。

在近5年内，CH 的文献报道爆炸式增长，越来越多的研究者开始着眼于其对肿瘤体细胞突变的影响。

肿瘤的诊疗已经逐渐步入精准医疗时代，医患双方在追求个体化的同时也更加强调精确性。

CH 对基因检测会带来怎样的影响？是否会对后续临床应用产生干扰？医师和患者在报告解读时有哪些需要额外关注的地方？以上都是业界关注的热点，本文也将就此展开讨论。

1 CH的定义 CH 通常是指具有单或多个体细胞突变的血细胞克隆亚群的增殖，伴或不伴轻度血细胞减少［1］。

2015年提出了意义未明的CH （CH of indeterminate potential ，CHIP ）这一术语用于描述血液肿瘤前状态，指不符合恶性血液疾病的个体，血液或骨髓中出现相关体细胞突变的现象，亦被称为与年龄相关的CH （age-related CH ，ARCH ）［2-3］。

在血液相关文献表述中，CHIP 这一表达更为常用，而其余如实克隆性造血对肿瘤体细胞突变检测的影响陈馨宁1，王蓓丽1,2，郭　玮1,21.复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032；2.复旦大学附属中山医院厦门医院检验科，福建 厦门 361015［摘要］ 克隆性造血（clonal hematopoiesis ，CH ）突变是造血干细胞（hematopoietic stem cell ，HSC ）携带的突变，是年龄和外在环境（吸烟、放化疗等）共同作用的结果。

《肿瘤DNA甲基化标志物检测及临床应用专家共识（2024版）》要点1 DNA甲基化标志物概述DNA甲基化是一种DNA的共价修饰，具体是指DNA甲基转移酶（DNMTs）将甲基加到DNA CpG序列中胞嘧啶的5'碳位，形成5-甲基胞嘧啶的过程。

与传统的肿瘤标志物相比，DNA甲基化标志物具有更早期、更无创、更精准等优点。

因此，可以通过非侵入性方式获得的痰液、血浆、血清或尿液等样本进行DNA甲基化标志物检测。

一些DNA甲基化异常发生在肿瘤形成的初始阶段，通过检测与肿瘤发展相关的甲基化标志物，可以辅助癌症早期诊断、评估进展风险。

DNA甲基化标志物甲基化水平的增加或降低与肿瘤预后密切相关，可用于治疗或根治性手术后评估肿瘤微小残留病灶（MRD）和监测复发。

此外，DNA甲基化标志物还可作为化疗敏感性的标志，某些特定基因的甲基化可能预示着癌症对治疗的反应，可用于判断化疗药物的疗效，以更好地指导治疗方案。

2 DNA甲基化标志物的临床检测2.1 临床样本前处理注意事项细胞基因组与游离DNA（cfDNA）均可用于肿瘤DNA甲基化检测，常采用组织、血液样本，也可采用尿液、浆膜腔积液、灌洗液、粪便、拭子等样本。

专家共识：各类样本经采集后，应尽可能减少转运环节与耗时，及早分离检测组分。

血液样本应避免溶血，不可使用肝素抗凝。

检测游离DNA时，采集量应充足，及早采用两步离心法分离无细胞血浆，分离前不可对含红细胞血样进行冻存。

新鲜体液及灌洗液样本如含较多血液成分可进行抗凝处理。

粪便样本推荐采用含防腐剂保存液。

（推荐等级：强推荐）2.2 DNA甲基化标志物检测技术方法2.2.1 DNA提取与纯化2.2.2 DNA转化2.2.3 DNA甲基化检测平台专家共识：抽提纯化所得DNA应根据样本类型制定质量合格标准并进行评价，包括浓度、纯度和DNA完整性。

cfDNA还应评估片段分布，以排除基因组DNA污染。

DNA甲基化检测需要针对不同的标本类型与检测应用选择适宜的转化方法，并关注转化技术的最新进展。

全外显子组测序在肺癌的发病机制研究和诊治中的临床意义唐永莉;张瑞涛【摘要】全外显子组测序(WES)是利用序列捕获技术将全外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因分析方法.外显子组测序较全基因组序列测序更简便、经济和高效,其目标区域覆盖度也更高,便于变异检测.外显子组测序技术已经应用到寻找与各种复杂疾病相关的致病基因和易感基因的研究中.肺癌是常见的恶性肿瘤之一,基于国内外对全外显子测序在肺癌中的研究成果,现就全外显子测序在肺癌的诊治以及肺癌的发生机制的研究进行综述.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2019(039)002【总页数】5页(P272-276)【关键词】全外显子组测序;肺癌;易感基因;基因突变【作者】唐永莉;张瑞涛【作者单位】三峡大学医学院,湖北宜昌443000;三峡大学医学院,湖北宜昌443000【正文语种】中文【中图分类】R734.2外显子组是一个物种基因组中全部外显子区域的总和，它是基因行使其功能最直接的体现。

人类外显子组序列约占人类全部基因组序列的1%，但大约包含 85% 的致病突变。

全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)是一种高效的基因组分析法，基于捕获技术的准确性和测序技术的高通量性，将基因组中全部的外显子区域捕获富集并进行测序。

外显子组测序是一种特异性测序，单纯针对基因组编码区域及其侧翼序列。

其基本流程包括外显子区域序列的富集、高通量测序及测序数据的生物信息学分析。

2009年科学家利用全外显子测序，找到了弗里曼谢尔登综合征患者的MYH3 突变，为全外显子作为遗传学研究的工具奠定了基础[1]，2013年，对于外显子测序可用于临床诊断以及外显子测序的操作流程和生物信息学分析有了具体介绍，并提示外显子组测序可用于遗传病的临床诊断[2]。

