膳食纤维含量测定方法
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酶-重量法?1.原理：?样品分别用α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶进行酶解消化以去除蛋白质和可消化的淀粉。
总膳食纤维（TDF）是先酶解，然后用乙醇沉淀，再将沉淀物过滤，将TDF残渣用乙醇和丙酮冲洗，干燥称重。
不溶性和可溶性膳食纤维（IDF和SDF）是酶解后将IDF过滤，过滤后的残渣用热水冲洗，经干燥后称重。
SDF是将上述滤出液用4倍量的95%乙醇沉淀，然后再过滤，干燥，称重。
?TDF、IDF和SDF量通过蛋白质、灰分含量进行校正。
?2.适用范围??本方法适用于各类植物性食物和保健食品。
?3.仪器?烧杯：400或600ml高脚型。
??过滤用坩埚：玻料滤板，美国试验和材料学会（ASTM）40-60μm，Pyrex?60ml （Corning??buchner，或同等的）。
如下处理：?（1）?在灰化炉525℃灰化过夜。
炉温降至130℃以下取出坩埚。
?（2）?用真空装置移出硅藻土和灰质。
?（3）?室温下用2%清洗溶液浸泡1小时。
?（4）?用水和去离子水冲洗坩埚；然后用15ml丙酮冲洗然后风干。
?（5）?在干燥的坩埚中加硅藻土，在130℃烘干恒重。
?（6）?在干燥器中冷却1小时，记录坩埚加硅藻土重量，精确至。
??真空装置：?（1）?真空泵或抽气机作为控制装置。
?（2）?1L的厚壁抽滤瓶。
?（3）?与抽滤瓶相配套的橡皮圈。
?振荡水浴箱：?（1）?自动控温使温度能保持在98±2℃。
?（2）?恒温控制在60℃。
??天平：分析级，精确至±。
?马福炉：温度控制在525±5℃。
?干燥箱：温度控制在105和130±3℃。
?干燥器：用二氧化硅或同等的干燥剂。
干燥剂两周一次在130℃烘干过夜。
??PH计：注意温控，用、和缓冲液标化。
??移液管及套头：容量100μl和5ml。
??分配器或量筒：?（1）?15±，供分配78%的乙醇，95%的乙醇以及丙酮。
?（2）?40±，供分配缓冲液。
?.?磁力搅拌器和搅拌棒。
?4.?试剂?全过程使用去离子水，试剂不加说明均为分析纯试剂??乙醇溶液：?（1）?85%：加895ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。
?（2）?78%：加821ml95%乙醇在1L量筒中，用水稀释至刻度。
??丙酮：??供分析用酶：在0-5℃下储存。
?（1）?热稳定α-淀粉酶溶液：Cat.?No.?A3306，Sigma?Chemical?Co.，St.?Louis，MO63178，或?Termamyl?300L，Cat.?No.?361-6282，Novo-Nordisk，Bagsvaerd，Denmark，或等效的酶。
?（2）?蛋白酶：Cat.?No.?P3910，Sigma?Chemical?Co.，或等效的。
当天用MES/TRIS缓冲液中现配50mg/ml酶溶液。
?（3）?淀粉葡糖苷酶溶液：Cat.?No.?AMG?A9913，Sigma?Chemical?Co.，或等效的。
??硅藻土：酸洗（Celite?545?AW，，Sigma?Chemical?Co.，或等效的）。
??洗涤液：两者挑一。
?（1）?铬酸：120g重铬酸钠Na2Cr2O7·2H2O，1000ml蒸馏水和1600ml浓硫酸。
?（2）?实验室用液体清洁剂，预备急需清洗的（Micro，International?Products?Corp.，Trenton，NJ08016，或等效的）。
用水配制2%溶液。
??MES-TRIS缓冲液：L，温度在24℃时pH值为。
?（1）?MES：2-（N-吗啉代）磺酸基乙烷（，Sigma?Chemical?Co.或等效的）。
?（2）?TRIS：三羟（羟甲基）氨基甲烷（，Sigma?Chemical?Co.或等效的）。
?在的蒸馏水中溶解和，用6mol/L?NaOH调pH到，用水定容至2L。
（注意：24℃时的pH为，但是，如果缓冲液温度在20℃，pH就为，如果温度在28℃，pH为。
为了使温度在20-28℃之间，需根据温度调整pH值。
）??盐酸溶液：/L，加L盐酸到700ml水中，用水定容至1L。