2014年制定了人类疾病遗传变异研究指南和高通量测序临床应用指南，对于全外显子测序有了更深的认识[3- 4]。

基因克隆和DNA测序技术近年来，随着科技的进步，基因克隆和DNA测序技术已经被广泛应用于医学、生物学、农业等领域。

本文将就这两个技术的原理、应用和未来发展作简要介绍。

一、基因克隆基因克隆可以将一段DNA片段从一个生物体内提取出来，并在实验室内复制许多次产生大量相同的DNA片段。

这个过程分为四个步骤：提取DNA、将DNA插入载体、转化细胞并培养、筛选重组菌落。

基因克隆的应用非常广泛，其中最常见的应用是制备大量高纯度蛋白质，因为许多蛋白质都可以通过转化细胞的方式产生。

此外，基因克隆也可以用于生产药物、改良农作物等。

随着基因克隆技术的不断发展，我们可以预见到基因克隆的应用范围将不断扩大，并对许多领域产生深远的影响。

二、DNA测序技术DNA测序技术是指通过分析DNA序列来研究生物的基因信息。

其原理是将DNA片段分解为单个核苷酸，然后以某种特定的顺序重新组合这些核苷酸，最终得到DNA的准确序列。

DNA测序技术已经被广泛应用于基因学和医学中。

它被用于研究基因的进化，诊断遗传病，拟合药品治疗方案等等。

此外，该技术还可以帮助实现个性化医疗，并为患者提供有效的治疗方式。

随着科技的不断进步，DNA测序技术也将不断发展，变得更加准确和高效。

它的应用将进一步扩大，未来或许可以应用于解决更多的生物学问题和医学难题。

总结基因克隆和DNA测序技术是目前生物学领域的两项重要技术。

他们不仅为我们理解生命科学提供了新的方式，而且也为医疗、药物研发、农业等带来巨大的发展机遇。

我们也相信随着技术的发展，生命科学将为人类更好的生活做出更多贡献。

分子生物学名词解释最全（3）分子生物学名词解释最全att sites(att位点)：在噬菌体和细菌染色体噬菌体插入或切除细菌染色体的位点。

attenuation (衰减)：控制一些细菌启动子表达中涉及的转录终止调控。

attenuator (衰减子)：衰减发生处的一种内部终止子序列。

autogenous control (自体调控)：基因产物减弱(负自体调控)或者激活(正自体调控)其编码基因表达的作用。

autonomous controlling element(自主控制元件)：玉米中一种具有转座能力的转座元件。

autoradiography(放射性子显影)：通过放射性标记分子在胶卷上留下图像检测分子的方法。

autosomes (常染色体)：除性染色体外的所有染色体。

二倍体细胞拥有两套常染色体。

bb lymphocytes or b cell (b淋巴细胞或b细胞)：合成抗体的细胞。

backcross (回交)：杂交检测的另一种(早期的)说法。

back mutation(回复突变)：逆转产生基因失活效果突变的突变，从而使细胞恢复野生型。

bacteriophage (细菌噬菌体)：侵染细菌的病毒，通常简称为噬菌体。

balbiani ring (b环)：多线染色体条带中一个很大的泡状环。

normal chromosomes(常染色体)：相对较大，一定区域内在特定化学处理下保持着色。

base pair (碱基对)：是dna双链中一对a和t或g和c。

在rna 中特定条件下也能形成其它的配对。

bidirectinal replication(双向复制)：当两个复制叉在同一起始点以不同的方向移动时形成。

bivalent(二价染色体)：在减数分-裂初期一种包括四条染色单体的结构(两个染色单体代表同源染色体)。

blastoderm(囊胚层)：昆虫胚胎发育的一个阶段，其中胚胎周围的一层细胞核或细胞围绕着中央的卵黄。

rbcL基因在水稻叶绿体DNA基因库克隆中的定位
明镇寰
【期刊名称】《浙江大学学报（理学版）》
【年(卷),期】1996(000)001
【摘要】由水稻品系珍汕９７不育系为材料制得的叶绿体ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）基因库中，筛选到屯含核酮糖１，５－二磷酸羧化酶／加氧酶大亚基基因（ｒｂｃＬ）的重组质粒，对该重组质粒用ＰｖｕⅡ，Ｐｓｔ１ｔ和ＳａｌＩ限制性内切酶进行了分析并制得了限制图谱，ｒｂｃＬ基因在该图谱上进行了定位。

【总页数】1页(P62)
【作者】明镇寰
【作者单位】生命科学学院;生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】S511.103
【相关文献】
1.图位克隆技术在水稻基因定位和克隆中的应用 [J], 徐洪伟;周晓馥
2.水稻Xa-5基因在水稻和玉米中的比较物理定位 [J], 覃瑞;魏文辉;金危危;宋运淳
3.水稻Xa21基因在水稻和玉米中的比较物理定位 [J], 鄢慧民;宋运淳
4.PSIIP680 ChlaAP基因在水稻叶绿体基因组中的定位 [J], 朱嘉晖;李继耕;孔繁瑞
5.水稻叶绿体DNA克隆片段的分析和rbcL基因在重组质粒上的定位 [J], 沈志伟;孙崇荣;曹凯鸣;詹树萱
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