?5.?操作方法?.?样品制备：?（1）?固体样品：如果样品粒度＞，研磨后过（40-60目）筛。
?（2）?高脂肪样品：如果脂肪含量＞10%，用石油醚去脂。
每克样品用25ml，每次提取完静置一会儿再小心将烧杯倾斜，慢慢将石油醚倒出，共洗三次。
?（3）?高碳水化合物样品：如果样品干重含糖＞50%，用85%乙醇去除糖份，每克样品每次10ml，共洗三次轻轻倒出，然后在40℃烘箱中不时翻搅干燥过夜，并研磨过筛。
?.?样品消化?（1）?准确称取双份±样品（M1和M2），置于高脚烧杯中。
?（2）?在每个烧杯中加入40ml?MES-TRIS缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌直到样品完全分散。
（防止团块形成，使受试物与酶能充分接触）。
?（3）?用热稳定的淀粉酶进行酶解处理：加100μl热稳定的淀粉酶溶液，低速搅拌。
用铝箔片将烧杯盖住，在95-100℃水浴中反应30分钟。
（?起始的水浴温度应达到95℃）。
? （4）?冷却：所有烧杯从水浴中移出，凉至60℃。
打开铝箔盖，用刮勺将烧杯边缘的网状物以及烧杯底部的胶状物刮离，以使样品能够完全的酶解。
用10ml蒸馏水冲洗烧杯壁和刮勺。
?（5）?用蛋白酶进行酶解处理：在每个烧杯中各加入100μl蛋白酶溶液。
用铝箔盖住，在60℃持续摇动反应30分钟（开始时的水浴温度应达60℃），使之充分反应。
?（6）?pH值测定：30分钟后，打开铝箔盖，搅拌中加入L?HCL至烧杯中。
60℃时用1mol/L?NaOH 溶液或1mol/L?HCL溶液调最终pH为。
（注意：当溶液为60℃时检测和调整pH，因为在较低温度时pH会偏高。
）?（7）?用淀粉葡糖苷酶溶液酶解处理：搅拌同时加100μl淀粉葡糖苷酶溶液。
用铝箔盖住，在60℃持续振摇反应30分钟，温度应恒定在60℃。
??测定?5.3.1.总的膳食纤维测定?（1）?用乙醇沉淀膳食纤维：在每份样品中，加入预热至60℃的95%乙醇225ml，乙醇与样品的体积比为4∶1。
?室温下沉淀1小时。
?（2）?过滤装置：用15ml78%乙醇将硅藻土湿润和重新分布在已称重的坩埚中。
用适度的抽力把坩埚中的硅藻土吸到玻板上。
?（3）?酶解过滤，用78%乙醇和刮勺转移所有内容物微粒到坩埚中。
（注意：如果一些样品形成胶质，用刮勺破坏表面，以加速过滤。
）?（4）?抽真空，分别用15ml的78%乙醇，95%乙醇和丙酮冲洗残渣各2次，将坩埚内的残渣抽干后在105℃烘干过夜。
将坩埚置干燥器中冷却至室温。
坩埚重量，包括膳食纤维残渣和硅藻土，精确称至。
减去坩埚和硅藻土的干重，计算残渣重。
?（5）?蛋白质和灰分的测定:取成对的样品中的一份测定蛋白质，用?本书前述或方法测定。
用（N×作为蛋白质的转换系数）。
?分析灰分时用平行样的第二份在525℃灼烧5小时，在干燥器中冷却，精确称至，减去坩埚和硅藻土的重量，即为灰分重量。
??.不溶性膳食纤维测定：?（1）?称适量样品按进行酶解，过滤前用3ml水湿润和重新分布硅藻土在预先处理好的坩埚上，保持抽气使坩埚中的硅藻土抽成均匀的一层。
?（2）?过滤并冲洗烧杯，用10ml70℃水洗残渣2次，然后再过滤并用水洗，转移到600ml 高脚烧杯，保留用以测定可溶性膳食纤维，按。
?（3）?用抽滤装置，分别用15ml78%乙醇，95%乙醇和丙酮各冲洗残渣2次。
?（注意：应及时用78%乙醇、95%乙醇和丙酮冲洗残渣否则可造成不溶性膳食纤维数值的增大。
）?（4）按用双份样品测定蛋白质和灰分。
?可溶性膳食纤维测定：?（1）?将不溶性膳食纤维过滤后的滤液收集到600ml高脚烧杯中，对比烧杯和滤过液，估计容积。
?（2）?加约滤出液4倍量已预热至60℃的95%乙醇。
或者将滤液和洗过残渣的蒸馏水的混合液调至80g，再加入预热至60℃的95%乙醇320ml。
?（3）?室温下沉淀1小时。
下面按测定总膳食纤维，从"湿润和重新分布硅藻土……"。
?6.?计算?TDF、IDF、SDF均用同一公式计算?膳食纤维（DF，g/100g）测定：?DF={[（R1+R2）/2]-P-A}/[（M1+M2）/2]×100?式中：R1和R2=双份样品残留物重量（mg）?P和A=分别为蛋白质和灰分重量（mg）?M1和M2=样品重量（mg）。
